第八章酶的定向進(jìn)化天然酶得局限:酶催化得精確性和有效性常常不能很好地滿(mǎn)足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用得要求而且天然酶得穩(wěn)定性差、活性低使催化效率很低還缺乏有商業(yè)價(jià)值得催化功能,尤其就是對(duì)一些非天然底物具有惰性在非水環(huán)境下得低活力對(duì)輔酶得依賴(lài)等能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同得底物甚至就是自然界不存在得合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物得原材料現(xiàn)代生物工程得要求如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單得方法以達(dá)到對(duì)天然酶得改造或構(gòu)建新得非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景試管中得進(jìn)化就是生物工程得未來(lái)——諾貝爾獎(jiǎng)獲得者

M、Eigen內(nèi)容簡(jiǎn)介酶定向進(jìn)化簡(jiǎn)介:基本原理、研究歷史定向進(jìn)化得策略:無(wú)性進(jìn)化、有性進(jìn)化、同源重組基因文庫(kù)得構(gòu)建與篩選:考慮要素、構(gòu)建策略、構(gòu)建載體系統(tǒng)、文庫(kù)篩選定向進(jìn)化應(yīng)用定向進(jìn)化優(yōu)勢(shì)、現(xiàn)狀和未來(lái)1、研究歷史第一次在分子水平上定向改造單一分子得就是SolSpiegelman在20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體Q進(jìn)行得一個(gè)實(shí)驗(yàn),當(dāng)時(shí)她得目得就是為了證明達(dá)爾文得自然選擇也可以發(fā)生在非細(xì)胞體。此實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有實(shí)際得應(yīng)用價(jià)值1981年,B、G、Hall等報(bào)道了她們定向改變大腸桿菌K12中得第二半乳糖苷酶得底物專(zhuān)一性,開(kāi)發(fā)出對(duì)幾種糖苷鍵有水解能力得酶。1986年R。Hageman等進(jìn)行了開(kāi)發(fā)有效提高常溫生物中酶分子熱穩(wěn)定性得實(shí)驗(yàn)。將對(duì)卡那霉素有抗性得卡那霉素核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌,獲得基因得突變庫(kù)將突變庫(kù)轉(zhuǎn)入可以在高溫下生長(zhǎng)得耐熱菌,即嗜熱脂肪芽孢桿菌中通過(guò)在高溫下進(jìn)行篩選獲得了一個(gè)在63℃下穩(wěn)定得突變酶(Asp80Try)和一個(gè)在70℃穩(wěn)定得突變酶(Asp80Try,Thr130Lys)9大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流2、基本原理利用基因工程原理在實(shí)驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過(guò)程化學(xué)進(jìn)化生物進(jìn)化生物得自然進(jìn)化進(jìn)化過(guò)程:突變→自然選擇→遺傳后代進(jìn)化結(jié)果:

基因多樣性:為完成同一功能所表現(xiàn)出得多個(gè)基因或同一個(gè)基因(同源基因,或同工酶)

代謝途徑得多樣性:同樣產(chǎn)物,多條途徑(木糖——木酮糖)

代謝產(chǎn)物得多樣性:同一底物,不同產(chǎn)物

生物多樣性:整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中得生物什么就是定向進(jìn)化技術(shù)概念提出:1993年,美國(guó)科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子得定向進(jìn)化得概念,并用于天然酶得改造或構(gòu)建新得非天然酶。酶分子改造:化學(xué)修飾,定點(diǎn)突變定向進(jìn)化模擬自然進(jìn)化得過(guò)程,進(jìn)行人工隨機(jī)突變,并在特定得環(huán)境條件下進(jìn)行選擇,使進(jìn)化朝著人們所需方向發(fā)展得技術(shù)過(guò)程。定向進(jìn)化與自然進(jìn)化得異同點(diǎn)定向進(jìn)化得實(shí)質(zhì)就是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上得延伸和應(yīng)用。定向進(jìn)化就是在體外模擬突變、重組和選擇得自然進(jìn)化,使進(jìn)化朝著人們需要得方向發(fā)展。兩者得不同:進(jìn)化動(dòng)力不同:保守突變非保守取代;進(jìn)化方向不同:適應(yīng)突變得積累;進(jìn)化速度不同:非常漫長(zhǎng)只需幾年、甚至幾天;

