多肽合成

根底知識(shí)匯編

編制：合成部

一、多肽合成概論

1.多肽化學(xué)合成概述：

1963年，［1］創(chuàng)立了將獲基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然后在此樹脂上依次縮合第基酸，延長(zhǎng)肽鏈、合成

蛋白質(zhì)的固相合成法，在固相法中，每步反響后只需簡(jiǎn)單地洗滌樹脂，便可到達(dá)純化目的,克服/經(jīng)典液相合成法中的每

?步產(chǎn)物都需純化的困難，為自動(dòng)化合成肽奠定了根底.為此，Mewifield獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).

今天，固相法得到了很大開展.除了Merrifield所建立的Boe法（Boc:叔丁氧排基）之外，又開展了Fmoc固相法

（Fnnc:9-笏甲氧琉基）.以這兩種方法為根底的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和開展，并仍在不斷得到改造和完善.

Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA（三氟乙酸）可脫除的Boc為a-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用不醉類,合成

時(shí)格一個(gè)Boc一氨基酸衍生物共價(jià)交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc,用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過(guò)Dec活化、

耦聯(lián)下一個(gè)史基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA（三版甲磷酸）法.用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性

前、生長(zhǎng)因子、人工蛋白等.

多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的?類化合物，由多種氨基

酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成.到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和別離出一百多種存在于人體的肽，對(duì)于多肽的研究和

利月，出現(xiàn)了一個(gè)空前的繁榮景象.多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)多肽全

合成可以驗(yàn)證一個(gè)新的多肽的結(jié)構(gòu)：設(shè)計(jì)新的多肽，用「研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反響機(jī)制提供重要信

息：建立.模型朝以及合成新的多肽藥物等.

多肽的化學(xué)合成技術(shù)無(wú)論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來(lái)，固相法合成多肽更以其省時(shí)、省力、省料、

便于計(jì)算機(jī)控制、便于普及推廣的突出優(yōu)勢(shì)而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核甘酸合成等其它有機(jī)物領(lǐng)域。本文概述

了固相合成的根本原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程，對(duì)其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展望了今后的開展趨勢(shì)。

從1963年MenAfield開展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改良和完善，到今天固相法己成為多肽和

蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比較的優(yōu)點(diǎn)。其根本原理是：先將所要合成肽處的羥末端

第基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為史基組份經(jīng)過(guò)

脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)俄的活化陵基組分反響，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)（縮合一洗滌一去保護(hù)一中和及洗滌一下i輪縮合）操

作，到達(dá)所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中氨基用BCC

（叔丁氧援基）保護(hù)的稱為BOC因相合成法，a-級(jí)基用FMOC（9-笏甲氧?；糇o(hù)的稱為FMOC固相合成法，

2.固相合成的根本原理

實(shí)肽合成是一個(gè)重豆添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序一般從C端（瘦基端）向N端（氨基端）合成。過(guò)去的多

肽合成是在溶液中進(jìn)行的棕為液相合成法.現(xiàn)在多采用固相合成法，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止

副反響的發(fā)生，參加反響的氨基酸的側(cè)能都是保護(hù)的。按基端是游離的，并且在反響之前必須活化?；瘜W(xué)合成方法有兩

種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在大多采用Fmoc法3成，如圖：

具體合成由以下幾個(gè)循環(huán)組成：

一、去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。二、激活

和交聯(lián)：下?個(gè)氨基酸的殘基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反響交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量

的超濃度試劑驅(qū)使反響完成。循環(huán)：這兩步反響反星循環(huán)直到合成完成。

三、洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA）洗脫和脫保護(hù)。

2.1樹脂的選擇及氨基酸的固定

將固相合成與其他技術(shù)分開來(lái)的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包

含反響位點(diǎn)（或反響基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上，并在以后除去：必須對(duì)合成過(guò)程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定：數(shù)

體必須允許在不斷增長(zhǎng)的肽鏈和試劑之間失速的、不受阻礙的接觸：另外，載體必須允許提供足夠的連接點(diǎn)，以使每單

位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子

載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯帙胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導(dǎo)入反響

基團(tuán)，才能直接連上（笫一個(gè)）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反響基團(tuán)的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、理

