第十三章

PCR基因擴(kuò)增儀器

(polymerasechainreactionGeneAmplifier)1內(nèi)容提要1.PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理

PCR技術(shù)的原理及發(fā)展PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理

2.PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)

定性PCR擴(kuò)增儀實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀3.

PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程及常見故障的排除

PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程PCR擴(kuò)增儀常見故障的排除4.PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用2第一節(jié)

PCR基因擴(kuò)增儀工作原理

一、PCR技術(shù)的歷史發(fā)展及原理

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。在它發(fā)明以前，對于檢測對象濃度非常低的標(biāo)本，人們沒有辦法用常規(guī)方法測定。

1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。它推動了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)由細(xì)胞水平向分子水平、基因水平發(fā)展，是DNA測序的基礎(chǔ)，它成為現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展過程中的一座里程碑。3PCR技術(shù)是在試管中（體外）給DNA的合成提供一種合適條件--模板DNA、dNTP、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系，及讓DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度和時間，使DNA能夠體外復(fù)制。Mullis等因此項技術(shù)獲得1993年諾貝爾獎。4PCR原理及其步驟：加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下加入的引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個循環(huán)，待測樣本中的核酸拷貝數(shù)呈指數(shù)級擴(kuò)大。5其過程1：加熱變性加熱（通常93℃左右）可將雙鏈DNA分為兩條單鏈，稱之為“變性”。

因為連接堿基之間的氫鍵較弱，它們在高溫下斷裂，而脫氧核糖和磷酸之間的共價鍵結(jié)合力較強(qiáng)，在高溫下保持不變。

6過程2

退火，引物與靶序列結(jié)合引物是短的、人工合成的單鏈DNA序列，有20-30個堿基，具有標(biāo)記的5’端，便于下一步檢測。它們對于待擴(kuò)增的靶核酸是特異的。PCR反應(yīng)需有兩條引物，每一條都與變性過程中產(chǎn)生的DNA單鏈互補(bǔ)。退火溫度：通常在40-65℃進(jìn)行，視引物的長度和堿基序列而定。這樣保證了引物與靶序列退火結(jié)合的高度特異性。

注意：PCR反應(yīng)并不是復(fù)制整個DNA鏈，而是復(fù)制某一段生物體特異的100-600個堿基對的靶序列。78過程3：延伸一旦引物與互補(bǔ)DNA序列退火，溫度即提高至近72℃，TaqDNA聚合酶被用于復(fù)制DNA鏈。TaqDNA聚合酶是一種來源于嗜熱水生菌（Thermusaquaticus）的重組的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，與一般聚合酶不同的是在高溫狀態(tài)仍具有活性。TaqDNA聚合酶在引物標(biāo)記的地方開始合成。它使溶液中自由的互補(bǔ)核苷酸（dNTPs）的摻入和結(jié)合，合成與目標(biāo)DNA區(qū)域原始雙鏈一樣的新的雙鏈DNA分子。延伸通常起始于引物的3’端，從而使得單鏈變?yōu)殡p鏈。TaqDNA聚合酶特定地從5’端到3’端合成。因此，溶液中的自由的核苷酸僅加于引物的3’端，形成靶DNA序列的互補(bǔ)鏈。

91030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量

---（10億）11二、PCR核酸擴(kuò)增儀工作原理與控溫方式在PCR反應(yīng)中需以變性、退火、延伸三種溫度為一個循環(huán)，因此，設(shè)計PCR基因擴(kuò)增儀就要能精確控制溫度，這對PCR反應(yīng)十分關(guān)鍵。TaqDNA聚合酶的應(yīng)用大大提高了PCR的效率，無需在PCR反應(yīng)過程中反復(fù)加入新鮮酶。TaqDNA聚合酶酶促反應(yīng)最適溫度為70～75℃。最早的PCR是利用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段進(jìn)行核酸擴(kuò)增。問題是該酶不耐熱，當(dāng)樣品置于高溫(94～95℃)條件下時不可逆失活，故在退火及延伸時，需再向反應(yīng)液中加入新鮮酶以供擴(kuò)增所需，相當(dāng)繁瑣。12PCR儀溫度控制，有：水浴鍋控溫壓縮機(jī)控溫

半導(dǎo)體控溫

離心式空氣加熱控溫

PCR溫度控制重要性：從PCR反應(yīng)基本原理可知，基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。