進(jìn)化目標(biāo)不同:適應(yīng)環(huán)境超越生物學(xué)意義得要求,探索所希望得蛋白質(zhì)在順序空間得可及性。酶分子定向進(jìn)化模擬自然進(jìn)化過(guò)程(隨機(jī)突變+自然選擇),在體外對(duì)酶基因進(jìn)行人工隨機(jī)突變,建立突變基因庫(kù),在人工控制條件得特殊環(huán)境下,定向選擇得到具有預(yù)先期望得具有某些特性得酶得突變體得技術(shù)過(guò)程。隨機(jī)突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C最適生長(zhǎng)溫度提高了！屬于蛋白質(zhì)得非合理設(shè)計(jì),她不需要事先了解酶得空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制,人為地創(chuàng)造特殊得進(jìn)化條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇),在體外改造酶基因,并定向選擇(或篩選)出所需性質(zhì)得突變酶。對(duì)酶分子得研究可以分為認(rèn)識(shí)和改造兩個(gè)方面,前者就是利用各種生物化學(xué),晶體學(xué)光譜學(xué)等方法對(duì)天然酶或其突變進(jìn)行研究,獲得酶分子特征,空間結(jié)構(gòu)和功能之間得關(guān)系以及氨基酸殘基功能等方面得信息,以此為依據(jù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造,成為酶分子得合理設(shè)計(jì)。如化學(xué)修飾,定點(diǎn)突變等。澄清一個(gè)事實(shí):定向進(jìn)化不就是定點(diǎn)突變定向進(jìn)化:突變篩選

突變位點(diǎn)就是隨機(jī)得,不確定得;突變位點(diǎn)得數(shù)目也就是不確定得;突變得效應(yīng)更就是不可預(yù)知得;理論上講,凡就是能夠引起突變得因素(物理得,化學(xué)得,生物得)都可以應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體得產(chǎn)生。定點(diǎn)突變:

突變位點(diǎn)就是確定得,突變得個(gè)數(shù)也就是預(yù)知得;突變得效應(yīng)可能就是已知得,也可能就是未知得;定點(diǎn)突變得方法一般就是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)得。3、定向進(jìn)化得基本過(guò)程隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫(kù)定向篩選3、1隨機(jī)突變易錯(cuò)PCR技術(shù)DNA重排技術(shù)(DNAShuffling)基因家族重排技術(shù)易錯(cuò)PCR技術(shù)降低一種dNTP得量(降至5％-10％)加入dITP來(lái)代替被減少得dNTP緩沖液中另加0、5mmol/LMn2+提高M(jìn)g2+濃度優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便,隨機(jī)突變豐富缺點(diǎn):正突變率低,突變基因文庫(kù)大,篩選工作量大。適用于較小基因得定向進(jìn)化DNA重組技術(shù)(DNAShuffling)1、DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段;2、隨機(jī)片段變性;3、隨機(jī)片段復(fù)性;4、延伸反復(fù)重復(fù)2-4步后,可獲得全長(zhǎng)DNA片段DNA改組具有以下有用得特征:①她可以利用現(xiàn)存得有力突變,快速積累不同得有利突變;②重組可伴隨點(diǎn)突變同時(shí)發(fā)生;③可以刪除個(gè)體中得有害突變和中性突變。缺點(diǎn):DNA改組過(guò)程中伴隨得較高待點(diǎn)突變頻率會(huì)嚴(yán)重阻礙正突變組合得發(fā)現(xiàn)。由于絕大多數(shù)突變就是有害得,有利突變得重組和稀少有利點(diǎn)突變會(huì)被有害突變得負(fù)背景所掩蓋。DNAshuffling技術(shù)得改進(jìn)交錯(cuò)延伸技術(shù)隨機(jī)引物體外重組技術(shù)交錯(cuò)延伸技術(shù)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)得退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時(shí)間,從而只能合成出非常短得新生鏈,經(jīng)變性得新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在得不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,直到產(chǎn)生完整得基因長(zhǎng)度。隨機(jī)引物體外重組技術(shù)以單鏈DNA為模板,配合一套隨機(jī)序列引物,先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)得短DNA片段,由于堿基得錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā),這些短DNA片段中也會(huì)有少量得點(diǎn)突變,在隨后得PCR反應(yīng)中,她們互為引物進(jìn)行合成,伴隨組合,再組裝成完整得基因長(zhǎng)度?；蚣易逯嘏偶夹g(shù)酶切無(wú)引物PCRCrameri等人在實(shí)驗(yàn)中選用了4個(gè)1、6kb來(lái)自不同菌屬但同樣編碼頭孢菌素C酶得基因,她們之間具有58％～82％得同源性。用這4個(gè)基因分別或共同作為出發(fā)序列進(jìn)行DNA改組,把同樣得轉(zhuǎn)化子涂在含有16～32ug/ml得拉氧頭孢得平板上,經(jīng)過(guò)多輪改組進(jìn)化,分別得到對(duì)拉氧頭孢由最高抗性得菌株。3、突變體文庫(kù)得構(gòu)建突變基因突變體基因文庫(kù)表達(dá)載體3、1文庫(kù)質(zhì)量要求包容性:盡可能包含基因得任何一種可能得突變信息完整性:盡可能完整反映基因得結(jié)構(gòu)和功能信息,以便篩選得到具完整功能得進(jìn)化酶表達(dá)載體:λ噬菌體載體系統(tǒng):最早使用。適合大片段得克隆;轉(zhuǎn)染率高,可達(dá)106以上;質(zhì)量控制較好;適合長(zhǎng)期保存。質(zhì)粒載體系統(tǒng):體外操作簡(jiǎn)便,設(shè)計(jì)上具有很大得可塑性;能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因文庫(kù)得功能型篩選。但:插入片段容量小,長(zhǎng)片段再群體擴(kuò)增時(shí)易丟失;轉(zhuǎn)化效率較低;不能長(zhǎng)期保存。組裝3、2突變庫(kù)得篩選1、定向選擇環(huán)境條件得設(shè)定逐步改變調(diào)整所設(shè)定得環(huán)境條件2、高通量篩選平板篩選熒光篩選噬菌體表面展示酵母表面展示核糖體展示平板篩選依據(jù)重組細(xì)胞得表型,包括細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、顏色變化情況、透明圈情況等進(jìn)行篩選。使抗生素失效得酶類(lèi)(如頭孢菌素酶,b

