T/CSBMT/CSBM0044—2023外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞非抗體依賴磁分離檢測方法Non-antibody-dependentmagneticseparationdetectionmethodofcirculatingtumorcellsinperipheralblood2023-12-04發(fā)布2024-05-04實施中國生物材料學(xué)會發(fā)布I 2 2 2 2 38.1血液樣本采集 38.2樣本前處理 3 4 49.2CTC磁分離捕獲 49.3細(xì)胞制片 59.4CTC鑒定 5 7 7 8 8 8 9 9 9 A.1試劑材料 A.2試劑配制方法 B.1樣本前處理 B.5采圖操作 D.2試劑材料及儀器設(shè)備 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院、上海市第十人民醫(yī)院、吉林大學(xué)第一醫(yī)院、北京麥斯達(dá)夫科技股份12規(guī)范性引用文件3,1外周血peripheralblo循環(huán)腫瘤細(xì)胞CirculatingTumorCell（循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲探針CTCcapture注：本文件中特指根據(jù)非抗體依賴的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲技術(shù)原理設(shè)計而成的細(xì)密度梯度離心densitygradientcentrifu），2），3,F逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction（RT先將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成與之互補(bǔ)的DNA鏈，再以該鏈作模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增特定分析特定DNA片段的堿基序列，即腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排——多肽捕獲探針法：利用多肽修飾的磁性微粒捕獲外周5檢測條件——相對濕度：3065%;6試劑材料和儀器設(shè)備3樣品制備血液樣本采集→樣品前處理樣本檢測檢測準(zhǔn)備→CTC捕獲→細(xì)胞制片→CTC染色鑒定測定結(jié)果測定結(jié)果有效性判定和表述7.2CTC磁分離檢測操作見附錄B。8樣本制備8.1血液樣本采集8.2樣本前處理注：PBS為磷酸緩沖鹽溶液（PhosphateBufferedSa8.2.1.7離心后分層界面清晰，離心后溶液分為3層：上層48.2.2紅細(xì)胞裂解法9樣本檢測9.1.1.1用鑷子夾住管壁，離心管傾斜45°,打開超聲清洗儀，左右激烈晃動，保持1min以上。注1：活化是減少材料團(tuán)聚，提升材料反應(yīng)活注2：分散性指材料在水或其他均勻液體介質(zhì)中，能均注3：分散性評估指用超聲清洗儀充分超聲分散探針，取少量用粒徑分析儀檢測探針的粒徑分布，其中多分散指數(shù)9.1.2涂片放置9.2CTC磁分離捕獲9.2.1無標(biāo)記捕獲探針法9.2.1.3將加有磁性納米探針的離心管放置于迷你旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，在4℃條件下混勻6min～8min。9.2.1.4取出離心管后立即置于多功能磁分離器上，在4℃條件下注：磁吸附為磁性材料在外加磁場的作用下，從液相中自發(fā)地發(fā)生材料運(yùn)動并吸附至磁9.2.1.5用單道移液器緩慢吸掉上清液，并重新加入適量PBS，再次顛倒混勻后，立即放入多功能磁分離器，在4℃條件下磁吸附8min～10min。59.2.2多肽納米探針法9.2.2.1取混合均勻的抗凝血至離心管9.2.2.3孵育結(jié)束后，將離心管放置在多功能磁分離器上注：除磁分離方法，非抗體依賴還有膜過濾法、微流控芯片法等；膜過濾法見附錄C，微流控芯片法見附錄D。