基樹脂、氨基樹脂或酰朧型樹脂。B0C合成法通常選擇氯甲菸樹脂，如Me門Tficld樹脂：FMOC合成法通常選擇竣基樹脂

如王氏樹脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保聲氨基酸的按基同樹脂的反響基團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，形成共價(jià)鍵的

方法有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保氨基酸的四甲鉉鹽或鈉鹽、鉀鹽、鈉鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹脂反

響或在適宜的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反響：瘦基樹脂，那么通常參加適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或撥基二咪哇，

使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共能以完成氨基酸的固定：氨基樹脂或酰朧型樹脂，卻是參加適巧的縮合劑如DCC后，通過(guò)

保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的惟胺鍵來(lái)完成氨基酸的固定。

氮基、披基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和按基加以保護(hù)，同時(shí)對(duì)?氨基酸側(cè)鏈

上的活性基因也要保護(hù)，反響完成后再將球護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧段基類型作為。城基

的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用不氧瓶基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來(lái)改為叔丁氧班

基IBOC）保護(hù)，用TFA（三敘乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，changVcienlofer

和Atherton等人采用Carpin。報(bào)道的Fmoc（9-笏甲氧碟基）作為a氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對(duì)酸很穩(wěn)定，但能用哌噬YH2CI2

或哌咤-DMF脫去，近年來(lái)，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。粉基通常用形成晶基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲脂和乙酯是逐步合

成中保護(hù)瘦基的常用方法，可通過(guò)皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡枰员阌糜谄瑪嘟M合：叔丁酯在酸性條件下除去：節(jié)酯常用催化氫

化除去。對(duì)于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精第酸等帶惻鏈功能基的氨基酸的肽來(lái)說(shuō)，為了防止由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來(lái)

的副反響，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將偏鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)推基團(tuán)不參與形成酰胺的反

響，又要保證在肽合成過(guò)程中不受破壞，同時(shí)又要保證在最后肽鏈裂解時(shí)能被除去。如用三米甲基保護(hù)半胱氨酸的S-,

用酸或銀鹽、汞鹽除去：組如酸的咪陛環(huán)用2,2,2-三氟1-羊氧堞基和2,2,2-三疑1■■叔丁氧援基乙基保護(hù)，可通過(guò)催化

氫化或冷的三氨乙酸脫去。精第酸用金剛垸氧城基（Adoc）保護(hù)，用冷的三箍乙酸脫去。

固相中的接肽反響原理與液相中的根本一致，將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及狼基被保護(hù)的瓜基酸放在溶液內(nèi)并不形

成肽說(shuō)，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將段基活化，變成混合酸肝、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形

成對(duì)稱酸好等方法來(lái)形成惟胺鍵。其中選用DCC、H0BT或H0BT/DCC的對(duì)稱酸酢法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。

裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA-HF裂解和脫側(cè)錐保護(hù)基，F(xiàn)V0C法直接用TFA,有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光

解、鼠離了?和氫解等脫保護(hù)方法也被采用.合成肽鏈進(jìn)?步的精制、別離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛

細(xì)管電泳等。

4.固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問(wèn)題

固相合成法對(duì)于肽合成的顯著的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化并加速了多步驟的合成：因反響在?簡(jiǎn)單反響器皿中便可進(jìn)行，可防止

因手工操作和物料重顯轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失：固相教體共價(jià)相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)，可通過(guò)快速的抽濾、洗滌未

完成中間的純化，防止了液相肽合成中冗長(zhǎng)的重結(jié)晶或分柱步驟，可防止中間體別離純化時(shí)大量的損失：使用過(guò)量反響

物，迫使個(gè)別反響完全，以便最終產(chǎn)物得到高產(chǎn)率；增加溶劑化，減少中間的產(chǎn)物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的

聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這對(duì)肽自聚集熱力學(xué)不利而對(duì)反響適宜。固相合成的主要存在問(wèn)題是

固相載體上中間體雜肽無(wú)法別離，這樣造成最終產(chǎn)物的純度不如液相合成物，必需通過(guò)可靠的別離手段純化。

5.固相合成的研究開展前景

固相多肽合成已經(jīng)有10年的歷史了，然而到現(xiàn)在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白