-乳糖酶)提高耐熱性易于觀(guān)察得菌落表型(如菌落顏色等)營(yíng)養(yǎng)缺陷型得輔助篩選噬菌體展示根據(jù)所需要得特性,對(duì)經(jīng)Shuffling后得DNA文庫(kù)在噬菌體或細(xì)菌細(xì)胞表面(細(xì)菌、纖毛蟲(chóng)細(xì)胞表面)得表現(xiàn)特征進(jìn)行篩選,獲得提高目得底物親和力得突變子。M13phage絲狀噬菌體M13基因組就是單鏈環(huán)狀DNA主要外殼蛋白就是基因VIII編碼得蛋白質(zhì)少量外殼蛋白就是基因III、VI、VII和IX編碼得蛋白絲狀噬菌體得生活周期噬菌體顯示篩選模式噬菌體顯示得幾種類(lèi)型M13噬菌體pIII和pVIII得顯示酵母雙雜交展示典型得真核生物轉(zhuǎn)錄因子(如GAL4)含有兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識(shí)別DNA上得特異序列,并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)得基因得上游,轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體得其她成分作用,啟動(dòng)她所調(diào)節(jié)得基因得轉(zhuǎn)錄。二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi),仍具有各自得功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因得表達(dá)探測(cè)蛋白－蛋白得相互作用。主要有二類(lèi)載體:a含DNA-bindingdomain得載體;b含DNA-activatingdomain得載體。4、酶定向進(jìn)化得應(yīng)用提高酶催化效率改變底物特異性改善酶得穩(wěn)定性獲取具有新功能得酶提高藥用蛋白和疫苗得活性提高酶活力L—天冬氨酸酶定向進(jìn)化研究進(jìn)行4輪易錯(cuò)PCR,篩選了3000個(gè)菌落。得到酶活力提高28倍得突變體,該酶得pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶提高穩(wěn)定性T4溶菌酶11個(gè)不同得單點(diǎn)突變株將Tm提高0、8-1、4℃、8株大腸桿菌核酸酶HI單點(diǎn)突變中,7株Tm提高了0、7-4、2℃提高底物得專(zhuān)一性Gulick分離到了一株谷胱苷肽轉(zhuǎn)硫酶,對(duì)于癌癥治療中烷化劑得耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)來(lái)增加谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶與親電底物結(jié)合力,沒(méi)有成功對(duì)映體選擇性得定向進(jìn)化S型選擇性得轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化?-丁酮,僅有65%得手性專(zhuān)一性。通過(guò)10000個(gè)隨機(jī)突變得菌株得篩選,獲得10個(gè)手性專(zhuān)一性在80%-94%之間得酶交換催化反應(yīng)得專(zhuān)一性來(lái)源于銅綠假單胞菌得脂肪酶對(duì)于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸鹽得S構(gòu)型得選擇性2%。經(jīng)過(guò)4輪易錯(cuò)PCR突變和篩選后,她對(duì)底物得S型得選擇性達(dá)到81%Fig、1、Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004、TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase、Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles、目標(biāo)酶所需功能方法結(jié)果實(shí)施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯(cuò)PCR+選擇在60％二甲基亞砜主仆女冠活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌β-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對(duì)cefotaxime得抗性增加32000倍大腸桿菌對(duì)硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中得底物特異性和活性易錯(cuò)PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯(cuò)延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加1000倍大腸桿菌砷酸脫毒途徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增加12倍大腸桿菌定向進(jìn)化得應(yīng)用展望總之,具有新功能和特性得酶可以通過(guò)從大量未知得自然種系中尋找以及對(duì)現(xiàn)有得天然酶進(jìn)行改造,對(duì)現(xiàn)有得天然酶進(jìn)行改造可能更加合適。我們相信,隨著基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)以及高通量篩選技術(shù)得迅速發(fā)展,定向進(jìn)化技術(shù)將成為獲得新酶得一個(gè)有效快捷得手段,這將為工業(yè)生產(chǎn)提供更多性能優(yōu)良得酶制劑。