ICS11.220CCSB41CellularimmunoassaysforPorcineReproductiveandRespiratorySyn在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。IDBXX/TXXXX—XXXX I 22規(guī)范性引用文件 23術(shù)語、定義和縮略語 24原理 45試劑及儀器 46檢測 47最終結(jié)論判定 6附錄A豬PBMC制備所需試劑和材料 7附錄B流式細胞術(shù)檢測所需試劑和材料 8附錄C檢測所需儀器 9附錄D檢測所需試劑配置 附錄E陰性對照制備 附錄F陽性對照制備 IDBXX/TXXXX—XXXX為規(guī)范豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞免疫檢測技術(shù)規(guī)范（MHC-肽四聚體），特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本文件按GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由江蘇立華牧業(yè)股份有限公司提出。本文件由江蘇省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：江蘇立華牧業(yè)股份有限公司、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、立華南京農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院有限公司。本文件起草人：張海濤、張雪寒、羅燕、李彬、張雙玉、尹麗萍、丁小燕、趙永祥。2DBXX/TXXXX—XXXX豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞免疫檢測技術(shù)規(guī)范（MHC-肽四聚體）本文件規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒細胞免疫檢測技術(shù)（MHC-肽四聚體）的試劑及儀器、檢測方法、質(zhì)量控制和結(jié)果判定等。本文件適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗免疫效力評價、豬群馴化效果評估和病毒感染的早期診斷。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T18090—2023豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法GB/T39730—2020細胞計數(shù)通用要求流式細胞測定法下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1術(shù)語和定義3.1.1細胞染色cellstaining細胞特定成分與熒光染料或標(biāo)記了熒光染料的特異性抗體結(jié)合后進行檢測的一種技術(shù)。注：特定成分為蛋白質(zhì)、DNA、RNA。3.1.2主要組織相容性復(fù)合體majorhistocompatibilitycomplex,MHCMHC是一組編碼動物主要組織相容性抗原的基因群的統(tǒng)稱。MHC分子在免疫系統(tǒng)中起著識別和呈遞抗原肽的作用。3.1.3豬白細胞抗原swineleukocyteantigen,SLA豬的MHC在遺傳學(xué)中被稱為SLA，SLA-I類分子介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，其基因是重鏈(α鏈）與輕鏈β2微球蛋白(β2m）以非共價結(jié)合而構(gòu)成的糖蛋白，其α鏈具有多態(tài)性，但β2m是單態(tài)的。SLAI類分子的α鏈、β2m及病毒多肽在細胞內(nèi)可以形成復(fù)合體，遞呈到細胞表面被CD8+T淋巴細胞受體識別，引起CTL免疫應(yīng)答，有利于機體清除病毒，抵抗疾病。3DBXX/TXXXX—XXXX3.1.4肽peptide由氨基酸組成的短鏈蛋白質(zhì)分子。在MHC肽四聚體技術(shù)中，特定長度的抗原肽（9-15個氨基酸）與MHC分子結(jié)合形成復(fù)合物。3.1.5四聚體tetramer由四個相同的單體分子組成的結(jié)構(gòu)。在MHC-肽四聚體技術(shù)中，通過將MHC分子與特定抗原肽結(jié)合，形成四聚體結(jié)構(gòu)，使用流式細胞儀分析特定抗原肽與T細胞受體的相互作用。通過結(jié)合特定T細胞亞群和熒光信號的檢測，定量測定與MHC-肽四聚體結(jié)合的T細胞比例。3.1.6外周血單個核細胞peripheralbloodmononuclearcell,PBMC血液中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞和少量其他類型細胞。3.1.7T淋巴細胞Tlymphocyte簡稱T細胞，是由來源于骨髓的淋巴干細胞，在胸腺中分化、發(fā)育成熟后，通過淋巴和血液循環(huán)而分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能。