13水浴鍋控溫以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。樣品與水直接無縫接觸，控溫準(zhǔn)確，溫度均一性好，無邊緣效應(yīng)。體積大，自動化程度不高，需人為干預(yù)，更換水浴鍋時控溫不穩(wěn)定。14壓縮機(jī)控溫由壓縮機(jī)自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫較水浴鍋方便，一臺機(jī)器便可完成整個PCR流程。但壓縮機(jī)故障率高，邊緣效應(yīng)及溫度overshooting現(xiàn)象嚴(yán)重。overshooting：升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導(dǎo)體、金屬塊本身會積蓄能量，雖然溫度探頭探測溫度到達(dá)了設(shè)定溫度，但這些積蓄的能量仍然會傳給PCR體系，造成實際的溫度高于設(shè)定的溫度的現(xiàn)象。15半導(dǎo)體控溫由半導(dǎo)體自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。缺點：仍有邊緣效應(yīng)，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴(kuò)增效率可能不一致，也存在溫度overshooting現(xiàn)象。16離心式空氣加熱控溫由金屬線圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介，溫度均一性好，各孔擴(kuò)增效率高度一致滿足熒光定量PCR的高要求，直接發(fā)展為離心式的定量PCR儀。17第二節(jié)

PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)一、PCR擴(kuò)增儀的種類

普通PCR擴(kuò)增儀

實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀

梯度PCR儀

原位PCR儀

18一、普通定性PCR擴(kuò)增儀特點變溫快、時間準(zhǔn)、溫度均一，目前國內(nèi)仍有應(yīng)用。儀器一般由三個不同溫度的水浴槽和機(jī)械臂組成，采用半導(dǎo)體傳感技術(shù)、電子技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)進(jìn)行水浴溫度的測量、顯示和控制，并經(jīng)計算機(jī)控制由機(jī)械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。191．水浴式PCR儀一般由三個不同溫度的水浴槽和機(jī)械臂組成，采用半導(dǎo)體傳感技術(shù)、電子技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)進(jìn)行水浴溫度的測量、顯示和控制，并經(jīng)計算機(jī)控制由機(jī)械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。此類PCR儀體積較大，但變溫快、時間準(zhǔn)、溫度均一，目前國內(nèi)應(yīng)用較少。2、變溫金屬塊式PCR儀：中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數(shù)目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管。一般通過半導(dǎo)體加熱和冷卻，并由微機(jī)控制恒溫和冷熱處理過程

。裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。

203、變溫氣流式PCR儀這類儀器由機(jī)殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。熱源由電阻元件和吹風(fēng)機(jī)組成，形成熱空氣槍借空氣作為熱傳播媒介，由大功率風(fēng)扇及制冷設(shè)備提供外部冷空氣制冷，精確的溫度傳感器構(gòu)成不同的溫度循環(huán)。該儀器不用金屬精密加工，成本較低；整個系統(tǒng)沒有液體流動及制冷劑，安全程度高。PCR儀配上微機(jī)和軟件，可靈活編程。

214．梯度PCR儀由普通PCR儀衍生出的具溫度梯度功能的PCR核酸擴(kuò)增儀。使用梯度PCR儀，多種變性溫度和延伸溫度可在一臺擴(kuò)增儀上同時完成，既節(jié)省實驗時間、提高實驗效率，又節(jié)約實驗成本。PCR反應(yīng)能否成功，退火溫度是關(guān)鍵，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算最合適的退火溫度，可是模板中堿基的組合千變?nèi)f化，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定都合適。梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，一步就可以摸索出最適反應(yīng)條件。

225．原位PCR儀即在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而組織細(xì)胞的形態(tài)不被破壞，它是原位雜交與PCR技術(shù)的結(jié)合。以往手工方法操作復(fù)雜，擴(kuò)增效果及實驗結(jié)果重復(fù)性均不理想。原位PCR儀以其創(chuàng)新的設(shè)計，比較好地解決了這些問題。原位PCR儀與普通PCR儀的區(qū)別在于，其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內(nèi)可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導(dǎo)極佳，控溫很精確。目前也有在普通PCR儀上增加原位PCR模塊的，就可以進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增。不少廠家的PCR儀都可以提供原位適配器，配有支持原位PCR模塊的PCR儀可以一機(jī)兩用，比較經(jīng)濟(jì)。