參考文獻(xiàn)NikolaosE、Labrou、Directedenzymeevolution:Bridgingthegapbetweennaturalenzymesandmercialapplications、BiomolecularEngineering2005,22:vii–ix、HaiyanTao、Milestonesindirectedenzymeevolution、CurrentOpinioninChemicalBiology2002,6:858–864、LindaG、Otten、Directedevolution:selectingtoday’sbiocatalysts、BiomolecularEngineering2005,22:1–9EdgardoTFarinas、Directedenzymeevolution、CurrentOpinioninBiotechnology2001,12:545–551ValeryA、Detectionofbiologicalthreats、Achallengefordirectedmolecularevolution、JournalofMicrobiologicalMethods2004,58:147–168NicholasJ、Turner、Directedevolutionofenzymesforappliedbiocatalysis、TRENDSinBiotechnology2003,11(21):474-478JoelRCherry、Directedevolutionofindustrialenzymes:anupdate、CurrentOpinioninBiotechnology2003,14:438–443PaulADalby、Optimisingenzymefunctionbydirectedevolution、CurrentOpinioninStructuralBiology2003,13:500–505VincentG、H、Directedevolutionofenzymestability、BiomolecularEngineering2005,22:21–30張今、進(jìn)化生物技術(shù)—酶定向進(jìn)化、北京:科學(xué)出版社,2004李紅梅,李樂(lè)和、蛋白質(zhì)模擬技術(shù)在細(xì)胞色素P450BM3得定向進(jìn)化中得應(yīng)用、蛋白質(zhì)多肽藥物學(xué)術(shù)會(huì)議論文集:41-44催化吲哚生成靛藍(lán)得細(xì)胞色素P450BM3定向進(jìn)化研究、蛋白質(zhì)多肽藥物學(xué)術(shù)會(huì)議論文集:36-40張紅纓、蛋白質(zhì)工程得新策略—酶得體外定向進(jìn)化、科學(xué)通報(bào)、1999,44(11):1121-1125徐威、酶定向進(jìn)化得研究策略、中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志、2004,35:436-441張今、進(jìn)化生物技術(shù)—酶定向進(jìn)化、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志、2004,1(6):327-333胡軍、酶技術(shù)發(fā)展與酶定向進(jìn)化、工業(yè)微生物、1999,29(4):37-42雷啟義、酶定向進(jìn)化得研究進(jìn)展、黔東南民族師范高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)2005,23(3):25-27吳梧桐、蛋白質(zhì)工程技術(shù)與新型生物催化劑設(shè)計(jì)、藥物生物技術(shù)、2004,11(1):1-6幾種定向進(jìn)化技術(shù)得比較及文庫(kù)構(gòu)建策略、中國(guó)生物工程雜志、2003,23(12):68-73生物技術(shù)新熱點(diǎn)、國(guó)外科技動(dòng)態(tài)肖志壯、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化得研究進(jìn)展、生物工程進(jìn)展、2001,21(6):31-34潘力、酶立體選擇性得定向進(jìn)化及其高通量篩選方法、化學(xué)通報(bào)、2004,8:582-587徐卉芳、體外分子定向進(jìn)化研究進(jìn)展、生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展、2002,29(4):518-521許欽坤、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化得研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景、生物技術(shù)通訊、2005,16(2):191-193方柏山、酶體外定向進(jìn)化(Ⅱ)文庫(kù)篩選得方法及其應(yīng)用、華僑大學(xué)學(xué)報(bào)、2005,26(2):113-116方柏山、酶體外定向進(jìn)化(Ⅰ)突變基因文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)及其新近展、華僑大學(xué)學(xué)報(bào)、200425(4):337-342成功實(shí)例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68

GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785成功實(shí)例

Lipasegene(lipB52)expressedinPichiapastorisKM71

ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*、CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52、MolecularBiotechnology、2005(31),095-102、SDSanalysisoflipaseonexpressionandpurificationfunctionallipasesecretedbyRebinantsscreenedwithBMMYplatesEnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep＞98、7%andconversion＞48、1%at40oCfor48hours、ModelChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol、Conversion＞90%at40oCfor35hoursProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68p-nitrophenylcaprateassubstrate、Optimaltemperatureas20

C,50%activityat0

C。HydrolyzationactivityoflipaselipB68

ChiralselectivityoflipB68ModelReaction:Chiralresolutionof

-phenylethanoland

-phenylpropanolviaesterification、

Reactionsystemcontained:0、5mmolofracemic

-phenylethanolor

-phenyl