DNA的粗提取及鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。構(gòu)成染色體的核蛋白加速解聚，游離出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于Nacl溶液中。Nacl溶液為2mol/L時(shí)，DNA溶解，而部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析生成沉淀，通過過濾，可除去部分蛋白質(zhì)及不溶于Nacl溶液的雜質(zhì)Nacl溶液為0.14mol/L時(shí),DNA析出，過濾可除去溶于Nacl中的部分蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。Nacl蛋白質(zhì)在Nacl溶液濃度從2mol/L降低的過程中，溶解度逐漸增大一、實(shí)驗(yàn)原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。（鑒定）（現(xiàn)用現(xiàn)配）沸水浴加熱1.選擇適宜的材料2.破碎細(xì)胞4.提純5.驗(yàn)證3.提取二、實(shí)驗(yàn)思路1.選材：新鮮洋蔥為什么用洋蔥呢，其他實(shí)驗(yàn)材料可以嗎？三、實(shí)驗(yàn)步驟紅細(xì)胞成熟的紅細(xì)胞這些生物組織是否適宜用作實(shí)驗(yàn)材料？DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等

不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，不含DNA1.選材：注意：操作步驟簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)材料是否容易保存等實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)1.選材：實(shí)驗(yàn)試劑：研磨液2.破碎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)工具：研缽EDTA（乙二胺四乙酸）：是一種能與二價(jià)金屬離子結(jié)合的螯合劑，而大多數(shù)核酸酶需要鎂離子，因此可以作為DNA酶的抑制劑，防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。Tris-Hcl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）：緩沖體系，DNA在這個(gè)緩沖體系呈穩(wěn)定狀態(tài)。（ph=8)SDS(十二烷基硫酸鈉）：是一種陰離子去污劑，可以裂解細(xì)胞。常見于洗滌劑研磨液的成分使蛋白質(zhì)變性，染色體解離。2mol/LNacl:溶解DNA1.選材：實(shí)驗(yàn)試劑：研磨液使蛋白質(zhì)變性與DNA分離，防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA,DNA在緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)2.破碎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)工具：研缽2.破碎細(xì)胞？研磨液破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中3.提取DNA(過濾或者離心）？上清液中有什么物質(zhì)呢？DNA會(huì)被吸附到濾紙上DNA不溶于酒精，但有些蛋白質(zhì)，脂質(zhì)溶于酒精。在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。預(yù)冷的酒精：一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂4.純化用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物晾干。攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向：減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。4.純化用高濃度鹽溶液溶解DNA，可以去除在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解和析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。還有什么方法去除雜質(zhì)？二苯胺試管編號(hào)A組（對(duì)照組）B組（實(shí)驗(yàn)組）步驟1物質(zhì)的量濃度為2mol/L的Nacl溶液5ml步驟2不進(jìn)行任何處理加絲狀物或沉淀物步驟3加4ml二苯胺試劑，混勻步驟4沸水浴加熱5min實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象4.鑒定（定性）如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。溶液不變藍(lán)溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)色了解—鑒定（定量）原理：DNA溶液與二苯胺試劑作用生成藍(lán)色化合物，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，化合物藍(lán)色的深淺與DNA的含量成比例關(guān)系，可用比色法測(cè)定。分光光度計(jì)入射光強(qiáng)度Io透射光強(qiáng)度I樣品池

（吸收池）檢測(cè)器及儀表單色器光源工作原理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干燥的試管6支，編號(hào)，按下表加入試劑:混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)DNA濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。012345DNA標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.80.60.40.20二苯胺試劑2.02.02.02.02.02.0方法步驟2.樣品測(cè)定吸取DNA樣液1ml,加入二苯胺溶液2.0ml，加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)所測(cè)得的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得DNA的質(zhì)量。方法步驟了解—鑒定(紫外吸收法）原理：核酸類物質(zhì)含有嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基具有共軛雙鍵，在紫外區(qū)260nm處有最高吸收峰。紫外吸收法是實(shí)驗(yàn)室中最常用的定量測(cè)定DNA或RNA的方法。對(duì)待測(cè)樣品的純度也可用紫外分光光度法進(jìn)行鑒定。純DNA的A260/A280應(yīng)大于等于1.8，樣品中如含有雜蛋白，

A260/A280即明顯。定量測(cè)定時(shí)，通常以A260值為1相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA，或40μg/ml單鏈DNA（或RNA）進(jìn)行換算。降低粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。進(jìn)一步純化例如，可以先添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿一異丙醇混合液(體積比為24:1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時(shí)DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實(shí)驗(yàn)用具就可以將兩者分開。CTAB去除蛋白，多糖，酚類四.結(jié)果分析DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理DNA不溶于乙醇，蛋白質(zhì)溶于乙醇DNA在不同濃度的Nacl溶液中溶解度不同DNA與二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)DNA的粗提取選擇適宜材料破碎細(xì)胞DNA的溶解和析出DNA的純化鑒定DNA與二苯胺混合，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)應(yīng)用親子鑒定應(yīng)用核酸檢測(cè)應(yīng)用精準(zhǔn)醫(yī)療香蕉中DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)①取一段長(zhǎng)約2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10mL溫水，2g食鹽，5滴洗潔精，充