1《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測(cè)-液相色譜法》編制說明二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容（求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)2一、標(biāo)準(zhǔn)工作簡(jiǎn)況維蘭特羅是葛蘭素史克公司研發(fā)的新型β2-受體激動(dòng)劑，具有起效快、作用時(shí)間持久等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)β2-受體的親合力較對(duì)β1-受體和β3-受體高1000倍，具有高度選擇性，可作為多款上市藥品如蕪地溴銨的原料藥或有效成分進(jìn)行使用，具有廣闊的需求市場(chǎng)。原料藥需要確定合適的手性異構(gòu)體檢測(cè)技術(shù)方法與檢測(cè)條件來落實(shí)和確認(rèn)質(zhì)量的合格廣東萊佛士制藥公司通過創(chuàng)新的合成工藝實(shí)現(xiàn)了維蘭特羅的高效綠色制造，并提供給藥品生產(chǎn)企業(yè)用于藥品生產(chǎn)。萊佛士公司根據(jù)原料藥質(zhì)量和中國(guó)藥典的指導(dǎo)原則建立了維蘭特羅質(zhì)量和檢測(cè)方法的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。由于目前國(guó)內(nèi)圍繞維蘭特羅藥物已經(jīng)構(gòu)成了原料藥生產(chǎn)、原料藥市場(chǎng)交易和藥品生產(chǎn)的團(tuán)體，急需對(duì)維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)方法進(jìn)行深入研究，并將維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)方法企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)上升為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，使之成為團(tuán)體共同使用可以互相驗(yàn)證互相承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)于藥物綠色制造和藥品市維蘭特羅有一個(gè)手性中心，存在兩種手性異構(gòu)體，分別是R型維蘭特羅和S型維蘭特羅。R型維蘭特羅作為藥劑原材料，發(fā)揮出治療的效果。S型維蘭特羅為合成路線圖1維蘭特羅手性異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)示意圖左）(R)-VL、（右）(S)-VL3關(guān)于維蘭特羅的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外僅有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)有研究報(bào)道，均采用高效液相色譜法進(jìn)行樣品分離，檢測(cè)手段有紫外、熒光和質(zhì)譜[1-5]。Yaju分離維蘭特羅對(duì)映體，在ChiralpakID柱上使用正己烷-乙醇-乙醇胺(75:25:0.1,v/v/v)作為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，對(duì)映體分離度達(dá)到3.3，(R)‐維蘭特羅檢出限為0.30μg/mL，線性范圍為3-30μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9998，方法回收率在98.5-101.7%之間，方法精密度較高。Chundela等[7]采用高效液相色譜-質(zhì)譜分離檢測(cè)維蘭特羅，在ZorbaxEclipseXDB-C8色譜柱和ZorbaxEclipseXDB-C8柱上進(jìn)行分離。流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸(95:5,v/v)，方法檢出限(LOD)為2pg/mL。對(duì)于維蘭特羅原料藥質(zhì)量檢測(cè)方法而言，由于其純度高，相對(duì)于檢測(cè)方法靈敏度而言，更重要的是方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性及設(shè)備的通用性、普及性，因此采用高效液相色譜加紫外檢測(cè)作為維蘭特羅的由于目前國(guó)內(nèi)圍繞維蘭特羅藥物已經(jīng)構(gòu)成了原料藥生產(chǎn)、原料藥市場(chǎng)交易和藥品生產(chǎn)的團(tuán)體，急需對(duì)維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)方法進(jìn)行深入研究，并將維蘭特羅檢測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)于2022年由廣東省藥學(xué)會(huì)藥物手性專業(yè)委員會(huì)提出，廣東省藥學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)歸口，在廣東省藥學(xué)會(huì)藥物手性專業(yè)委員會(huì)組織下，由廣東萊佛士制藥技術(shù)2022年*月*日，廣東省藥學(xué)會(huì)藥物手生化技術(shù)有限公司三家單位發(fā)起《維蘭特羅手性異構(gòu)體4并批準(zhǔn)立項(xiàng)。標(biāo)委會(huì)提出該團(tuán)標(biāo)補(bǔ)充了現(xiàn)行技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的不足，對(duì)學(xué)科發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用，檢測(cè)方法具有一定的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的安全性有指導(dǎo)意義，并要求起草單位按照《廣東省藥學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法(試行)》有關(guān)要求，嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量關(guān),切實(shí)提高標(biāo)準(zhǔn)制定的質(zhì)量和水平，增加標(biāo)準(zhǔn)的適用性和實(shí)效性，按期完成標(biāo)準(zhǔn)編制2023年6月25日，項(xiàng)目主持單位組織專家成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，并負(fù)責(zé)編制起草工作，確定標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容，制定了工作計(jì)劃，安排相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并組2024年*月*日，起草小組擬定了《維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測(cè)-液作組討論初稿）和編制說明。