細胞工程自選實驗?一、實驗目的本次自選實驗旨在通過實踐操作，深入了解細胞工程的基本原理和技術方法，掌握細胞培養(yǎng)、細胞融合、單克隆抗體制備等關鍵技術，培養(yǎng)學生的實驗技能和科學思維能力，為進一步學習和研究細胞工程相關領域奠定基礎。

二、實驗材料與儀器1.實驗材料動物細胞：小鼠骨髓瘤細胞、小鼠脾細胞培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素）試劑：聚乙二醇（PEG）、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、堿性磷酸酶底物等其他材料：96孔細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、培養(yǎng)箱等2.實驗儀器細胞培養(yǎng)箱：用于維持細胞生長所需的適宜溫度、濕度和氣體環(huán)境超凈工作臺：提供無菌操作環(huán)境倒置顯微鏡：用于觀察細胞形態(tài)和生長狀況離心機：用于細胞離心酶標儀：用于檢測細胞培養(yǎng)上清中的相關指標

三、實驗方法與步驟

細胞培養(yǎng)1.培養(yǎng)基的配制在無菌條件下，將RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗按照一定比例混合，配制成完全培養(yǎng)基。調節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.27.4。2.細胞復蘇從液氮罐中取出凍存的小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖動，使其在12分鐘內完全融化。將融化的細胞懸液轉移至離心管中，加入適量的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.細胞傳代當細胞生長至對數(shù)生長期時，進行傳代培養(yǎng)。棄去細胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞23次。加入適量的胰蛋白酶消化液，使胰蛋白酶覆蓋細胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化12分鐘，觀察細胞形態(tài)，當細胞變圓、彼此分離時，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打細胞，使其分散成單細胞懸液。按照一定比例將細胞懸液接種于新的細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞融合1.脾細胞的制備選取免疫后的小鼠，頸椎脫臼處死，浸泡在75%乙醇中消毒5分鐘。在超凈工作臺中，取出小鼠脾臟，置于盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中。用鑷子輕輕擠壓脾臟，使脾細胞釋放到PBS緩沖液中，制成脾細胞懸液。將脾細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸脾細胞，計數(shù)細胞數(shù)量，調整細胞濃度至1×10?個/ml。2.細胞融合取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸骨髓瘤細胞，計數(shù)細胞數(shù)量，調整細胞濃度至1×10?個/ml。將脾細胞懸液和骨髓瘤細胞懸液按照1:1的比例混合于離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。輕輕彈擊離心管底部，使細胞沉淀松散，然后在37℃水浴中預熱5分鐘。逐滴加入預熱至37℃的50%PEG溶液，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù)作用12分鐘。緩慢加入預熱的完全培養(yǎng)基，終止PEG的作用，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù)作用35分鐘。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的HAT培養(yǎng)基重懸細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

單克隆抗體制備1.陽性雜交瘤細胞的篩選在細胞融合后的第2天，觀察細胞生長情況，更換新鮮的HAT培養(yǎng)基。在細胞融合后的第710天，當雜交瘤細胞生長至肉眼可見的克隆時，進行陽性雜交瘤細胞的篩選。采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞。具體步驟如下：將抗原包被于酶標板孔中，4℃過夜。棄去包被液，用PBS緩沖液沖洗酶標板3次，每次3分鐘。加入封閉液，37℃封閉1小時。棄去封閉液，用PBS緩沖液沖洗酶標板3次，每次3分鐘。加入細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時。棄去細胞培養(yǎng)上清，用PBS緩沖液沖洗酶標板3次，每次3分鐘。加入羊抗鼠IgGHRP，37℃孵育1小時。棄去羊抗鼠IgGHRP，用PBS緩沖液沖洗酶標板5次，每次3分鐘。加入底物溶液，室溫避光顯色1015分鐘。加入終止液，終止顯色反應。用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，篩選出吸光度值較高的陽性雜交瘤細胞。2.陽性雜交瘤細胞的克隆化采用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化。具體步驟如下：將陽性雜交瘤細胞計數(shù)，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調整細胞濃度至50個/ml。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細胞懸液，然后在每孔中加入100μl含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，使每孔細胞濃度約為25個/ml。將96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，待細胞克隆生長至肉眼可見時，進行陽性克隆的篩選。重復有限稀釋法23次，直至獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株。3.單克隆抗體的大量制備將篩選出的單克隆雜交瘤細胞株接種于Balb/c小鼠體內，進行腹水制備。具體步驟如下：選取68周齡的Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐劑，致敏小鼠。710天后，腹腔注射1×10?個單克隆雜交瘤細胞。觀察小鼠腹水生長情況，當腹水明顯增多時，用無菌注射器抽取腹水，離心1000rpm5分鐘，收集上清液，即為單克隆抗體。將腹水用飽和硫酸銨沉淀法進行純化，具體步驟如下：取腹水，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，4℃過夜。10000rpm離心30分鐘，棄去上清液。用適量的PBS緩沖液溶解沉淀，然后裝入透析袋中，在PBS緩沖液中透析過夜，去除硫酸銨。透析后的溶液即為純化后的單克隆抗體，分裝保存于20℃?zhèn)溆谩?/p>

四、實驗結果與分析

細胞培養(yǎng)結果通過倒置顯微鏡觀察，細胞復蘇后生長良好，形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，貼壁生長。細胞傳代后，生長速度較快，細胞密度逐漸增加。在細胞培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基，細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，未出現(xiàn)污染現(xiàn)象。

細胞融合結果細胞融合后，在96孔細胞培養(yǎng)板中可見細胞克隆生長。通過間接ELISA法篩選，獲得了多株陽性雜交瘤細胞。對陽性雜交瘤細胞進行克隆化后，獲得了穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株。

單克隆抗體制備結果將單克隆雜交瘤細胞株接種于Balb/c小鼠體內，成功制備了腹水。對腹水進行純化后，獲得了高純度的單克隆抗體。通過ELISA檢測，單克隆抗體具有較高的特異性和親和力，能夠與抗原特異性結合。

五、討論與結論1.討論在細胞培養(yǎng)過程中，要注意無菌操作，避免細胞污染。定期更換培養(yǎng)基，保持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。細胞融合是細胞工程中的關鍵技術之一，PEG的濃度和作用時間對細胞融合效率有重要影響。在實驗中，要根據細胞類型和實驗要求，優(yōu)化PEG的使用條件。單克隆抗體制備過程中，陽性雜交瘤細胞的篩選和克隆化是關鍵步驟。采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。有限稀釋法是常用的克隆化方法，通過多次克隆化，可以獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株。2.結論通過本次自選實驗，成功掌握了細胞培養(yǎng)、細胞融合、單克隆抗體制備等細胞工程技術。獲得了穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株，并制備了高純度的單克隆抗體。實驗結果表明，細胞工程技術在生物醫(yī)學領域具有重要的應用價值，可以為疾病診斷、治療和藥物研發(fā)提供有力的工具。

六、注意事項1.實驗操作過程中要嚴格遵守無菌操