T細胞亞群是細胞免疫的主要免疫應(yīng)答形式。3.1.8CD3+T淋巴細胞CD3分子是T淋巴細胞的重要標(biāo)志。3.1.9細胞毒性T淋巴細胞CytotoxicTlymphocyte，CTLCD8+是細胞毒性T淋巴細胞的標(biāo)志。3.1.10T細胞受體Tcellreceptor,TCRT細胞表面能特異性識別和結(jié)合抗原肽的結(jié)構(gòu)。3.1.11生物素蛋白連接酶Biotin-proteinligaseA,BirA用于催化生物素化反應(yīng)，將生物素連接到特定的蛋白上。3.1.12鏈霉親和素Streptavidin鏈霉親和素作為一種結(jié)構(gòu)性染料，由四條相同的肽鏈組成。鏈霉親和素分子的特點是能夠與生物素形成特異性的高親和力結(jié)合。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件PMT：光電倍增管（Photomultipliertube）FSC：前向角散射光（ForwardScatter），F(xiàn)SC的值能代表細胞的大小，細胞的體積越大，其FSC就越大。SSC：側(cè)向散射光（SideScatter），SSC則代表細胞的顆粒度，細胞不規(guī)則，細胞內(nèi)細胞器和顆粒度越大，則SSC越大。FITC：異硫氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanateisomer）R-PE：藻紅蛋白（R-phycoerythrin）APC：別藻藍蛋白（Allophycocyanin）4DBXX/TXXXX—XXXXAlexaFluor647：是一種明亮且可感光的遠紅色染料，與APC激發(fā)波長類似，可互為替換使用PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）FACS：流式細胞熒光分選技術(shù)（Fluorescenceactivatingcellsorter）DMSO：二甲基亞砜（dimethylsulfoxide）PRRS：豬繁殖和呼吸綜合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome）PRRSV：豬繁殖和呼吸綜合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus）MHC-肽四聚體技術(shù)（簡稱pMHC-Tetramer）是檢測病原體或腫瘤等特異性T細胞的一種具有重要應(yīng)用價值的技術(shù)，是目前檢測抗原特異性CTL的金標(biāo)準(zhǔn)。四個MHC-肽復(fù)合物（pMHC）通過生物素蛋白連接酶（BirA）-鏈酶親和素系統(tǒng)組裝成pMHC-Tetramer，顯著增強MHC-肽復(fù)合物與TCR的結(jié)合力，借助流式細胞儀的檢測，具有高靈敏性和高特異性。流式細胞儀通過目標(biāo)細胞光學(xué)（散射光和熒光）特性，直接得到待測樣本中不同熒光標(biāo)記的目標(biāo)細胞的數(shù)量和它們之間的比例。豬PBMC制備所需試劑和材料參見附錄A。流式細胞術(shù)檢測所需試劑和材料參見附錄B。檢測所需儀器參見附錄C。6.1試劑配置檢測所需試劑配置參見附錄D。6.2陰性對照和陽性對照制備制備所需試劑、材料和方法參見附錄E和F。6.3樣品采集與處理6.3.1無菌采集豬前腔靜脈血2~3mL，加入到含有肝素鋰或者肝素鈉的真空抗凝管中，輕輕顛倒2-3次使血液與抗凝劑充分混勻，低溫冷藏運送到實驗室，并盡快分離PBMC。6.3.2參照市售豬外周血淋巴細胞分離液試劑盒說明書操作。具體操作：抗凝血2~3mL，與稀釋液1:1等體積混勻、離心、用吸管小心吸取第二層白色單核細胞層至新離心管內(nèi)，加入試劑盒的洗滌液或者PBS，洗滌2~3次。最后的細胞泥，重懸于PBS中，進行細胞計數(shù)。所獲得新鮮PBMC應(yīng)立即使用或分裝后凍存。6.3.3PBMC凍存方法：細胞凍存液重懸6.2.2所得細胞泥，并輕輕吹打混勻，使用細胞凍存管分裝，每管1mL，放-70℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮中保存。液氮保存不同批次的PBMC做好標(biāo)記，不要混淆。5DBXX/TXXXX—XXXX6.3.4PBMC立即使用時，細胞泥使用FACS液重懸，可4℃暫存，盡快進行樣品染色。6.4樣品染色6.4.1細胞染色前，測定細胞濃度，一般控制在每個待測樣本106個細胞為佳，離心收獲細胞沉淀備用。6.4.2根據(jù)流式細胞儀性能參數(shù)，設(shè)置合適的體積，100uL-200uL為佳。根據(jù)抗體濃度和檢測樣本數(shù)量，首先將FITCmouseanti-pigCD3+、APCmouseanti-pigCD8a和PE-pSLA-Tetramer三種抗體按照一定比例稀釋，配置成含有三種抗體的FACS染色混合液，再分別重懸上述細胞沉淀，充分震蕩混勻，4℃避光孵育30min-60min，然后離心收獲細胞沉淀，1mLFACS洗滌2次，細胞沉淀重懸于適量FACS洗滌液中，盡快上機分析。如果無法盡快上機檢測，可將染色后細胞使用1%-2%多聚甲醛固定，4℃-8℃避光保存，一周內(nèi)盡快上機檢測。