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)工作組召開會(huì)議，針對(duì)該討論稿進(jìn)行討論，提2024年*月*日，按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)起草工作會(huì)討論意見，整理并確定了相關(guān)特征性理在廣泛的調(diào)查研究和必要的試驗(yàn)驗(yàn)證的工作基礎(chǔ)上，根據(jù)GB/T1.1工作導(dǎo)則第一部份：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》及GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫第四部5二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜法測(cè)定維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑本標(biāo)準(zhǔn)采用手性固定相-高效液相色譜（CPS-HPLC）方法對(duì)較高純度的維蘭特羅標(biāo)準(zhǔn)品或原料分析。適用于合成的維蘭特羅原料或?qū)φ掌返鹊氖中援悩?gòu)體的種類判定和含量的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)的編寫制定過程以提高測(cè)試方法選擇性、精密度、靈敏度、準(zhǔn)目前，市場(chǎng)上的維蘭特羅(Velanterol,VL)原料主要來源于工業(yè)合成，通常是(S)-VL期研究、廣泛調(diào)研和驗(yàn)證基礎(chǔ)上的考慮，結(jié)合實(shí)際，建立合理的維蘭特羅手性異構(gòu)體本標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)純度較高（純度≥98%）的維蘭特羅標(biāo)準(zhǔn)品或原料產(chǎn)品制定，采用高效液相方法，檢測(cè)識(shí)別這類高純度產(chǎn)品的異構(gòu)體判定和對(duì)映體過量或分配，標(biāo)準(zhǔn)名稱采用高效液相色譜法，在選定的工作條件下，通過手性色譜柱對(duì)樣品中(R)-VL和在現(xiàn)有文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)維蘭特羅的液相分析方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，該方法液相色譜儀進(jìn)行定性測(cè)定，在試驗(yàn)條件下注入適量(S)-VL和(R)-VL參比物質(zhì)來測(cè)6在試驗(yàn)條件下對(duì)樣品進(jìn)行定性測(cè)定，如果檢出樣品中(S)-VL或(R)-VL色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，且該物質(zhì)的紫外吸收譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收譜圖一致，則可xi=··································（1）Xi-------試樣中被測(cè)組分的含量，單位為g/g；在重復(fù)條件下，取兩次獨(dú)立測(cè)定的算術(shù)平均值作為結(jié)果，其絕對(duì)差值不得超過算取(S)-VL對(duì)照品20mg、(R)-VL對(duì)照品20mg，精密稱定，分別置于20mL量瓶中，乙醇稀釋至刻度，分別配成約1mg/mL的(S)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和約1mg/mL的取(S)-VL對(duì)照品20mg、(R)-VL對(duì)照品20mg，精密稱定，置于同一20mL量瓶7精密量取(R)-VL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見4.1.1）一定體積，置于10mL量瓶中，精密量取(R)-VL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見4.1.1）200μL，置于10mL量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見4.1.1）200μL，置于10mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，配成每精密量取(R)-VL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見4.1.1）200μL，置于20mL量瓶中，加精密量取(R)-VL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（見4.1.1）0.2mL、0.5mL、0.6mL，分別置于10mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，配制成0.02mg/mL（40%濃度）、0.05mg/mL（100%濃度）、0.06mg/mL（120%濃度）三個(gè)濃度的維蘭特羅溶液，按照色譜50%(R)-VL和50%(S)-VL的準(zhǔn)確度溶液的配制：取上8精密量取(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液100μL，分別置取供試品約20mg，精密稱定，置于20mL量瓶，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備溶液。