質(zhì)了，同時(shí)合成中的試劑毒性，昂貴費(fèi)用：副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問(wèn)題，而在生物體內(nèi)，核鋸體上合成肽鏈的速

度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應(yīng)用在固相多肽合成（樹脂）上，這

是一個(gè)令人感興趣的問(wèn)題，也許是今后多肽合成的開展。

在Boc合成法中，反豆地用酸來(lái)脫保護(hù)，這種處理帶來(lái)了一些問(wèn)題：如在肽與樹脂的接頭處，當(dāng)每次用50%TFA脫Bcc

基葉，有約1.4%的肽從樹脂上脫落，合成的肽越大，這樣的喪失越嚴(yán)重：此外，酸催化會(huì)引起側(cè)鏈的一些副反響.Boc合

成法尤其不適尸合成含有色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的肽類.1978年，Chang、Meienlozer和Atherton等人采用Carpino[31

報(bào)道的Fmoc（9-笏甲氧皴基）基團(tuán)作為a-氨基保護(hù)基，成功地進(jìn)行了多肽的Fmoc固相合成.Fmoc法與Boc法的根本區(qū)別

在于采用了堿可脫除的Fmoc為a-氨基的保護(hù)基.側(cè)鏈的保護(hù)采用TFA可脫除的叔丁氧基等，樹脂采用90UFA可切除的

對(duì)燒氧節(jié)靜型樹脂和1%TFA可切除的二烷乳節(jié)醉型樹脂，最終的脫保護(hù)防止了強(qiáng)酸處理.

6.HP【￡分析和純化分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒(3T0um)做埴

料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。HPLC分兩類：離子交換和反相。離子交及HPLC依熊多肽和固相間的直接電荷相

互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷,

別圖是一種電荷相互作用，通過(guò)可變PH,離子強(qiáng)度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)

或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫出,離子交換別離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。$11sulfoethylaspartimide

通過(guò)酸性PH中帶正電來(lái)別離。反相那LC條件與正常層析正相反。多肽通過(guò)疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗

脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫橥綐?gòu)成，這種鏈長(zhǎng)度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一

種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好.然而，總體實(shí)踐中，這兩類柱互變無(wú)多少顯著差異，別類載體由碳水化合物

構(gòu)成.比方米基.曲型的攆作常由兩線沖劑組成.0.1%TFA-H2o和80^acetonitrile0.1%TFA—H2o稀acetonitrile.

用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6X250mm(3-10um)和22X250mm(10um).

如吳用徑向填柱，那么大小是8X100(3-10um)和25X250mm(10um)

大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比方大ptafluorobutyric酸，0.1%磷酸,稀Heformic酸(5-6%pH2-4),10-100nM

NH4HC03,胎酸鈉/氨，TFA/TEA,磷酸鈉或鉀，異戊酚，這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意?點(diǎn)：硅反相柱料不

能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高pH,甚至微堿pH,因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子。

7.Fmoc-氨基酸的制備和側(cè)鏈保護(hù)Pmcc基團(tuán)是在有NaHC03或Na2C03存在的二氧六環(huán)溶液中，通過(guò)以下反響引入到

氨基酸中的：

理想的IWoc-氨基酸的側(cè)性保護(hù)基應(yīng)在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下脫除.下面對(duì)其做一介紹.

7.lAsp和Glu

Asp和Glu側(cè)鏈按基常用t-Bu保護(hù).可用YA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護(hù)仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反響發(fā)生.

近生來(lái)，開展了一些新的保護(hù)基如環(huán)烷醇酯、金剛烷醉酯等可減輕這--副反響，這些保護(hù)基可用TYSOTf(三氟甲磺酸三甲

硅烷酯)除去.

7.2Ser、Thr和Tyr

ser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護(hù).叔丁基的引入比較麻煩，首先ser制成羊氧族基酯，再在酸催化卜.與

異丁烯反響.Ser和Thr還可用節(jié)基保護(hù)，Sei?用節(jié)醉引入羊基、Thr用溟不引入苦基.

7.3Asn和Gin

Asn和Gin側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護(hù).但合成大肽時(shí),Asn和Gin的u-按基活化時(shí)可能會(huì)發(fā)牛.分子內(nèi)脫敏

反響生成鼠基化合物.堿性時(shí)Gin的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護(hù)的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為

了防止這些問(wèn)題，可以用9-咕噸基，2,4,6-三甲氧節(jié)基，4,4'一二甲氧二茉甲基或三采甲基等保護(hù)，這四種基因均

可月TI-A脫除.