6.5流式細胞術(shù)檢測6.5.1根據(jù)流式細胞儀的儀器說明書設(shè)置儀器的工作條件，包括環(huán)境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力，環(huán)境光照等。6.5.2每次開機后，對流式細胞儀進行清洗、光路系統(tǒng)進行校驗，可參照流式細胞儀的校驗參數(shù)檢測FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強度，變異系數(shù)和熒光分辨率。6.5.3應(yīng)設(shè)置空白對照（即未染色PBMC對照）、陰性對照（分離自PRRSV抗原抗體陰性豬的PMBC染色對照）和單染管對照（FITCmouseanti-pigCD3+、APCmouseanti-pigCD8a和PE-pSLA-Tetramer三種抗體分別染色PBMC對照），用于識別目標(biāo)細胞和確定染色方案是否正確。6.5.4樣本間隔上樣，應(yīng)設(shè)置使用清洗液進行清洗。6.5.5根據(jù)使用的熒光染料設(shè)定閾值和電壓。6.5.6采用兩種及以上染料組合方案進行染色時，需要進行熒光補償。6.5.7與陰性對照對比，通過相應(yīng)散點圖中的熒光強度表達，區(qū)分出目標(biāo)細胞的陽性信號并進行圈門。6.5.8應(yīng)在進樣穩(wěn)定后開始采集信號。有效細胞信號采集數(shù)量不低于10,000個細胞。信號采集時間應(yīng)保持在合理范圍內(nèi)，過長細胞發(fā)生聚集或沉降。6.5.9專用軟件分析流式細胞儀數(shù)據(jù)，一般為FlowJo軟件，只是版本號不同，優(yōu)先使用高版本號軟件。首先FSC/SSC雙參數(shù)獲得單核淋巴細胞的百分比，再根據(jù)FITC-CD3+/SSC雙參數(shù)獲得CD3+T淋巴細胞細胞百分比，然后再根據(jù)APC-CD8+/FITC-CD3+雙參數(shù)獲得CD3+CD8+雙陽的T淋巴細胞細胞的百分比，最后再根據(jù)APC-CD8+/PE獲得CD8+/pSLA+雙陽的T淋巴細胞的百分比，即抗原特異CTL細胞的百分比。6.6操作注意事項6.6.1由于需要活的淋巴細胞，因此需要使細胞損傷降到最低?？鼓疃嘣?-8℃保存48h。6.6.2分離后PBMC如不能及時檢測，參常規(guī)細胞凍存，保存到液氮，最多1個月。應(yīng)在管子側(cè)壁標(biāo)記好管內(nèi)容物、日期、動物編號等相關(guān)信息。檢測前，樣品從液氮取出快速解凍，離心獲得細胞，洗滌后參照6.3步驟進行細胞染色。6.6.3細胞染色操作、染色后樣品保存和上機過程均應(yīng)避光，避免酶標(biāo)抗體熒光淬滅。6.6.4待上機樣品過多時，注意低溫避光保存。6DBXX/TXXXX—XXXX7.1在判定結(jié)果前必須檢查對照樣品的結(jié)果：空白對照，用以排除細胞自發(fā)熒光背景，設(shè)置最佳的PMT電壓。單染管對照，設(shè)置最佳的熒光補償。陰性對照，設(shè)置圈門界限，CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞的百分比范圍0%~10%。如有一標(biāo)準(zhǔn)不符合，結(jié)果是無效的，需重新檢測和分析。7.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞百分比為比較對象。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢樣品CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞百分比()≥2陰性對照CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞百分比陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢樣品CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞百分比<2陰性對照CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞百分比7DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）豬PBMC制備所需試劑和材料A.1肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；A.25mL或10mL動物采血器；A.310mL或15mL透明無菌離心管；A.4一次性巴氏吸管；A.5200μL、1000μL無菌長槍頭；A.6可放置10mL或15mL離心管的試管架；A.7用于儲存最終分離的PBMC的1.5mL無菌離心管；A.8可放置1.5mL離心管的板架。