1DB2201/—2021梅花鹿胚胎移植技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了胚胎移植的基本原則、前期準(zhǔn)備、胚胎移植、胚胎的冷凍保存和解凍、妊娠檢查和記錄的要求。本文件適用于梅花鹿胚胎移植。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4143牛冷凍精液3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1胚胎移植embryotransfer將良種母鹿體內(nèi)早期胚胎或體外受精及其他方式獲得的早期胚胎，移植到同種生理狀態(tài)相同的受體母鹿體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成個體的技術(shù)。3.2供體鹿donor在胚胎移植過程中提供胚胎的母鹿。3.3受體鹿recipient在胚胎移植過程中接受胚胎的母鹿。3.4同期發(fā)情synchronizationofestrus利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整母鹿的發(fā)情周期進(jìn)程，使之在預(yù)定時間內(nèi)集中發(fā)情。3.5陰道栓vaginalsuppository一種內(nèi)含孕酮、用特制的放置器將其放入陰道的同期發(fā)情裝置。3.6發(fā)情鑒定oestrusidentification對母鹿發(fā)情征狀的確定。3.7超數(shù)排卵multipleovulation2DB2201/—2021在母鹿發(fā)情周期的適當(dāng)時間，應(yīng)用外源促性腺激素處理，使卵巢比自然發(fā)情時有更多的卵泡發(fā)育并排卵，簡稱為“超排”。3.8人工授精artificialinsemination用人工方法適時將精液輸入發(fā)情母鹿生殖道內(nèi)達(dá)到受孕，以代替公母鹿交配而繁衍后代的一種繁殖技術(shù)。3.9冷凍精液frozensemen經(jīng)特殊方法處理的精液超低溫冷凍后在液氮中（-196℃)長期保存。4基本原則4.1供體和受體母鹿應(yīng)為同一屬種。4.2供體鹿和受體鹿發(fā)情時間相差不應(yīng)超過24h。4.3從供體鹿輸卵管內(nèi)收集到的胚胎應(yīng)移植到受體鹿的輸卵管內(nèi)，從供體鹿子宮角內(nèi)收集到的胚胎應(yīng)移植到受體鹿的子宮角內(nèi)。4.4胚胎發(fā)育應(yīng)處于周期黃體期內(nèi)。4.5胚胎質(zhì)量優(yōu)良，應(yīng)在處理過程中避免不良因素的影響。5前期準(zhǔn)備5.1供體鹿和受體鹿選擇5.1.1供體鹿選擇5.1.1.1品種優(yōu)良，生產(chǎn)性能好。5.1.1.2遺傳性能穩(wěn)定，譜系完整。5.1.1.3體質(zhì)健壯，無遺傳疾病、生殖疾病和傳染性疾病。5.1.1.4產(chǎn)歷清楚，無流產(chǎn)史，性周期正常，繁殖機(jī)能好，年齡在3～5周歲的成年母鹿。5.1.2受體鹿選擇5.1.2.1健康、營養(yǎng)狀況良好，無遺傳疾病、生殖疾病和傳染性疾病。5.1.2.2繁殖性能良好，發(fā)情周期正常，母性和哺乳能力良好，無流產(chǎn)史，產(chǎn)后60d以上的經(jīng)產(chǎn)母鹿，年齡應(yīng)在2～5周歲。5.1.2.3配種兩個發(fā)情周期以上不孕的母鹿不應(yīng)選作受體。5.1.2.4受體鹿的體型大小應(yīng)接近或者大于供體鹿的體型大小。5.1.3供體與受體比例供體鹿和受體鹿的比例應(yīng)為1:3～4。5.2供體鹿和受體鹿的飼養(yǎng)管理5.2.1胚胎移植前8周應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。5.2.2應(yīng)分群組群，保持受體鹿飼養(yǎng)環(huán)境的相對穩(wěn)定與衛(wèi)生，避免應(yīng)激。3DB2201/—20215.2.3應(yīng)在飼喂全價日糧飼料基礎(chǔ)上，補(bǔ)充鹽、礦物質(zhì)、維生素和微量元素，保持營養(yǎng)平衡、飲水充足，加強(qiáng)舍外活動。