精密量取供試品儲(chǔ)備溶液100μL，置于10mL量瓶中，加入乙按高效液相色譜操作規(guī)程開機(jī)預(yù)熱，調(diào)節(jié)溫度及流量，達(dá)到分析條件并基線平穩(wěn)表1色譜柱和典型色譜操作條件色譜柱纖維素三-（4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠為填充劑（Phenomenex，LuxCellulose-44.6mm×250mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）流動(dòng)相正己烷:乙醇:二乙胺:三氟乙酸=800:200:0.5:1(v/v)，等度洗脫柱溫30℃流速1mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)230nm進(jìn)樣量25μL運(yùn)行時(shí)間20min將上述系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液按色譜條件（見4.1.3）進(jìn)行測(cè)定，以樣品峰面積為y9將樣品溶液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，由色譜峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)的(R)-VL的濃度。樣品溶液中被測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測(cè)定按以上步驟，對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定，以算術(shù)平均值作為結(jié)果，其絕對(duì)差（1）高效液相色譜儀：配二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD）或紫外檢測(cè)器（UV其靈敏度（2）色譜柱：纖維素三-（4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠填充劑色譜柱（Phenom-三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果；表2《維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)液相色譜法》驗(yàn)證結(jié)果概要項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果專屬性空白溶液應(yīng)不干擾(S)-VL和(R)-VL的檢查；空白溶劑對(duì)(S)-VL和(R)-VL不產(chǎn)生干擾。系統(tǒng)適用性(S)-VL和(R)-VL的分離度應(yīng)符合要求，Rs≥1.5；在此系統(tǒng)條件下(R)-VL和(S)-VL的分離度為2.69，表明在該液相色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)符合含量測(cè)定要求，且方法精密度良好。定量限要求信噪比S/N≈10時(shí)的檢測(cè)濃度，證明方法具有足夠低的定量檢測(cè)能力；所測(cè)三份溶液的主成分保留時(shí)間RSD≤2.0%，峰面積≤5.0%。在本色譜條件下，信噪比約為10時(shí)，(R)-VL進(jìn)樣濃度為0.5μg/mL。線性和范圍在0.005~1.000mg/mL范圍內(nèi)，線性方程的相關(guān)系數(shù)≥0.990，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的25％以內(nèi)，響應(yīng)因子的RSD應(yīng)不大于10%。(R)-VL、(S)-VL峰面積與濃度線性關(guān)系良好。在0.005-0.100mg/mL范圍內(nèi)，(R)-VL含量線性關(guān)系良好，回歸方程y=0.92x–0.014，R2=0.9998，響應(yīng)因子RSD為0.93%；(S)-VL含量線性關(guān)系良好，回歸方程y=0.78x–0.53,R2=0.9995，響應(yīng)因子RSD為2.27%。準(zhǔn)確度回收率應(yīng)為80%~120%由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，(R)-VL、(S)-VL的方法準(zhǔn)確度良好。(R)-VL的回收率為95.39%-107.40%，平均回收率為100.9%，RSD為4.22%，方法準(zhǔn)104.2%，RSD為4.53%，方法準(zhǔn)確度良好。精密度系統(tǒng)精密度配制3種不同濃度精密度溶液，每個(gè)濃度制備三份進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照溶液中的各成分峰面積RSD≤2.0%，保留時(shí)間RSD≤2.0%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本法的系統(tǒng)精密度和日內(nèi)精密度良好。系統(tǒng)精密度考察中，(R)-VL、(S)-VL在0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL三個(gè)濃度時(shí)，峰面積和保留時(shí)間RSD均小于2%。日間精密度考察中，連續(xù)3天考察(R)-VL、(S)-VL三個(gè)濃度保留時(shí)間的RSD均小于5%，峰面積的RSD小于5%。密度同一分析人員連續(xù)三天用同一儀器檢查系統(tǒng)精密度的3個(gè)濃度，各成分峰RSD≤5.0%。重復(fù)性取供試品稱樣6份，(R)-VL檢測(cè)結(jié)果的RSD小于2%。上述結(jié)果顯示，在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同儀器設(shè)備，按相同的前處理方法和測(cè)試方法對(duì)供試品進(jìn)行了6次測(cè)定，供試品中(R)-VL測(cè)定結(jié)果的RSD為0.61%，小于2%，說明該方法的重復(fù)性良好。耐用性檢測(cè)方法的色譜條件發(fā)生微小變化時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液中的(S)-VL和(R)-VL分離度Rs≥1.5，不同參數(shù)的獲得的峰面積的RSD＜10%；當(dāng)調(diào)節(jié)TFA含量比例變化±0.5%、柱溫變化25~35℃時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液中維蘭特羅手性異構(gòu)體的峰面積RSD小于5%。當(dāng)流動(dòng)相比例變化±2%時(shí)，分離度和峰面積檢出量差異不大，但保留時(shí)間RSD＞20%，說明溶劑比例對(duì)樣品的保留時(shí)間非常敏感。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)變化±5nm、流定，峰面積檢出量差異較大。