A.9細胞凍存管A.10豬外周血單核細胞分離液（商品化購買）A.11無菌PBS緩沖液A.12細胞凍存液，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按照5:4:1比例配置8DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）流式細胞術(shù)檢測所需試劑和材料B.1與流式細胞儀匹配的流式管；B.2用于覆蓋1.5mL離心管板架或流式管的錫箔紙，避光用途；B.3FACS洗滌液（含有0.1%疊氮鈉和0.1%BSA的PBS緩沖液）B.4鞘液（無熒光本底的平衡電解質(zhì)溶液，可是常規(guī)PBS緩沖液、無菌雙蒸水或商品化購買）；B.5無菌純水，用于稀釋鞘液；B.6流式抗體（FITCmouseanti-pigCD3+,0.5mg/mL；APC/AlexaFluor647mouseanti-pigCD8a，0.2mg/mL；購買自BDPharmingen公司）B.7MHC四聚體（PE-pSLA-Tetramer，立華南京農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院有限公司提供）9DBXX/TXXXX—XXXX（資料性）檢測所需儀器C.1流式細胞儀；C.2精密可調(diào)移液器，200μL、1000μL；C.3100mL、1L的量筒；C.4可控溫離心機；C.5生物安全柜（可選）；DBXX/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）檢測所需試劑配置D.1PBS緩沖液（0.01M，pH7.2）配置的三種方式商品化購買PBS儲液（20×),使用無菌純水稀釋至1×工作濃度使用；商品化PBS粉末，使用無菌純水配置成1×工作濃度，高壓后使用；0.2g磷酸二氫鉀（KH2PO4）。D.2FACS洗滌液（含有0.1%疊氮鈉和0.1%BSA的PBS緩沖液）商品化購買，無菌純水稀釋至1×工作濃度使用；實驗室自行配置1×工作濃度FACS（含有0.1%疊氮鈉和0.1%BSA的PBS緩沖液）。D.3鞘液可商品化購買，無菌純水稀釋至1×工作濃度使用；可使用無菌的1×工作濃度PBS緩沖液；可使用無菌雙蒸水。D.4流式檢測用酶標(biāo)抗體和流式抗體稀釋液酶標(biāo)抗體必須一直保存在2~8℃。使用FACS稀釋酶標(biāo)抗體，按照下表配置酶標(biāo)抗體工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，未用完的試劑應(yīng)丟棄。未用完的酶標(biāo)抗體應(yīng)立即放回至2~8℃條件下保存。酶標(biāo)抗體工作液配置待檢樣品個數(shù)（細胞數(shù)）酶標(biāo)抗體體積酶標(biāo)抗體稀釋液體積6）FITCmouseanti-pigCD3+（0.5mg/mL），1uL；APC/AlexaFluor647mouseanti-pigCD8a（0.2mg/mL），2uL；PE-pSLA-Tetramer（0.4mg/mL），1uL。196μLDBXX/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）陰性對照制備E.1PRRSV抗原和抗體雙陰性豬的篩選參照豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法（GB/T18090—2023）定量PCR和ELISA操作規(guī)范和結(jié)果判定。E.2豬外周血的采集使用5mL或10mL注射器，前腔靜脈采血，避免溶血，盡快轉(zhuǎn)移到肝素鈉或肝素鋰抗凝管中，不要使用EDTA相關(guān)抗凝試劑或抗凝管。低溫運送到實驗室，2-8℃短暫保存，盡快分離。E.3豬外周血淋巴細胞（PBMC）的分離參照商品化豬外周血淋巴細胞分離試劑盒的操作步驟進行，如果有紅細胞污染，使用商品化紅細胞裂解液按照說明書推薦比例和操作規(guī)范進行。如果未能及時染色進行流式分析，可凍存。E.4細胞凍存液配置RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按照5:4:1比例配置。E.5PBMC的凍存取濃度為≈107/mL的細胞泥，加入細胞凍存液，輕輕吹打混勻，分裝到細胞凍存管，1mL/管，放-70℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮中保存。液氮保存不同批次的PBMC，標(biāo)記清楚，不要混用。E.6PBMC的復(fù)蘇從液氮中取出冷凍細胞管，立即投入溫水（37℃左右）中迅速解凍。將細胞轉(zhuǎn)移入10倍量的RPMI1640液（pH7.2）中，1,000r/mim離心10min，棄上清，沉淀的細胞使用FACS液體重懸，計數(shù)，稀釋到要求的細胞濃度后，即可使用。E.7PBMC的染色根據(jù)抗體濃度和檢測樣本數(shù)量，首先將FITCmouseanti-pigCD3+、APCmouseanti-pigCD8a和PE-pSLA-Tetramer三種抗體按照一定比例稀釋，配置成含有三種抗體的FACS染色混合液，再分別重懸上述細胞沉淀，充分震蕩混勻，4℃避光孵育30min，然后離心收獲細胞沉淀，1mLFACS洗滌2次，細胞沉淀重懸于適量FACS洗滌液中，盡快上機分析。E.8結(jié)果判定流式細胞檢測，設(shè)置圈門界限，CD8+/pSLA+-tetramer雙陽的T淋巴細胞的百分比范圍0%~10%，判定為陰性對照成立。DBXX/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）陽性對照制備E.1PRRSV疫苗免疫豬使用商品