谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，是氨基酸代謝的重要酶。血清AST活性水平是肝臟損傷的重要生化指標(biāo)，可反映肝臟受損的嚴(yán)重程度。此外，AST在心肌細(xì)胞中含量最高，臨床上一般常作為心肌梗塞和心肌炎的輔助檢查。CheKine?谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）提供了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法檢測(cè)生物樣本如血清（漿）、動(dòng)植物組織、細(xì)胞、細(xì)菌中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）的活性水平。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）在37℃及pH7.4條件下，催化α-酮戊二酸和L-天冬氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成谷氨酸和丙酮酸；丙酮酸可與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸苯腙，在堿性條件下顯棕紅色，于505nm測(cè)定吸光度，即可計(jì)算AST/GOT酶活力。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)505nm處的吸光度）·水浴鍋、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備Extraction

Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。Standard：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：按下表混合Standard和ReagentⅠ，得到相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。Standard（μL）ReagentⅠ（μL）Standard濃度（μmol/mL）1515112180.86240.43270.21.5529.250.050300注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。動(dòng)物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞或細(xì)菌：收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）：直接測(cè)定。注意：如需樣本蛋白濃度測(cè)定，推薦使用AbbkineBCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒，貨號(hào)為KTD3001。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1410（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列試劑：試劑測(cè)定孔（μL）對(duì)照孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）樣本500ReagentⅠ25250不同濃度Std.0030混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱30minReagentⅡ252525樣本050混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)20minReagentⅢ240240240混勻，室溫靜置10min，在505nm波長處測(cè)各孔的OD值，記為OD測(cè)定、OD對(duì)照、OD標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算ΔOD測(cè)定=OD測(cè)定-OD對(duì)照、ΔOD標(biāo)準(zhǔn)=OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白。注意：每個(gè)樣本均需要做對(duì)照孔。0μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)孔為空白孔。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。2.如果ΔOD測(cè)大于濃度為1.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品的ΔOD標(biāo)，則需要用ExtractionBuffer稀釋樣本后，重新檢測(cè)。如果樣本的ΔOD測(cè)低于0.05μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品的ΔOD標(biāo)，可提高樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔOD標(biāo)準(zhǔn)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔOD測(cè)定帶入方程計(jì)算出y（μmol/mL）。血清（漿）GOT的活性單位定義：每小時(shí)每mL血清樣品催化產(chǎn)生1μmol丙酮酸的量為一個(gè)GOT活力單位。GOT(U/mL)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷V樣本÷T=12y組織、細(xì)菌或細(xì)胞GOT的活性（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每小時(shí)每mg組織蛋白催化產(chǎn)生1μmol丙酮酸的量為一個(gè)GOT活力單位。GOT(U/mgprot)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(Cpr×V樣本)÷T=12y÷Cpr注意：此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每小時(shí)每g鮮重樣品催化產(chǎn)生1μmol丙酮酸的量為一個(gè)GOT活力單位。GOT(U/g鮮重)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(W×V樣本÷V樣總)÷T=12y÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每小時(shí)每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞催化產(chǎn)生1μmol丙酮酸的量為一個(gè)GOT活力單位。GOT(U/104)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(500÷V樣本÷V樣總)÷T=0.024yV樣本：樣本體積，0.005mL；VReagentⅠ：加入RegentⅠ體積，0.025mL；V樣總：ExtractionBuffer體積，1mL；W：樣本鮮重，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)量，500萬個(gè)。結(jié)果展示