因此在色譜條件中，應(yīng)注意控制流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長(zhǎng)和流速；穩(wěn)定性(R)-VL、(S)-VL對(duì)照品溶液在常溫及冷藏條件下放置一段時(shí)間后，峰面積百分含量的RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）≤5.0%。(R)-VL、(S)-VL在0-9h內(nèi)的常溫穩(wěn)定性考察中，面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，線性回歸方差分析顯示0.01＜P＜0.05，具有顯著性差異；在0-7天的4℃保存條件下考察，(R)-VL、(S)-VL的應(yīng)穩(wěn)定性較好（RSD≤2%回歸不顯著（對(duì)于95%置信水平，P＞0.05）。說明0-7天的4℃保存條件下，(R)-VL、(S)-VL具有較好的穩(wěn)定性；結(jié)論經(jīng)過對(duì)(R)-VL和(S)-VL檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，方法的準(zhǔn)確度高、靈敏度及精密度良好，適用于維蘭特羅手性異構(gòu)體的檢測(cè)。進(jìn)行空白溶劑干擾實(shí)驗(yàn)，取乙醇空白溶液、0.01mmg/mL(R)-VL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，按液相色譜條件（見圖1專屬性實(shí)驗(yàn)液相色譜圖：(a)(R)-VL；(b)(S)-VL；(c)空白溶液結(jié)論：空白溶劑對(duì)(S)-VL和(R)-VL不產(chǎn)生干擾。取系統(tǒng)適用性溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.5項(xiàng)按表3系統(tǒng)適用性參數(shù)樣品名稱保留時(shí)間/min理論塔板數(shù)/N拖尾因子/T分離度/Rs(R)-VL(S)-VL2.69圖2系統(tǒng)適用性液相色譜圖結(jié)論：在此系統(tǒng)條件下(R)-VL的保留時(shí)間分別為12.29min；(R)-VL的理論塔板數(shù)取定量限溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.6項(xiàng)）按色譜條表4維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限樣品濃度(mg/mL)信噪比保留時(shí)間/min平均保留保留時(shí)間RSD（%）峰面積(×104mAU)平均峰面積峰面積RSD(R)-VL0.00050.4344294258418642912.91表5維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限樣品濃度(mg/mL)信噪比保留時(shí)間/min平均保留保留時(shí)間RSD（%）峰面積(×104mAU)平均峰面積峰面積RSD(S)-VL0.00050.2236783659369836780.53圖3維蘭特羅手性異構(gòu)體的定量限液相色譜圖：(a)(R)-VL、(b)(S)-VL；結(jié)論：在本色譜條件下，信噪比約為10時(shí)，(R)-VL、(S)-VL進(jìn)樣濃度為0.0005取標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.3項(xiàng)）按色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行測(cè)定。以樣品峰面積為y軸、對(duì)應(yīng)的樣品濃度為x軸，進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)，見表6、表7，含量線性關(guān)系圖見圖4、圖表6(R)-VL線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)液編號(hào)12345678C(R)-VL(mg/L)520405060峰面積(×104)4.489.2537.2345.6655.6375.0690.864.579.0436.8745.8355.1274.3192.22平均峰面積4.539.1537.0545.7555.3874.6991.54響應(yīng)因子90609150915592629150923093369154響應(yīng)因子RSD（%）0.93Y軸截距/100%響應(yīng)值（%）0.03線性方程y=0.92x–0.014相關(guān)系數(shù)0.9998表7(S)-VL線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)液編號(hào)12345678C(R)-VL(mg/L)520405060峰面積(×104)3.637.6730.0237.7845.2161.3777.493.607.6031.1336.3445.9862.0678.04平均峰面積3.627.6430.5637.0645.6061.7277.76響應(yīng)因子72407640757576407412760077157776響應(yīng)因子RSD（%）2.27Y軸截距/100%響應(yīng)值（%）線性方程y=0.78x-0.53相關(guān)系數(shù)0.9995圖4(R)-VL、(S)-VL的含量線性關(guān)系圖圖5(R)-VL、(S)-VL的含量線性關(guān)系色譜圖(R)-VL的含量線性關(guān)系良好，回歸方程y=0.92x-0.014，R2=0.9998,響應(yīng)因子RSD為各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按公式（2）進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表表8(R)-VL、(S)-VL準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果(R)-VL濃度檢出量（mg)投入量（mg)回收率平均回收率（%）RSD1231231230.00810.00830.00790.0850.0860.0830.1480.1450.1470.0080.0800.152103.898.75106.3107.4101.497.3795.3996.714.22(S)-VL濃度檢出量（mg)投入量（mg)回收率平均回收率（%）RSD1231231230.00890.00850.00880.0830.0810.