7.4His

His是最容易發(fā)生消旋化的雙基酸，必須加以保護(hù).

對(duì)咪哇環(huán)的非n-N開始用苫基(Bzl)和甲基橫?；?TOS)保護(hù).但這兩種保護(hù)基均不太理想.TOS對(duì)親核試劑不穩(wěn)定，

Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc基團(tuán)是一個(gè)較理想的保護(hù)基，降低了咪喋環(huán)的堿性，抑制了

消旋，成功地進(jìn)行了一些合成.但是當(dāng)反復(fù)地用堿處理時(shí)，也表現(xiàn)出一定的不稔定性.哌呢叛基在堿中穩(wěn)定，但是沒(méi)能很

好地抑制消旋，而且脫保護(hù)時(shí)要用很強(qiáng)的親核試劉如.

對(duì)咪吐環(huán)n-N保護(hù)，可以完全抑制涌旋，n-N可以用節(jié)氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護(hù)，(Bum)可以用TFA脫

除,Bom更穩(wěn)定些，需用催化氫解或強(qiáng)酸脫俁護(hù)，Bum是目前很有.開展前途的His側(cè)鏈保護(hù)法，其缺乏之處在于Fmoc(His)Bun

在DCM和DMF中的溶解度較差.

7.5Cys

Cys的一SH具有強(qiáng)親核性，易被?；闪蜥。惨妆谎趸癁槎蜴I，必須加以保護(hù).常用保護(hù)基有三類：一類用TFA可脫

除，如對(duì)甲節(jié)基、對(duì)甲氧節(jié)基和三苯甲基等：第二類可用(CF3CO)3T1/TFA脫除.對(duì)TFA稔定.如t-Bu、Bom和乙眥胺甲

基等.第三類對(duì)弱酸穩(wěn)定，如節(jié)基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用疏基試劑和磷試劑丸原，Cys(BzD可用W/NH3⑴

脫保護(hù).

7.6Arg

Arg的凱基具有強(qiáng)親核性和堿性.必如加以保護(hù).理想的情況是三個(gè)氮都加以保護(hù).實(shí)際上保護(hù)1或2個(gè)胭基氮原子.保護(hù)

基分四類：(D硝基(2)烷氧排基(3)橫?；?4)三苯甲基.

硝基在制備、?；呀庵挟a(chǎn)牛.很多副反響，應(yīng)用不廣.烷氧玻基應(yīng)主要有Boc和二金剛烷氧玦基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Bcc

的耨聯(lián)反效率不高，哌喔理時(shí)不處穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生副反響：Adoc保護(hù)了兩個(gè)非n-N,但有同樣的副反響發(fā)生.對(duì)橫?；?/p>

護(hù)，其中T0S應(yīng)用最廣，但它較難脫除.近年來(lái)2,3,6-三甲基-4-甲氧苯橫畸基3”)較受歡送，在TFR作用卜*30分

鐘即可脫除，但是它們都不能完全抑制側(cè)鏈的?；l(fā)生.三藻甲基保護(hù)基可用TFA脫除.缺點(diǎn)是反響較慢，側(cè)捱仍有?；?/p>

反響，且其在DCM、DMF中溶解度不好.

7.7Lys

Lys的S-NH2必須加以保護(hù).但與a-NH2的保護(hù)方式應(yīng)不同，該保護(hù)基要到肽^合成后除去.。一陽(yáng)12的保護(hù)無(wú)消旋問(wèn)

題，可以采用帙基保護(hù)基，其它常用的保戶基有羊氧碳基和BOC.

7.8F>noc基團(tuán)的脫除Fmoc基團(tuán)的笏環(huán)系的吸電子作用使9-11具有酸性，易被較弱破除去，反響條件很溫和,反響過(guò)程可

表示如F：

哌魄進(jìn)攻9-H,3消除形成二苯笏烯，很容易被二級(jí)環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物.Fmoc基團(tuán)對(duì)不同的堿穩(wěn)定性不同，

可根據(jù)實(shí)際條件選用.