23（二）實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀熒光實時定量PCR技術(shù)（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。定量PCR儀通常由兩部分組成，即PCR系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)。目前的主流是多色多通道檢測，通道及適用熒光素越多，儀器的適用范圍就越寬。

24TaqMan實時熒光定量PCR原理25261、金屬板式實時定量PCR儀

即傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀，由第三代的半導(dǎo)體PCR儀發(fā)展而來。在原有PCR儀的基礎(chǔ)上，增加熒光激發(fā)和檢測模塊，升級為熒光定量PCR儀。

ABI7500型熒光定量PCR儀的激發(fā)光源為鹵鎢燈，與5色濾光鏡配合，可同時激發(fā)96個樣品；檢測器為超低溫CCD成像系統(tǒng)，可同時多點多色檢測，能有效分辨FAM/SYBRGreenI、VIC/JOE、NED/TAMRA/Cy3等多種熒光染料。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計軟件PrimerExpress可以設(shè)計定量PCR所需的TaqMan探針。27各型號均有實時動態(tài)和終點讀板(PlateRead)兩種模式，實時動態(tài)模式能動態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量線性范圍大于9個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度可達(dá)99.7%，用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)。終點讀板模式可用于點突變檢測、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因型鑒定等。增強(qiáng)的7900型在96孔模塊的基礎(chǔ)上可更換384孔模塊，大大增強(qiáng)儀器高通量處理數(shù)據(jù)的能力。該類儀器還可作為普通PCR儀使用，有的甚至帶梯度功能，可容納的樣本量大，無需特殊耗材。缺點溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致。28ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀292、離心式實時定量PCR儀它為滿足定量PCR對溫度的高要求而設(shè)計，克服了孔板式PCR儀固有的溫度均一性較差的問題。它的擴(kuò)增樣品槽被設(shè)計為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱，以空氣為加熱介質(zhì)，實現(xiàn)與反應(yīng)體系無縫接觸，加熱均勻，接觸面積大。轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，每個孔均等位，使每個樣品孔間的溫度差小于±0.01℃，保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間反應(yīng)條件的一致性。儀器激發(fā)光源大多采用使用壽命較長的發(fā)光二極管(light-emittingdiode，LED)冷光源，運(yùn)行前無需預(yù)熱，無需校正。由于樣品置于轉(zhuǎn)子上可移動，所以儀器使用同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差，定量線性范圍可達(dá)10個數(shù)量級。但這類儀器離心轉(zhuǎn)子小，可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能。30Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

31LightCycleTM熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

323、各孔獨立控溫的定量PCR儀這種定量PCR儀設(shè)計非常獨到，不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測，但目前在國內(nèi)應(yīng)用尚少。儀器有16個樣品槽，每個溫控模塊控制一個樣品槽，可以在同一臺定量PCR儀上分別進(jìn)行不同條件的定量PCR反應(yīng)，隨時利用空置的樣品槽開始其他定量反應(yīng)，使用效率非常高。升降溫速度高達(dá)10℃／s，控溫精度也高。每個模塊獨立控制的激發(fā)光源和檢測器直接與反應(yīng)管壁接觸，保證熒光激發(fā)和檢測不受外界干擾。

33該儀器整合成4通道光學(xué)檢測系統(tǒng)，能有效分辨FAM/SYBRGreenI、Tet/Cy3、TexasRed和Cy5等多種熒光染料，可對同一樣品進(jìn)行多靶點分析，同時檢測四種熒光信號?？墒褂肨aqman探針、分子信標(biāo)、Amplifluor引物等多種檢測方法，定量線性范圍可達(dá)9個數(shù)量級。其軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運(yùn)用，還可實現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。不足上樣不如傳統(tǒng)方法方便，需要獨特的扁平反應(yīng)管，成本高。34SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀35第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程及常見故障的排除

一、PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)（一）溫度控制

它是PCR反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵。包括：1、溫度的準(zhǔn)確性：指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性。PCR是一個指數(shù)級擴(kuò)增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，尤其是退火溫度。擴(kuò)增過程中退火溫度的細(xì)微變化會被放大，直接影響結(jié)果。

對PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。362、溫度的均一性：是指樣品孔間的溫度差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性。實驗過程中有這樣的情況：用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，最后的結(jié)果差異非常明顯，這就可能是因為不同樣品孔的溫度不均一性所致。如果PCR儀的溫度均一性不佳，會影響實驗結(jié)果，尤其是最外周的樣品孔，即位置“邊緣效應(yīng)”影響結(jié)果重復(fù)性。上圖為同一個標(biāo)本重復(fù)測定96次的擴(kuò)增曲線均一性例子373、升降溫的速度：升降溫速度快，可以提高工作效率，提高PCR反應(yīng)特異性，降低非特異性。所以目前PCR擴(kuò)增儀的溫控方式已經(jīng)從以前相對穩(wěn)定耐用的壓縮機(jī)轉(zhuǎn)向了升降溫速度更快的半導(dǎo)體。此外，制作承托樣品管的基座模塊材料的導(dǎo)熱性也影響升降溫速度。例如，有升降溫速度高達(dá)5℃／s的銀質(zhì)鍍金基座，還有升降溫速度可達(dá)6℃／s和4.5℃／s的銀質(zhì)模塊。由于樣品管與基座接觸的緊密性、基座的導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。所以儀器的升降溫速度和樣品管中樣品的升降溫速度并非一回事。38目前PCR儀一般都具有模塊溫控模式(block-control)和反應(yīng)管溫控模式(tube-control)。前者，是儀器控制承載樣品的金屬基座溫度，它由探測器直接探測基座，該模式適用于長時間的靜態(tài)孵育，如連接、酶切、去磷酸化等。后者，是儀器對樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制，由計算機(jī)在反應(yīng)管溫控模式下根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度計算出。后者一般更準(zhǔn)確，因為反應(yīng)管溫控模式精確的算法能自動補(bǔ)償時間，確保反應(yīng)混合物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度，適合各種類型的反應(yīng)管。394、不同模式下的相同溫度特性：主要針對梯度PCR儀而言?，F(xiàn)在的PCR儀已可以進(jìn)行不同功能模式的轉(zhuǎn)換。帶梯度功能的PCR儀，不僅考慮梯度模式下不同梯度管間溫度的均一性和準(zhǔn)確性，還考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。否則可能導(dǎo)致在梯度模式下得到最佳反應(yīng)條件，并以此條件在標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨做，但結(jié)果卻不如人意?，F(xiàn)在已能以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度，因而在梯度模式下具有恒定的溫度，保證在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下相同的溫度特性。405、熱蓋溫度目前的PCR儀都帶有熱蓋，可使樣本管頂部溫度達(dá)到105℃左右（控制溫度一般為30~110℃），避免蒸發(fā)的反應(yīng)液凝集于管蓋而改變PCR反應(yīng)體積，無需再向反應(yīng)管內(nèi)添加石蠟油，減少了后續(xù)實驗的麻煩。41（二）熒光檢測1．Ct值重復(fù)性誤差在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念-Ct值（cycle

threshold），其含義是，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。模板的Ct值與它的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，因此，Ct值重復(fù)性誤差對核酸定量的可靠性和正確性十分重要，一般要求CV≤2.5%。2．熒光檢測范圍由于PCR是一個指數(shù)級擴(kuò)增的過程，不同的起始拷貝數(shù)經(jīng)過幾十個循環(huán)后，其熒光差別十分巨大，因此，熒光檢測范圍一般要求達(dá)到101～1010DNA(RNA)copy/ml，這是熒光儀的重要指標(biāo)。3．儀器檢測通道數(shù)量復(fù)合PCR實驗已成為一種流行趨勢，它能節(jié)省試劑和時間，在短時間內(nèi)獲得結(jié)果，因此要求儀器具備多通道檢測能力。目前以4通道檢測的居多，部分儀器具有6個檢測通道。42（三）其他

1．樣品基座容量和樣品數(shù)多數(shù)PCR儀配備了可更換的多樣化樣品基座，以匹配不同規(guī)格的樣品管(0.2、0.5mlPCR管；8、12聯(lián)排管；96孔微孔板等)，常用0.2ml×96孔。有的PCR儀，同一個樣品基座有不同規(guī)格的樣品孔，無需更換基座即可分別使用不同規(guī)格的樣品管，但不同反應(yīng)管不能同時使用，因高度不同，