0830.1500.1510.1530.0080.0800.152106.3110.0104.2101.4104.298.6899.49100.94.53結(jié)論：由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，(R)-VL、(S)-VL的方法準(zhǔn)確度良好取精密度溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.7項(xiàng)）按色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行測(cè)定，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，考察日內(nèi)精密度，以及連續(xù)3天分別表9維蘭特羅手性異構(gòu)體的日內(nèi)、日間精密度(mean±SD，n=3)樣品濃度(mg/mL)tR(min）(n=3)A(×104mAU)(n=3)日內(nèi)精密度RSD(%)日間精密度RSD(n=6)第一天第二天第三天tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)0.211.89±0.2218.72±0.230.150.830.070.10(R)-VL0.511.89±0.3846.56±0.220.060.390.050.460.090.560.450.611.90±0.2456.34±0.350.050.600.060.550.180.440.55樣品濃度(mg/mL)tR(min）(n=3)A(×104mAU)(n=3)日內(nèi)精密度RSD(%)日間精密度RSD(n=6)第一天第二天第三天tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)tR(%)A(%)0.214.05±0.2515.61±0.240.070.150.870.05(S)-VL0.514.04±0.2736.86±0.170.050.470.070.380.140.860.410.614.06±0.2246.10±0.470.110.730.050.230.580.89結(jié)論：由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本法的日間精密度和日內(nèi)精密度良好。日間精密度考察中，(R)-VL在0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.06mgRSD均小于2%。在日間精密度考察中，連續(xù)3天考察(R)-VL三個(gè)濃度保留時(shí)間RSD依照供試品溶液制備方法（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.10項(xiàng)），制備六份供試品溶液，按色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定，記錄色譜表10(R)-VL重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g)平均值RSD(%)10.76020.76230.7660.7600.6140.76250.75560.754結(jié)論：上述結(jié)果顯示，在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同儀器設(shè)備，按相同取供系統(tǒng)適用性溶液，考察液相色譜條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)（流動(dòng)相比率、流速、柱表11維蘭特羅手性異構(gòu)體耐用性試驗(yàn)方案耐用性研究項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方法條件確認(rèn)耐用性范圍考察指標(biāo)檢測(cè)波長(zhǎng)(nm)230檢測(cè)波長(zhǎng)變化±5nmTFA含量比例(%)0.10TFA含量比例變化±0.5%峰面積（A）柱溫(℃)30溫度變化±5℃保留時(shí)間(tR)理論塔板數(shù)(N)流動(dòng)相比例(%)800:200流動(dòng)相比例變化±2%拖尾因子(T)流速(mL/min)流速變化±0.1mL/min調(diào)節(jié)高效液相色譜儀的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別為225nm、230nm、235nm，測(cè)試系統(tǒng)適表12維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)—檢測(cè)波長(zhǎng)變化色譜數(shù)據(jù)檢測(cè)波長(zhǎng)變化tR/minA/×104mAUNTRS(R)-VL225nm3382230nm9.453379235nm4.743458RSD(%)0.133.10(S)-VL225nm35932.50230nm7.6336260.972.53235nm3.6236712.52RSD(%)0.073.430.61圖6維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)—檢測(cè)波長(zhǎng)變化液相色譜圖時(shí)間、拖尾因子、理論塔板數(shù)變化比較小，RSD<5%，符合規(guī)定；但是對(duì)峰面積大小分別配制TFA含量為0.05%、0.10%、0.15%的色譜流動(dòng)相，脫氣，測(cè)試系統(tǒng)適用表13維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——TFA比例變化色譜數(shù)據(jù)TFA含量變化tR/minA/×104mAUNTRS(R)-VL0.05%30730.10%9.4533790.15%9.4233390RSD(%)3.925.102.54(S)-VL0.05%7.9533612.330.10%7.3636760.972.530.15%7.5136520.972.53RSD(%)2.144.034.923.504.69圖7維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)—TFA比例變化色譜圖由表13和色譜圖可知，當(dāng)TFA含量比例調(diào)整量在±0.05%范圍內(nèi)變動(dòng)，峰面積、保留時(shí)間、拖尾因子、理論塔板數(shù)較小，RSD大約在5%左右，綜上說明TFA含量變表14維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——柱溫變化色譜數(shù)據(jù)柱溫