7.9耦聯(lián)反響固相中的接肽反響原理與液相中根本致.將兩個(gè)相應(yīng)的就基被保護(hù)的及段基被保護(hù)的假基酸放在溶

液內(nèi)，并不形成肽鍵.要形成酰股鍵，經(jīng)常用的手段是將按基活化，其方法是將它變成混合酸肝，或者將它變?yōu)榛顫娔堋?/p>

酰鼠，或者用強(qiáng)的失去劑(碳二亞胺)也可形成酰胺鍵，耦聯(lián)反響可表示如下：(A：埃基活潑試劑)

碳二亞胺是常用的活化試劑，其中Dec使用范圍最廣，其缺點(diǎn)是形成了不溶JDCM的DGL過(guò)渡時(shí)乂難卜除盡.其他

一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用于固相合成中，它們形成的胭

溶于DCM中，經(jīng)洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop-CD、氯甲酸異丙酯、疑甲酸異「酯、S0C12等.其中

Dee、Bop活化形成對(duì)稱酸酊、SOC12形成酰氯，其余三種形成不對(duì)稱酸好.

7.10對(duì)稱酸酊法用Dee形成對(duì)稱酸肝的方法使用較廣.其缺點(diǎn)是rr些第基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc第基

酸卅溶解度更差.同時(shí)還有些副反響，如形成二肽、消旋等.

7.11混合酸酊法最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酊稔定性好.只產(chǎn)生很少消旋，在適當(dāng)

的化學(xué)計(jì)量及溶劑條件下，耦聯(lián)反響很快.而且，在此反響中使用的N-甲基嗎咻和N-甲基哌噬對(duì)Fmoc基團(tuán)無(wú)影響.

7.12陵氯法在Boe法中不常用的酰氯,因?yàn)楸容^劇烈，一些保護(hù)基如Boe不穩(wěn)定.但是，F(xiàn)moc基團(tuán)可以耐受眥氯

處理，生成的Fmoc氨基酰氯也很穩(wěn)定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮嘎/二異丙基乙二胺中，反響速度很快，消旋很

少.酰氮法在固相合成中應(yīng)用還不多，但已說(shuō)明，F(xiàn)moc一氨基帙蛹適用于合成有.立體障碣的肽序列.

7.13活化能法活化酯法在固相合成中應(yīng)用最為廣泛,采用過(guò)的試劑也很多，近來(lái)最常用的有HOBt酯、ODhbl前、

OTDO酷等.

HOBi酯反響快，消旅少，用碳二亞胺很容易制得；ODhbl酷很稔定，容易進(jìn)行別離純化，與HOBt脂具有類似的反響性和

消旋性能，它還有一個(gè)優(yōu)越之處.在酰化時(shí)有亮黃色、耦聯(lián)結(jié)束時(shí)顏色消失，有利于監(jiān)測(cè)反響：OTDO酯與ODhbt酷類似,

消旋化極低，易別離，酰化時(shí)伴有顏色從詰紅色到黃色的變化等.

7.14原位法將碳二亞胺和a-N保抵氨基酸直接加到樹脂中進(jìn)行反響叫做原位法.

用DIC代替Dec效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-Cl等.原位法反啊快、副反響少、易操作.其中DIC最有

效.苴次是Bop、Bop-Cl等..遺憾的是Bop映化時(shí)生成致痛的六甲基磷酰膿.限制/其應(yīng)用.

7.15裂解及惻鏈保護(hù)基脫除Fmoc法裂解和脫側(cè)錐保護(hù)基時(shí)可采用弱酸.TFA為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除

t-Bu、Boe、Adoc、Mtr等:條件溫和、副反響較少.缺乏之處：Arg側(cè)鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大;無(wú)法除掉Cys

的l-Bu等基因.也有采用強(qiáng)酸脫保護(hù)的方法:如用HF來(lái)脫除一些對(duì)弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基,如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl（節(jié)

基）保護(hù)基等，但是當(dāng)脫除Asp的吸電子保護(hù)茶時(shí)，會(huì)引起環(huán)化副反響.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫犍存在時(shí)，脫保護(hù)

速度很快.此外，根據(jù)條件不同，堿、光儂、賦離子和氫解等脫保護(hù)方法也有應(yīng)用.