5.3同期發(fā)情5.3.1供體鹿在任意一天放入含有孕激素陰道栓（CIDR），12d后撤掉，同時肌肉注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）300IU～350IU。5.3.2受體鹿5.3.2.1同期處理之前應(yīng)進(jìn)行直腸觸摸或超聲波檢查，檢查卵巢是否有周期性黃體。5.3.2.2操作步驟同5.3.1。5.3.2.3同期發(fā)情處理后，密切觀察，通過直腸觸摸或超聲波檢查卵泡發(fā)育狀態(tài)，觀察發(fā)情。5.3.3發(fā)情鑒定CIDR取出后12h開始用試情公鹿每隔2h～4h試情一次，每次持續(xù)0.5h～1h。母鹿穩(wěn)定接受爬跨即為發(fā)情。記錄母鹿接受爬跨的時間。5.4供體鹿超數(shù)排卵放置CIDR當(dāng)天記為第0d，放CIDR第9d開始注射促卵泡素(FSH)，每天注射兩次間隔12h，早晚各1次，4d8次等量或減量注射。到第12d～13d結(jié)束，共注射FSH320mg。第7次注射FSH時取出CIDR。5.5人工授精5.5.1精液品質(zhì)檢查5.5.1.1新鮮精液色澤乳白色或淡黃色。精子活力≥70%，精子密度≥1.2×109mL,精子畸形率≤15%。5.5.1.2冷凍精液應(yīng)符GB4143的規(guī)定。精子活力≥30%，精子畸形率≤15%，細(xì)菌數(shù)≤800個，每管凍精的有效精子數(shù)在1000萬以上。5.2.1操作步驟a)精液準(zhǔn)備：鮮精應(yīng)稀釋使用，溫度保持在25℃左右；細(xì)管凍精應(yīng)用38℃±2℃溫水直接浸泡解凍，無需稀釋，時限1h；b)確認(rèn)母鹿發(fā)情接受爬跨后，進(jìn)行第一次輸精，間隔8h～12h重復(fù)輸精一次；c)保定母鹿，外陰應(yīng)清洗消毒；d)把精液裝入無膠塞注射器，并連接輸精管，排出空氣，若為凍精劑量為2支/頭e)抹無菌潤滑劑，手持輸精管緩慢插入母鹿陰道內(nèi)，小心通過子宮頸插入子宮體，推入精液，將輸精管緩慢退出，完成輸精。6胚胎移植4DB2201/—20216.1手術(shù)沖胚6.1.1時間應(yīng)在供體母鹿第一次配種后6d～7d。6.1.2器材套管針、沖胚管及內(nèi)芯、腸鉗夾、注射器、培養(yǎng)皿、量筒、毛剪、鑷子、手術(shù)刀、手術(shù)縫合針和縫合線、創(chuàng)布、止血紗布、體式顯微鏡、恒溫板等。6.1.3藥品新潔爾滅、0.9%生理鹽水、胚胎保存液（Holding液）、酒精、碘伏、青霉素、鏈霉素、石蠟油、麻醉藥、解麻藥等6.1.4沖胚液的配置杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS），配方參見附錄A?；蛘呤褂蒙唐窙_胚液。6.1.5步驟6.1.5.1供體母鹿應(yīng)在術(shù)前24h內(nèi)禁食禁水，手術(shù)在沖胚室進(jìn)行。6.1.5.2供體母鹿應(yīng)進(jìn)行全身麻醉，呈前低后高仰臥保定。6.1.5.3麻醉后的母鹿應(yīng)進(jìn)行術(shù)部備皮，用溫水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。6.1.5.4在腹部中線距乳房約4cm處做一切口，將兩側(cè)子宮角和輸卵管暴露，觀察左右卵巢上的黃體發(fā)育情況并記錄。6.1.5.5在子宮角基部用止血鉗穿孔，插入沖胚管，由充氣管注入5mL左右空氣，使氣囊封阻子宮腔；在子宮角和輸卵管結(jié)合部的子宮角端插入套管針，拔出針芯，將裝有沖胚液的50mL注射器接到套管針上，注入35℃~37℃的沖胚液30mL～50mL，將胚胎從子宮角的上端沖出，由沖卵管的出液孔收集于培養(yǎng)皿（直徑90mm）中，放氣后取下沖胚管。6.1.5.6將子宮角放回體內(nèi)，并用0.9%的生理鹽水進(jìn)行沖洗，并注入2mL石蠟油以防止生殖道連。6.1.5.7縫合傷口，撒抗生素（青霉素和鏈霉素并在術(shù)后的3d內(nèi)每天注射2次青霉素（8000000IU/6.2胚胎質(zhì)量鑒定6.2.1檢胚在實驗室（檢胚室）內(nèi)20℃~25℃常溫下，將沖胚后回收液平皿放在30℃的恒溫板上，置于體式顯微鏡下，劃分區(qū)域進(jìn)行檢查，檢查順序參見圖1。檢出的胚胎用吸卵器及時移入PBS中進(jìn)行鑒定，確定受精與否及胚胎發(fā)育階段。