變化tR/minA/NTRS(R)-VL25℃9.4430860.9730℃9.45337935℃9.323326RSD(%)2.680.774.785.65(S)-VL25℃7.5633810.982.5130℃7.6336760.972.5335℃7.3737352.40RSD(%)3.435.276.022.82圖8維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——柱溫變化色譜圖很小，RSD＜5%；對(duì)理論拖尾因子、塔板數(shù)有一定的影響，RSD＜8%，在25~35℃范780:220:0.5:1(v/v)、800:200:0.5:1(v/v)、820:180:0.5:1(v/v)進(jìn)行測(cè)試，記錄色譜圖（見表15維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——流動(dòng)相比例變化色譜數(shù)據(jù)流動(dòng)相比例變化tR/minA/×104mAUNTRS(R)-VL780:220:0.5:1800:200:0.5:1820:180:0.5:1RSD(%)9.939.459.672.483713337936424.921.061.050.94(S)-VL780:220:0.5:17.6037132.24800:200:0.5:17.6336260.972.53820:180:0.5:17.3640172.82RSD(%)23.005.425.06圖9維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——流動(dòng)相比例變化色譜由上表15和色譜圖可知，當(dāng)流動(dòng)相調(diào)整量在±2%范圍內(nèi)變動(dòng)，(R)-VL的峰面積變化很小，RSD＜2%；拖尾因子、理論塔板數(shù)有一定的變化，RSD＜10%；保留時(shí)間差維蘭特羅的保留時(shí)間減小，同時(shí)理論塔板數(shù)和分離度也在不斷減小，綜合考慮柱效和調(diào)節(jié)流速為0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min，測(cè)試系統(tǒng)適用表14維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)——流速變化色譜數(shù)據(jù)流速變化(mL/min)tR/minA/×104mAUNTRS(R)-VL0.934929.4533799.383093RSD(%)8.666.190.95(S)-VL0.98.8237242.537.6336260.972.537.1933940.982.40RSD(%)4.733.243.02圖10維蘭特羅含量檢測(cè)耐用性實(shí)驗(yàn)—流速變化色譜由表16和色譜圖可知，當(dāng)流速調(diào)整量在±0.1mL/min范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，取穩(wěn)定性溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.9項(xiàng)分別考色譜圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表17。另外考察樣品溶液在4℃的穩(wěn)定性情況，放置0~7天，每分析表對(duì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將顯著性（P值）與顯著性水平α（0.01、表17維蘭特羅手性異構(gòu)體常溫穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間（h）峰面積(×104mAU）(R)-VL09.3239.1469.0799.05平均值9.15RSD(%)表18維蘭特羅手性異構(gòu)體常溫穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間（h）峰面積(×104mAU）(S)-VL07.6137.5667.4197.23平均值7.45RSD(%)2.29*對(duì)于95%置信水平，0.01＜P＜0.05，具顯著性差異；由表17、18知，(R)-VL在0-9h內(nèi)的常溫穩(wěn)定性考察中，面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，線性回歸方差分析顯示0.01＜P＜0.05，具有顯著性差異；(S)-VL在0-9h內(nèi)的常溫穩(wěn)定性考察中，面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜3%，線性回歸方差分析顯示0.01表19維蘭特羅手性異構(gòu)體4℃穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間(天)峰面積(×104mAU）(R)-VL19.0229.0739.3349.3159.3669.2779.24平均值9.23RSD(%)表20維蘭特羅手性異構(gòu)體4℃穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)間(天)峰面積(×104mAU）(S)-VL17.4727.6137.564567平均值RSD(%)7.587.627.317.747.561.79較好（RSD≤2%），回歸不顯著（對(duì)于95%置信水平取供試品溶液（見二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.10項(xiàng)按照色譜條件（見4.2.1）進(jìn)行測(cè)定，并按照標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程計(jì)算試驗(yàn)樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，檢測(cè)表21(R)-VL含量測(cè)定結(jié)果樣品批號(hào)樣品1樣品2含量0.7540.670為進(jìn)一步確證《維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)液相色譜法》的檢測(cè)方法能夠在其他實(shí)同操作人員使用不同的儀器，對(duì)樣品1平行測(cè)定6次，分別計(jì)算(R)-VL、(S)-VL的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等各項(xiàng)參數(shù)，對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證。