1T/FDSAXXXX—202X生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測方法拉曼光譜法本標準規(guī)定了生物樣本中抗生素耐藥菌的快速檢測方法。本標準適用于臨床分離株、尿液等樣本中抗生素耐藥菌的快速測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成對本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理樣品經過濾除去大分子、細菌培養(yǎng)、抗生素作用等方法，加表面增強試劑對待測液中的目標分子拉曼信號進行增強。用拉曼光譜儀采集樣品的拉曼光譜信號進行分析，以重水標記特有的拉曼特征峰（2180cm-1）作為定性基準峰，建立方法數據庫，實現待測樣本中目標物的快速檢測。5試劑和材料5.1試劑除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1二甲基亞砜。5.1.2甲醇。5.1.30.1mol/L鹽酸。5.1.4磷酸鹽緩沖液。5.1.5重水（D2O）。5.1.6慶大霉素。5.1.7營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取8g營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓5.1.8MH培養(yǎng)基：稱取4.2gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶解于200mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌2T/FDSAXXXX—202X5.2材料5.2.1塑料具塞離心管：2mL和10mL。5.2.2移液吸頭：200μL，1000μL和5000μL。6儀器設備6.1流式拉曼光譜儀6.2穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長為532±1nm，線寬＜0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤10cm-1；光譜響應范圍300cm-1~2700cm-1，或大于該響應范圍。6.3移液器：0.1-2.5μL、2-20μL、10-100μL和100-1000μL。6.4渦旋振蕩器。6.5離心機：轉速≥10000轉/min。6.6電子天平：感量為0.01g和0.0001g。6.7塑料具塞離心管：2mL和50mL6.8移液吸頭：10μL，200μL和1000μL。6.9麥氏濁度儀。6.10孵育箱。7分析步驟7.1取樣制樣臨床分離株：將平板上的單菌落挑取至含有MH培養(yǎng)基的玻璃管中，混勻；麥氏濁度儀檢測為0.5，對照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；尿液樣品：取樣品用5μm過濾器對尿液樣本進行過濾取出大分子雜質，麥氏濁度儀檢測菌懸液濁度，對照濁度表將菌懸液稀釋至5×105CFU/mL；7.2抗生素作用將倍比稀釋的各濃度梯度的抗生素分別與菌懸液混合。如慶大霉素，用一級水配制母液濃度為50mg/mL備用，將母液稀釋至960μg/mL后，采用倍比稀釋法在安全柜中完成各濃度梯度的抗生素配制，后續(xù)分別取20μL不同濃度慶大霉素加入到580μL菌懸液中，獲得含有0.5-32μg/mL的菌懸液，混勻，37oC孵育1小時。7.3重水標記將重水使用0.22μm無機或有機濾膜配合注射器過濾滅菌，取一定量重水加入到孵育1小時的菌懸液中，混勻，重水終濃度為40%，37oC孵育2小時。7.4離心清洗孵育完成后，混合體系完全取出，將液體移至離心管中6500轉/分鐘離心3分鐘，水洗3T/FDSAXXXX—202X三次，等體積水重懸。7.5測定7.5.1拉曼光譜儀器分析參考條件50×倍鏡下激光能量≥9.47mW，數據采集時間≥6s。7.5.2測定取3μL離心重懸后樣本滴加在鋁片上，干燥后進行拉曼檢測。7.6質控試驗每批樣品應同時進行陰性對照和陽性對照試驗。7.6.1陰性對照稱取空白試樣，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。7.6.2陽性對照制備菌懸液，將加入抗生素換成等體積水，按照7.1-7.5步驟與樣品同法操作。8結果計算和表達8.1定性儀器軟件將測試結果與標準譜圖庫中的對應樣本譜圖進行匹配計算，根據測試譜圖與軟件內置譜圖進行特征峰比對計算，進而判定待測樣本中是否含有目標物特征峰，如待測樣本待測樣本含有目標物特征峰，并且特征峰與空白樣本存在顯著性差異，儀器將顯示陽性或檢出，如待測樣本不含有目標物特征峰或與空白樣本無顯著性差異，儀器將顯示陰性或未檢出。重水的表面增強拉曼光譜圖參附錄A.1。8.2確證本方法為初篩方法，當檢測結果為陽性時，應用其他技術手段進行確證。9方法性能指標9.1檢出限本方法檢出限為40%重水當量。9.2靈敏度靈敏度應≥95%。9.3特異性特異性應≥95%。9.4假陰性率假陰性率應≤5%。4T/FDSAXXXX—202X9.5假陽性率假陽性率應≤5%。性能指標計算方法見附錄B中表B.1。5T/FDSAXXXX—202X含重水質控樣本的拉曼光譜圖圖A.1含重水質控樣本的拉曼光譜圖法6T/FDSAXXXX—202X快速檢測方法性能計算表快速檢測方法性能指標計算表見表B.1。表B.1性能指標計算方法樣品情況a檢測結果b總數N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：N：任何特定單元的結果數，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有