01遇見/摘要磷酸吡哆醛

(Pyridoxal5′-phosphate,PLP)

依賴酶可催化多種化學(xué)反應(yīng)，比如轉(zhuǎn)氨、脫羧、外消旋、差向異構(gòu)、[3+2]

環(huán)化

、β/γ

消除或置換、羥醛加成

、克萊森縮合

以及

O2

依賴的氧化反應(yīng)等等。PLP依賴酶之所以能發(fā)揮多種催化功能，主要是因?yàn)槠漭o因子PLP可以充當(dāng)電子阱穩(wěn)定不同類型的反應(yīng)活性中間體，從而保證后續(xù)的轉(zhuǎn)化持續(xù)穩(wěn)定的進(jìn)行。相比于傳統(tǒng)的化學(xué)合成，在化學(xué)區(qū)域選擇和立體選擇上，PLP依賴酶有著顯著的優(yōu)勢(shì)。因此作為生物催化劑，PLP酶在天然產(chǎn)物生物合成以及非天然氨基酸和手性胺藥物的不對(duì)稱合成中發(fā)揮重要作用?；趯?duì)

PLP

酶學(xué)機(jī)制的理解，理論上，PLP酶可催化曼尼希類型（Mannich-type）的反應(yīng)，其催化機(jī)制與蘇氨酸醛縮酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶這類

Cα-烷基化

PLP酶相似（圖1）。

此外，受生物啟發(fā)開發(fā)的吡哆醛有機(jī)催化劑，

可催化不對(duì)稱Mannich反應(yīng)以制備

α,β-二氨基酸，也為Mannich酶促反應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)。但迄今為止，催化Mannich

反應(yīng)的PLP依賴酶未曾有過(guò)報(bào)道。在這里，在雙吡咯烷生物堿Loline的生物合成途徑中，報(bào)道了PLP依賴的Mannich環(huán)化酶LolT。他們不僅證明了LolT是催化吡咯里西啶（pyrrolizidine）核心環(huán)的關(guān)鍵，而且還發(fā)現(xiàn)LolT

能立體選擇性的催化合成具有鄰位季-三級(jí)立構(gòu)中心的氮雜雙環(huán)手性α-氨基酸。

此外，他們確定了LolT

的X-ray

晶體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合點(diǎn)突變、計(jì)算機(jī)模擬等策略，

解析了LolT催化的分子機(jī)制。

02遇見/內(nèi)容吡咯里西啶（Pyrrolizidine）類生物堿Loline由內(nèi)生真菌產(chǎn)生，且具有良好的殺蟲活性。Loline的生物合成基因簇以及部分生物合成途徑已經(jīng)被報(bào)道，但其核心pyrrolizidine環(huán)的構(gòu)筑并未解析。早期研究人員通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明最小基因組(lolDFT)

參與pyrrolizidine環(huán)的形成，但具體基因編碼的酶功能尚不清楚。課題組結(jié)合生物信息學(xué)分析以及逆合成分析，初步提出可能的pyrrolizidine雜環(huán)生物合成途徑：加氧酶

LolF

可以催化氧化脫羧作用，將

1

轉(zhuǎn)化為環(huán)亞胺中間體2；

其余兩種

PLP

依賴酶（LolT

和

LolD）經(jīng)脫羧和環(huán)化進(jìn)一步將

2

轉(zhuǎn)化為所需的吡咯里西啶雜環(huán)（圖2a）。為了驗(yàn)證這一假設(shè)并闡明吡咯里西啶環(huán)形成的生物合成機(jī)制，作者對(duì)加氧酶

LolF、PLP

依賴酶LolT

及

LolD進(jìn)行功能表征。由于LolF經(jīng)多次嘗試未獲得可溶性蛋白，決定化學(xué)合成其推測(cè)的LolF作用產(chǎn)生的可能的亞胺中間體2，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證PLP