各單位檢測(cè)結(jié)果概表22各單位檢測(cè)結(jié)果概要項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果系統(tǒng)適用性和儀器精密度試驗(yàn)由3家實(shí)驗(yàn)室分別取系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣六次，對(duì)照溶液中的各成分峰面積RSD≤2.0%，保留時(shí)間RSD≤2.0%。(S)-VL和(R)-VL的分離度應(yīng)符合要求，Rs≥1.5。在此系統(tǒng)條件下，三個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)(R)-VL、(S)-VL保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子的重現(xiàn)性和精密度，保留時(shí)間RSD均小于1%，峰面積RSD小于2%，Rs≥2.5。表明在該液相色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)符合含量測(cè)定要求，且方法精密度良好。線性和范圍3家實(shí)驗(yàn)室在0.005~1.000mg/mL范圍內(nèi)，線性方程的相關(guān)系數(shù)≥0.990，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的25％以內(nèi)，響應(yīng)因子的RSD應(yīng)不大于10%。對(duì)于(R)-VL、(S)-VL標(biāo)準(zhǔn)曲線，三家家實(shí)驗(yàn)室在0.005~1.000mg/mL范圍內(nèi)含≥0.993，Y軸截距/100%響應(yīng)值＜2%，響應(yīng)因子RSD＜3%。再現(xiàn)性由3家實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品1進(jìn)行6次測(cè)試，每家(R)-VL檢測(cè)結(jié)果的RSD小于10%。重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差與均值比值＜10%，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差與均值的比值小于10%。再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，(R)-VL含量測(cè)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差與均值比值＜1%，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差與均值的比值小于1%，表明實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的變異性較小。結(jié)論3家單位含量測(cè)定的重復(fù)性和重現(xiàn)性精密度良好，能夠滿足維蘭特羅樣品中(R)-VL含量測(cè)定的需要。系統(tǒng)適用性和精密度溶液的配制同標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容4.1.5項(xiàng)，連分離度(Rs)。分別由起草單位（1）廣東萊佛士制藥技術(shù)有限公司、（2）華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院、（3）廣東朗斯姆生化技術(shù)有限公司三個(gè)實(shí)驗(yàn)室完成，由不同的分析人員在表23(R)-VL系統(tǒng)適用性和儀器精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室*tR/min理論塔板數(shù)/N拖尾因子/T分離度/Rs保留時(shí)間RSD峰面積RSD色譜柱型號(hào)(1)(R)-VL(S)-VL37440.950.07Phenomenex，LuxCellulose38770.982.510.03Phenomenex，LuxCellulose(2)(R)-VL(S)-VL35630.08Phenomenex，LuxCellulose35582.690.05Phenomenex，LuxCellulose(3)(R)-VL(S)-VL46590.400.040.46Phenomenex，LuxCellulose41070.362.580.040.49Phenomenex，LuxCellulose*（1）廣東萊佛士制藥技術(shù)有限公司2）結(jié)論：在此系統(tǒng)條件下，三個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子的重現(xiàn)性和精密度，保留時(shí)間RSD均小于1%，峰面積RSD也小于2%。表明三個(gè)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制方法同二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則表24各個(gè)實(shí)驗(yàn)室下的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線實(shí)驗(yàn)室*組分線性范圍/(mg/mL)線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2響應(yīng)因子RSD（%）Y軸截距/100%響應(yīng)值(R)-VL0.005-0.100y=0.89x+0.080.99970.26(S)-VL0.005-0.1000.005-0.100y=0.72x+0.73y=0.92x-0.140.99910.99980.930.540.03(R)-VL(S)-VL0.005-0.1000.005-0.100y=0.78x-0.53y=0.44x-0.490.99950.99352.270.890.02(R)-VL(S)-VL0.005-0.100y=0.32x-0.350.99360.990.02*（1）廣東萊佛士制藥技術(shù)有限公司2）華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院3）廣東朗斯姆生化技術(shù)有限公分別在三家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，測(cè)試數(shù)溶液的配制同二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容下的4.1.10項(xiàng)，平行制備六份，