9.3細(xì)胞制片注1：樣本稀釋后（即細(xì)胞混懸液），輕度渾濁，細(xì)胞濃度過高，會造成細(xì)胞相互堆疊，影響觀察及鑒定；細(xì)胞濃9.4CTC鑒定a)細(xì)胞固定：將制片后得到的細(xì)胞片室溫晾干，用細(xì)胞固定液固定10min～15min；b)細(xì)胞染色：去掉細(xì)胞固定液，室溫晾干后，依次用細(xì)胞質(zhì)染色液、細(xì)胞核染色液進(jìn)行染色，每種染色液染色1min～2min；9.4.2免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法9.4.2.1免疫細(xì)胞化學(xué)按以下步驟進(jìn)行：6e)二抗孵育：將稀釋好的二抗滴加到反應(yīng)位置，37℃下在濕盒中避光孵育0.5h～1h，棄去二）；9.4.3熒光原位雜交法注：SSC為檸檬酸鈉緩沖液（SalineSodiumCitratebuffer)。c)消化：滴加適量0.04％胃蛋白酶溶液，室溫消化細(xì)胞10min～20min，2×），9.4.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）），7注：DEPC為焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）。），）：9.4.4.4相應(yīng)的引物擴(kuò)增相應(yīng)的基因靶點，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)靶點9.4.4.5常規(guī)PCR擴(kuò)增后需采用凝膠電9.4.5基因測序法），9.4.5.3測序：按測序儀說明書操作進(jìn)行對PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，分析測序10.1細(xì)胞病理鑒定法——細(xì)胞核質(zhì)比＞0.8；810.2免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法——陽性對照：陽性對照可作為正確樣本準(zhǔn)備和適當(dāng)染色技術(shù)的指示。每次染色應(yīng)與同一測試條件下的陽性對照片進(jìn)行比較。陽性對照僅用于監(jiān)控步驟的正確執(zhí)行和試劑的測試，并幫助敘述樣本的明確診斷，若陽性結(jié)果不能顯示適當(dāng)?shù)年栃匀旧瑒t該批次實驗——陰性對照：每次染色應(yīng)與同一測試條件下的空白對照試劑進(jìn)行對比?？瞻自噭┐婵贵w對玻片進(jìn)行染色用來判斷非特異性著色，并對抗原部位特異性染色提供更好的解釋——腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞應(yīng)同時具備細(xì)胞核染色。陽性標(biāo)記免疫特征，陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++）三級，免疫酶標(biāo)記表現(xiàn)為淡黃10.3熒光原位雜交法——陽性對照：細(xì)胞染色體任意兩個以上位點（含兩個）出現(xiàn)異常或一個位點有兩種以上（含兩10.3.2染色體異常且細(xì)胞核染色陽性的細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，染色體異常有基因刪除/擴(kuò)——基因擴(kuò)增：單色探針通常計數(shù)每個腫瘤細(xì)胞信號的絕對量，而雙色探針則計算每個腫瘤細(xì)胞——染色體易位：可發(fā)生在染色體內(nèi)或染色體間。少數(shù)情況下，易位也可出現(xiàn)其中一個分離探針——基因缺失：在應(yīng)用單色探針（即沒有參考染色體探針）時，需要增加計數(shù)細(xì)胞的數(shù)量，避免10.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）——陰性對照：為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期（排除擴(kuò)增體系出現(xiàn)污染——擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域，復(fù)孔之間CT值標(biāo)準(zhǔn)偏9——擴(kuò)增效率在90110％之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線R＞0.99、R2＞0.98；標(biāo)準(zhǔn)方差應(yīng)＜0.2。陽性處理——陰性：F≤A；），10.5基因測序法——若單個峰的一個位點出現(xiàn)多個峰，表明測序結(jié)果無——陽性：檢測到特定基因突變；陽性判斷值為突變比例不低于0.4測序有效深度不×,突變絕對拷貝數(shù)不低于2，鏈平衡性介于0.1～0.9之間（融合不適用——陰性：未檢測到特定基因突變。