一、選擇題1．(2024·泉州高三質(zhì)檢)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、BglⅡ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類(lèi)限制酶被稱(chēng)為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)。選用不同的限制酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割，并用DNA連接酶進(jìn)行連接。下列分析錯(cuò)誤的是()選項(xiàng)切割質(zhì)粒切割目的基因結(jié)果分析ABclⅠ和BglⅡBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同BBclⅠ和BglⅡMboⅠ切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化CMboⅠBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和BglⅡ再次切開(kāi)DMboⅠMboⅠ切割后的質(zhì)?？梢宰晕噎h(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化2.(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接3．(2023·重慶，12)某小組通過(guò)PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段D．酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶4．(2024·鎮(zhèn)江高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時(shí)將目的基因和標(biāo)記基因分別構(gòu)建在兩個(gè)Ti質(zhì)粒上，通過(guò)共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標(biāo)記基因的序列，只留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，具體原理如圖。下列說(shuō)法不正確的是()A．利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部B．分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功C．上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中不能發(fā)揮作用D．經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因，因沒(méi)有啟動(dòng)子而無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄5．如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線(xiàn)圖，含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過(guò)程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。下列相關(guān)敘述正確的是()A．過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導(dǎo)致T－DNA片段失活B．過(guò)程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化C．過(guò)程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細(xì)胞壁通透性改變，使其處于能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K6．(2024·西安高三一模)我國(guó)科學(xué)家利用XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678bp)導(dǎo)入某植物細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴(lài)氨酸的含量比對(duì)照組明顯提高，如圖表示相關(guān)培育過(guò)程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無(wú)XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn))，下列說(shuō)法不正確的是()A．一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生8個(gè)等長(zhǎng)DNA分子B．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法C．植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株D．使用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后能得到1500bp左右的片段7．自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．同時(shí)使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率D．sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的8．(2024·莆田高三質(zhì)檢)如圖表示利用基因工程生產(chǎn)黃金大米時(shí)所構(gòu)建的基因表達(dá)載體，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡蘿卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表達(dá)的蛋白質(zhì)可使細(xì)菌在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下列分析錯(cuò)誤的是()A．A序列是該基因表達(dá)載體的復(fù)制原點(diǎn)B．基因Ⅲ的作用是便于篩選該重組質(zhì)粒C．β－胡蘿卜素是檢測(cè)基因Ⅰ、基因Ⅱ表達(dá)的關(guān)鍵指標(biāo)之一D．圖中基因插入質(zhì)粒時(shí)需要限制酶和DNA連接酶9．(2024·南京高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過(guò)程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過(guò)量表達(dá)，其過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．也可用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因B．酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵C．本過(guò)程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2D．通過(guò)抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)10．(2024·徐州高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物a和引物cB．構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)可選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶C．若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌D．只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞二、非選擇題11．(2021·全國(guó)乙，38)用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類(lèi)需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中要使用多種工具酶，其中4種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。回答下列問(wèn)題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中______________________切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。(3)重組DNA技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中______________；質(zhì)粒DNA分子上有________________________，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是_______________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指____________________________________________。12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)根據(jù)棗樹(shù)的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為_(kāi)_____________。(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。①選用______________酶將載體P切開(kāi)，再用__________(填“T4DNA”或“E.coli81DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②載體P′不具有表達(dá)MT基因的____________和__________。選用______________酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用____離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是___________________________________________________________________________________________________________________________________。13．科研人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)P蛋白的轉(zhuǎn)基因甜玉米。在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中，含P基因的DNA片段以及Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示，其中強(qiáng)啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：限制酶識(shí)別序列ClaⅠ5′AT↓CGAT3′BamHⅠ5′G↓GATCC3′HindⅢ5′A↓AGCTT3′EcoRⅠ5′G↓AATTC3′KpnⅠ5′GGTAC↓C3′SacⅠ5′GAGCT↓C3′(1)以RNA為模板，通過(guò)RT—PCR技術(shù)可獲取P基因。進(jìn)行RT—PCR時(shí)，一般要加入4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脫氧核苷酸，其原因是_____________________________，同時(shí)需加入的酶有________________________________。為了特異性擴(kuò)增P基因序列，需根據(jù)______________________設(shè)計(jì)特異性引物。(2)在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是__________和__________，這樣操作不僅使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，還可利用T－DNA的______________特性，最終使P基因__________________________________。(3)將農(nóng)桿菌液浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中需加入______________，篩選出的愈傷組織經(jīng)再分化過(guò)程形成叢芽，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。(4)對(duì)轉(zhuǎn)基因再生玉米植株進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些植株雖有P基因，但幾乎沒(méi)有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有_______________________________________________________________________________________________________________________________。

課時(shí)練61基因工程的基本工具和基本操作程序1．B2．C[酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。]3．B4．C[Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，A正確；分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，即均可成功，B正確；重組剔除時(shí)，Cre酶基因應(yīng)該在植物細(xì)胞中表達(dá)，故上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中能發(fā)揮作用，C錯(cuò)誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因沒(méi)有啟動(dòng)子，無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。]5．D6．C[一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次共產(chǎn)生等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個(gè))，A正確；因?yàn)椴迦胫参锛?xì)胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導(dǎo)入成功的植物細(xì)胞對(duì)卡那霉素?zé)o抗性，C錯(cuò)誤；根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)，可知由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而補(bǔ)充了含678bp的目的基因，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正確。]7．B[靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤。]8．A[由題圖可知，每個(gè)基因前都存在A序列，可推測(cè)該序列應(yīng)為啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，一個(gè)質(zhì)粒一般只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，A錯(cuò)誤。]9．A10．D[根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會(huì)導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，B正確；由于選擇BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒(méi)有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯(cuò)誤。]11．(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程12．(1)引物1和引物4(2)①EcoRⅤT4DNA②啟動(dòng)子終止子X(jué)hoⅠ和PstⅠ鈣(3)尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定解析(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開(kāi)始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于位點(diǎn)A和位點(diǎn)B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。(2)①M(fèi)T基因的末端為平末端，故需要用EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體P，但后續(xù)需進(jìn)一步將重組載體P′和載體E連接，故需將MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，故選EcoRⅤ將載體P切開(kāi)；由于E.coli81DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可以連接平末端，MT基因的末端為平末端，故需要用T4DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②由圖可知，載體P′不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據(jù)圖可知，載體P′和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶的識(shí)別序列，