依賴酶LolT

和

LolD的功能。他們通過(guò)體外活性實(shí)驗(yàn)證明化合物

2

可被LolT轉(zhuǎn)化的平衡混合物轉(zhuǎn)化為分子量相同的單一產(chǎn)物

3。隨后利用放大酶促反應(yīng)成功制備并分離化合物

3，并結(jié)合NMR以及X

射線晶體確定化合物3為反式吡咯里西啶α-季銨鹽氨基酸。進(jìn)一步通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)中證明LolD

可催化化合物3脫羧形成構(gòu)型保留的產(chǎn)物4

。以上結(jié)果表明

LolT

是一種

PLP

依賴酶，可催化類Mannich反應(yīng)，而

LolD

是一種

PLP

依賴脫羧酶，作用于季

α-氨基酸。他們利用DFT證明LolT能夠立體控制Mannich環(huán)化反應(yīng)，且生成的3

是動(dòng)力學(xué)產(chǎn)物。通過(guò)測(cè)試LolT

的底物范圍，證明LolT不僅可以耐受環(huán)從

5

到

7（即

B

環(huán)）的不同環(huán)亞胺，而且還可以催化

6-

和

7-endo

環(huán)化（B

環(huán)大小限于

5）。

而每種反應(yīng)底物，僅觀察到一種立體異構(gòu)產(chǎn)物，表明每個(gè)環(huán)化都是由

LolT

控制的對(duì)映體和非對(duì)映體。此外，他們測(cè)定LolT動(dòng)力學(xué)參數(shù)，提出可能是由于空間效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致LolT對(duì)擴(kuò)大的

A

環(huán)底物的催化效率降低。以上結(jié)果均表明LolT是多功能的Mannich環(huán)化酶。為了進(jìn)一步在分子水平上闡明LolT的功能，他們解析了LolT的晶體結(jié)構(gòu)。由于未獲得

LolT的共晶結(jié)構(gòu)，他們通過(guò)分子對(duì)接，找出LolT作用的可能關(guān)鍵殘基，并結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上活性位點(diǎn)殘基的作用（圖5a），提出

LolT

的催化機(jī)制（圖

5b）。

在形成外部醛亞胺后，Cα–H

的

pKa

降低，位于

PLP

的

si

面的

K236

作為一般堿基，使

L-構(gòu)型的

α-氨基酸立體特異性去質(zhì)子化，形成

Cα-碳負(fù)離子（醌類中間體），

然后攻擊亞胺基團(tuán)的

si

面，同時(shí)在

Cα

處發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)。最后他們對(duì)LolT進(jìn)行功能拓展。他們推測(cè)

LolT

可能會(huì)激活底物類似物2,4-二氨基丁酸

(Dab)

，并形成碳負(fù)離子，但不能進(jìn)行后續(xù)的Mannich環(huán)化反應(yīng)。他們利用H/D

交換實(shí)驗(yàn)證明了這一猜測(cè)。此外LolT對(duì)于其他的二氨基酸也觀察類似現(xiàn)象。因此他們?cè)O(shè)想如果使用各種醛和二氨基酸通過(guò)自發(fā)縮合而原位產(chǎn)生亞胺，而生成的亞胺則可以攔截碳負(fù)離子進(jìn)而發(fā)生Mannich

環(huán)化反應(yīng)。他們通過(guò)體外生化實(shí)驗(yàn)證明：LolT

以L-Dab

作為負(fù)碳離子供體，可廣泛的接受醛類，其中并在亞胺形成后催化相應(yīng)的

5-endoMannich

環(huán)化，得到吡咯烷季

α-氨基酸（圖6b）。但以

L-鳥氨酸為負(fù)碳離子供體時(shí)，醛底物范圍變窄。而對(duì)于L-賴氨酸作為氨基酸供體時(shí)，不能發(fā)生曼尼希環(huán)化反應(yīng)。以上結(jié)果表明他們成功擴(kuò)展了

LolT

的應(yīng)用，并以催化正式的雙組分Mannich環(huán)化反應(yīng)，獲取各種帶有鄰位三級(jí)和四級(jí)立體中心基于吡咯烷和哌啶的季

α-氨基酸?？偨Y(jié)在Loline生物堿的生物合成途徑中，鑒定PLP

依賴的Mannich環(huán)化酶

LolT，并證明LolT在立體選擇性合成多種