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，每份供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣2~3次，取峰面積平均值，并按照標(biāo)本實(shí)驗(yàn)由6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品1做6次測(cè)試，測(cè)試原始數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)表25(R)-VL含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)室間原始數(shù)據(jù)表（單位：g/g）實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)試(1)0.6640.6540.6580.6630.6610.652(2)0.6740.6680.6720.6660.6620.675(3)0.6380.6440.6510.6450.6430.645表26(R)-VL含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)室間單元平均值和標(biāo)準(zhǔn)差n666采用曼德爾h統(tǒng)計(jì)量表征不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果平均值的一致性，采用曼德爾k統(tǒng)計(jì)量表征實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)試結(jié)果的變異性，計(jì)算方法和臨界值參考GB/T6379.2-2004。圖11（A）為(R)-VL含量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的曼德爾h圖，可以看出3家實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(R)-VL含量的h統(tǒng)計(jì)量均小于顯著性水平為5%時(shí)的臨界值1.49（p=3,n=6表明實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的均值一致性較好。圖11（B）為(R)-VL含量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)試結(jié)果的曼德爾k圖，可以看出3家實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(R)-VL含量的k統(tǒng)計(jì)量大于顯著性水平為5%時(shí)的臨界值1.37（p=3,n=6表明實(shí)驗(yàn)采用Cochran檢驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)試結(jié)果的變異性，查GB/T6379.2-2004中表4“Cochran檢驗(yàn)臨界值”可知，對(duì)于p=表27Cochran檢驗(yàn)結(jié)果2SmaxΣS2CcalC0.05,6,6C0.01,6,6(R)-VLCcal＜C0.05,6,6，值0.793依據(jù)格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)計(jì)算公式，計(jì)算格拉布斯檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Gp，判定實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的接受值。由GB/T6379.2-2004附錄B表5“Grubbs檢驗(yàn)臨界值”查的，單側(cè)表28Grubbs檢驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)樣品G1最低值Gp最高值單側(cè)檢驗(yàn)5%臨界值（p=3）單側(cè)檢驗(yàn)1%臨界值（p=3）(R)-VL由表28可知，在各實(shí)驗(yàn)室的單元平均值中，用Grubbs檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)歧離值與離群表29重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差檢測(cè)樣品pSrSR表29重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(R)-VL3手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體在生物活性及毒理學(xué)等方面存在立體選擇性，僅僅停留于消旋體的研究、開發(fā)與應(yīng)用水平，已不符合國(guó)際、國(guó)內(nèi)對(duì)手性化合物研究及應(yīng)用的需求。開展手性藥物的手性分離技術(shù)及對(duì)映體檢測(cè)方法研究，具有極大的市場(chǎng)前景。本標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法，對(duì)維蘭特羅手性異構(gòu)體進(jìn)行了定性和定量的識(shí)別，可用于維蘭特羅手性異構(gòu)的種類判定、組成比例和含量的測(cè)定。該標(biāo)準(zhǔn)可廣泛應(yīng)用于維蘭特羅原料藥生產(chǎn)企業(yè)、維蘭特羅標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)企業(yè)、或藥品、食品、保健品等使用企業(yè)，用于指導(dǎo)維蘭特羅生產(chǎn)企業(yè)的研發(fā)、生產(chǎn)和檢測(cè)，促進(jìn)原料和制劑的質(zhì)量控制四、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度及水平的對(duì)比情況本標(biāo)準(zhǔn)是國(guó)內(nèi)首次制定的專門針對(duì)維蘭特羅手性異構(gòu)體檢測(cè)的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，沒有國(guó)五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無七、作為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的建議八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措