5DB2201/—20216.2.2胚胎質(zhì)量分級6.2.2.1配種后6d～7d的供體鹿，處于以下發(fā)育期：桑椹胚（M）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）或擴(kuò)張囊胚（EXB）。6.2.2.2按形態(tài)學(xué)將胚胎劃分為1、2、3、4四個等級，1、2、3級胚胎為可用胚胎，4級為不可用胚胎。a)1級：發(fā)育正常，胚齡與發(fā)育期一致，胚胎細(xì)胞團(tuán)成均勻?qū)ΨQ的球形，輪廓清晰，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，色調(diào)和透明度適中，無游離的細(xì)胞和液泡，或很少，變性細(xì)胞比例少于10%；b)2級：胚齡與發(fā)育期基本一致，輪廓清晰，分裂球大小基本一致，色調(diào)和透明度及細(xì)胞密度良好，可見到一些游離的細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞占10%～30%；c)3級：胚齡與發(fā)育期不太一致，輪廓不清晰，色調(diào)過暗或過淡，細(xì)胞密度小，結(jié)構(gòu)較松散，游離的細(xì)胞或液泡較多，變性細(xì)胞達(dá)30%～50%；d)4級：發(fā)育階段遲緩、細(xì)胞不均勻、變性細(xì)胞占胚胎大部分；未受精卵。6.3移植6.3.1器具手術(shù)刀、手術(shù)縫合針和縫合線、腹腔內(nèi)窺鏡、宮6.3.2藥品6.3.3步驟6.3.3.1受體鹿術(shù)前準(zhǔn)備同6.1.5.1、6.1.5.2和6.1.5.3的處理方法。6.3.3.2在乳房前方腹中線兩側(cè)各切開一個0.5cm～1cm長的小口，一側(cè)插入打孔器和腹腔鏡，另一側(cè)插入宮頸鉗。通過腹腔鏡和宮頸鉗相互配合觀察受體鹿的卵巢狀態(tài)，記錄黃體數(shù)目。6.3.3.3將卵巢上有1～3個黃體側(cè)的子宮角取出，在子宮角的上1/3部位穿刺，連接上結(jié)合有1mL注射器的移植套管針。6.3.3.4將含有1～2枚胚胎的0.3mL～0.5mL的Holding液，通過1mL注射器注入子宮角，緩慢拔出移植套管針。6.3.3.5受體鹿左右創(chuàng)口各縫1針，外涂5%碘酊。6.3.3.6移植后肌肉注射黃體酮。6DB2201/—20217胚胎的冷凍保存和解凍7.1冷凍保存7.1.1器具實體顯微鏡、胚胎冷凍儀、液氮罐、細(xì)管、胚胎吸管、0.22μm過濾器、培養(yǎng)皿、記號筆等。7.1.2保存液與冷凍液7.1.2.1保存液：含有20%犢牛血清(CS)的PBS液。7.1.2.2冷凍液：8%乙二醇（EG0.1mol/L海藻糖（Tre.m-PBS＋20%CS，用0.22μm濾器過濾滅菌分裝。7.1.3胚胎裝管胚胎應(yīng)在保存液微滴中清洗4次，后在冷凍液微滴中清洗4次。將胚胎吸入0.25mL細(xì)管內(nèi)，用封口機(jī)封口、分類、標(biāo)記，在4℃的冰箱內(nèi)放置平衡10min～15min后放入冷凍儀。7.1.4胚胎冷凍保存胚胎冷凍儀溫度降至-6℃~-7℃,保持2min后進(jìn)行人工植冰，繼續(xù)保持至10min，以0.3℃/min的速率降溫至-35℃~-38℃,保持10min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期檢查和加液氮。7.2解凍從液氮中取出裝有胚胎的細(xì)管，空氣浴6s后32℃~35℃水浴10s，用消毒紙擦干細(xì)管，再用半干的酒精棉球擦拭細(xì)管表面，晾干，剪開細(xì)管封口端(如用細(xì)管塞封口的則拔出即可)，細(xì)管棉塞端朝里裝入移植槍供移植。應(yīng)在解凍后10min內(nèi)完成移植。8妊娠檢查應(yīng)在移植結(jié)束后90d采用超聲波法檢查，確認(rèn)母鹿是否懷孕以及胎兒發(fā)育情況。9記錄胚胎移植過程中應(yīng)記錄供體鹿超數(shù)排卵、輸精、沖胚、受體鹿移植情況,記錄內(nèi)容可參考附錄B。7DB2201/—2021杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）配方A.1杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）配方表A.1杜氏磷酸鹽緩沖液（PB