Fmoc基團(tuán)用于固相合成多肽已經(jīng)有「十多年的歷史，在合成一些含有在酸性條件下不穩(wěn)定的氨基的殘基的肽時(shí)，具有特

別優(yōu)越之處.將Fmoc法和Boe法互相補(bǔ)充，定會(huì)在合成更多、更大的生物分子中發(fā)揮。

二、常用保護(hù)氨基酸數(shù)據(jù)

縮寫名稱分子量縮寫名稱分子量

A-AlaFmoc-Ala329.3M-MetFnioc-Met371.5

R-ArgFmoc-Arg(Pbf)648.77F-PheFmoc-Phe387.4

N-AsnFmoc-Asn(Tn)596.7(D)F-PheFmoc-D-Phe387.4

D-AspFmoc-Asp(OtBu)411.46P-ProFmoc-Pro337.4

C-CysFmoc-Cys(Trt)585.7S-SerFmoc-SentBu)383.4

Q-GInFmoc-Gln(Trt)610.7T-TlirI;moc-Thr(lBu)397.5

E-GluFmoc-Glu(OiBu)425.48W-TrpFmoc-Trp(Boc)526.59

G-GlyFmoc-Gly297.3(D)W-TrpFmoc-D-Trp(Boc)526.59

H-HisFmoc-His(Trt)619.7D-TyrFnioc-Tyr(lBu)459.5

I-IlcFmoc-Ile353.4V-VaiFmoc-Vai339.4

L-LeuFmoc-Leu353.4pGluPyroGlu129.1

K-LysFmoc-Lys(Boe)468.5

常用試劑種類及數(shù)據(jù)

名稱分子量名稱分子量密度(g/ml)

HOB(135.1DIPCDI(DIC)126.30.806

TBTU321.1DIPEA(DIA)129.40.76

HATU380.3AC2。102.11.08

DMAP122.1Pyridine79.10.983

HOAT136.1TFA114.21.44

TMP121.180.92

EDT94.241.123

TIS158.4

NMM101.150.9168

常見保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)

縮寫分子量縮寫分子量縮寫分子量

Fmoc-222tBu-56Acm-57

Pbf-253OiBu-72Mz-165.1

Trt-242.3Ac-43

Boe-10L1Z-134.1

三、常用氨基酸結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

Symbol

meMWMW(-H2O)Structure

ThreeLetterCodeOneLetterCode

lanineAlaA89.0971.08

田？

MH

rginineArgR174.20156.19

HNMj

sparagineAsnN132.12114.10

oNH2

sparticAcidAspD133.10115.09

NH?

-ysteineCysC121.15103.15

NH；

ilutamicAcidGluE147.13129.12

0

J

ilutamineGinQ146.15128.13

ilycineGlyG75.0757.05M^^r處

LJX

istidineHisH155.16137.14

HI

>oleucinelie1131.17113.16共、

NH2

nr

eucineLeuL131.17113.16

CH)NH2

ysineLysK146.19128.17

NH2

lethionineMetM149.21131.20

err

henylalaninePheF165.19147.18

07

rolineProP115.1397.12

erineSerS105.0987.08

NH?

-

hrconincThrT119.12101.11

orr

ryptophanTrpW204.23186.21

HI

yrosineTyrY181.19163.18

xrr

CMj

alineVaiV117.1599.13

四、常見保護(hù)基團(tuán)結(jié)構(gòu)