11,1測定結(jié)果表述11,2測定結(jié)果使用11.2.211.1方法獲得的最終結(jié)果應(yīng)按照合適的采樣者管理程序與來自診斷測12,1安全管理12.2試劑材料防污染12.3廢棄物處理操作區(qū)應(yīng)有專門的固體和液體廢棄物收集容器，廢棄物應(yīng)進(jìn)行無害A.1試劑材料），——細(xì)胞密度梯度分離液：濃度為5060pH值為7.2～7.——細(xì)胞質(zhì)染色液：伊紅染色液：濃度為0.3w/vpH值為4.7～5.0；——細(xì)胞核染色液：亞甲藍(lán)染色液：濃度為1w/v——巴斯德吸管；——蓋玻片：規(guī)格為22mm×22mm，厚度為0.13mm～0.16mm；——離心管：規(guī)格為1.5mL～50mL；A.2試劑配制方法A.2.2密度梯度分離液A.2.4細(xì)胞固定液A.2.5細(xì)胞質(zhì)染色液A.2.6細(xì)胞核染色液A.2.72×檸檬酸鈉緩沖液A.3儀器設(shè)備——水浴鍋：RT+5℃~99℃;——單道移液器；A.4各檢測階段試劑材料和儀器設(shè)備 BSA封閉液法按照8.2.1的處理步驟對血樣進(jìn)行離心，得到的樣本示例見探針的質(zhì)量，具體操作方法和分散性評估示例見圖B.2、圖B涂片放置（見9.1.2）的順序示例見圖B.4，涂片對扣示例見圖B.5，涂片在涂按照9.4.1的操作步驟使用細(xì)胞固定液、細(xì)胞核染色液、細(xì)胞質(zhì)染色液對涂片進(jìn)行細(xì)胞染色，染色B.5.1調(diào)節(jié)顯微鏡參數(shù)，確保顯微鏡及成像軟件參數(shù)設(shè)定條件一致，確保每次圖片的背B.5.2讀片，審片結(jié)束后打印標(biāo)簽貼于樣本上部，標(biāo)簽示例膜過濾法利用有微孔的濾膜將體積較小的CTC過濾掉，將體積較大的CTC截留在濾膜上，實現(xiàn)CTC與其他血液——氯化鈉溶液；——巴斯德吸管；C.3.2400g，離心10min，用移液槍小心吸除上層血清。C.3.3將去除血清的血液成分轉(zhuǎn)移至18mL～25mL固定液中，混勻，固定15min。C.3.4用0.9w/v）氯化鈉溶液潤洗過濾器中的濾膜。C.3.5將含血液成分的固定液用巴氏管轉(zhuǎn)移至過濾器中過濾，血液中較大的細(xì)胞及CTC被截留在濾膜C.3.6加適量0.9w/v）氯化鈉溶液沖洗，利用負(fù)壓使其流出，盡量將其去除干凈。裂解外周血中的紅細(xì)胞后，在微流控芯片上采用流體力學(xué)實現(xiàn)對外周血中CTC的非抗體依賴的分離——巴斯德吸管；D.3.3啟動微流控芯片儀器，設(shè)定流速120mL/h，將進(jìn)樣樣本加入進(jìn)樣口。HER-2/CEP17融合探針HER-2/CEP17比值＜2.0且平HER-2/CEP17融合探針HER-2/CEP17比值≥2.0HER-2/CEP17比值＜1.8 KIF5B/RET或CCDC6/RET融合探針----CCND1/IGH融合探針---- --AR探針，MYC探針或8p探針--CK+/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或CK-/CD45-/DAPI+/CEP8＞2-DAPI+/CD45-/CEP8≥3---EML4/ALK融合探針--CTC細(xì)胞中基因相對表達(dá)量為紅細(xì)胞的1000倍以上MGB1MGB2-CTC細(xì)胞中基因相對表達(dá)量為紅細(xì)胞的1000倍以上PLS3CD133EphB4LAMγ2MATTM4SF3AR-FL AR-V7PSMAHPRTB4GALNT1MAGEA3MLANAPAX3TRP-AGG2-6MAGEA-plexMART1CTC細(xì)胞中基因相對表達(dá)量為紅細(xì)胞的1000倍以上CTC細(xì)胞中基因相對表達(dá)量為紅細(xì)胞的1000倍以上TM4SF3PTHrPProstatecancer全外顯子組測序/全基因組測序ProstatecancerProstatecancerHepatocellularcarcinomaProstatecancer全外顯子組測序/全基因組測序MetastaticbreastcancerMetastaticbreastcancerMelanomaNGSLiver，colorectal，lungGastric，breast，prostatecanNGSBre