NameStructureSymbolFormulaResidueWt

Acetamidomethylg人AcmC3H6NO72.1

M

AcetylAAcC2H3O43.0

AllyloxycarbonylAloeC4H5O285.1

6-AmidohexancateJ」LCC4H7NO85.1

7-Amido-4-methylcoumarylAMCC10H8NO2174.2

I

M

7-Amido-4-trifluoromethyl-cou

AFCC10H5F3NO2228.2

marylk

I

M

M

I

5-[(2-Aminoethyl)amino]-napht

4]EDANSC12H13N2O3S265.3

halene-1-sulfonicacid

$<廿

o

BenzoylcBzC7H5O105.1

BenzylcBzlC7H791.1

人

Benzyloxycarbonyl0rZ(CbzjC8H7O2135.1

Benzyloxymeth/IBomC8H9O121.2

(+)-BiotinylBiotinC10H15N2O2S227.3

o

8r0

2-Bromobenzyloxycarbonyl2-Br-ZC8H6BrO2214.0

6人

tert-ButyltBuC4H957.1

tert-ButyloxycarbonylBocC5H9O2101.1

M千人

CH,

tert-Butylthio10cStBuC4H9S89.2

os

Clp

2-Chlorobenzyloxycarbonyl2-CI-ZC8H6CIO2169.6

CyclohexylcHexC6H1183.1

*

2,6-Dichlorobenzyl2,6-di-CI-3zlC7H5CI2160.0

Cl

4-(4-Dimethylaminophenyl-azo

DABCYLC15H14N3O252.3

)benzoyl

4

2,4-DinitrophenylDnpC6H3N2O4167.1

9-l-luorenylmethyl00bmC14H11179.1

<

9-Fluorenylmethyloxy-carbonyl§YFmocC15H11O2223.3

ccr

Fluoresceinlso:hiocyanate廣FITCC21H12NO5S390.4

廣?

LissamineRhodamineLRC31H38N2O6S2598.8

T

.CMj

Mesitylene-2-sulfonylMtsC9H11O2S183.3

CH,

4-MethoxybenzylMobC8H9O121.2

(7-Methoxycoumarin-4-yl)acet

McaC12H9O4217.2

yi

CH1

4-Methoxy-2,3,6-trimethyl-ben

CH,O-yy-MtrC10H13O3S213.3

zenesulfonyl

MCH,

4-MethoxytritylMmtC20H17O273.4

3

4-MethylbenzylMBzlC8H9105.2

c

4-MethyltritylMttC20H17257.4

c

4-MorpholinecarbonylMuC5H8NO2114.1

p-Nitroanilide46MoipNAC6H5N2O2137.1

2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-

PbfC13H17O3S253.3

benzofuran-5-sulfonyl

r>

xg：

CH,

r>

2,2,5,7,8-Pentamethyl-chroma

PmcC14H19O3S267.4

n-6-sulfonyl

CH?

A1Px

Rhodamine110小R110C20H13N2O3329.3

SuccinylSueC4H5O3101.1

>

4-Toluenesulfonyl“XTTosC7H7O2S155.2

TritylTrtC17H15243.3

0

O~§

Xanthyl0^0XanC13H9O181.2

五、多肽常識(shí)

ReconstitutionandStorageofPeptides

Peptidesareusuallysuppliedasafluffy,;reeze-driedmaterialinserumvials.Storepeptidesinafreezerafterthey

havebeenreceived.Inordertoreconstitutethepeptide,distilledwaterorabuffersolutionshouldbeutilized.Some

peptideshavelowsolubilityinwaterandnustbedissolvedinothersolventssuchas10%aceticacidforapositively

chargedpeptideor10%ammoniumbicarbonatesolutionforanegativelychargedpeptide.Othersolventsthatcanbe

usedfordissolvingpeptidesareacetonitrile,DMSO,DMF,orisopropanol.Usetheminimalamountofthese

non-aqueoussolventsandaddwaterorbuffertomakeupthedesiredvolume.Afterpeptidesarereconstituted,they

shouldbeusedassoonaspossibletoavoiddegradationinsolution.Unusedpeptideshouldbealiquotedinto

single-useportions,relyophilizedifpossible,andstoredat-20℃.Repeatedthawingandrefreezingshouldbeavoided.

MethodstoDissolvePeptides

Thebestwaytodissolveapeptideistousewater.Forpeptidesthatarenotsoubleinwater,usethefollowing

procedure:

1.Foracidicpeptides,useasmallamountofbasesuchas10%ammoniumbicarbonatetodissolvethepeptide,

dilutewithwatertothedesiredconcentration.Donotusebaseforcys:eine-containingpeptides.

2.Forbasicpeptides,useasmallamountof30%aceticacid,dilutewithwatertothedesiredconcentration.

3.Foraveryhydrophobicpeptide,trydissolvingthepeptideinaverysmallamountofDMSO,dilutewithwater

tothedesiredconcentration.

4.Forpeptidesthattendtoaggregate(usuallypeptidescontainingcysteines),add6Murea,6Mureawith20%