榴蓮蜜多糖提取分離和結(jié)構(gòu)表征目錄TOC\o"1-3"\h\u1引言 11.1多糖的提取及純化方法 11.2多糖的結(jié)構(gòu)表征 32實驗原理 53實驗部分 53.1儀器、材料與試劑 53.1.1儀器 53.1.2試劑 63.2實驗方法 73.2.1樣品的預處理 73.2.2榴蓮蜜多糖和蛋白質(zhì)標準曲線的建立 73.2.3多糖的提取與含量測定 83.3單因素實驗 83.4榴蓮蜜多糖的分離純化 93.5榴蓮蜜多糖紅外表征 103.6響應面法優(yōu)化多糖提取工藝 103.6.1模型擬合和統(tǒng)計分析 103.6.2響應曲面圖分析 113.6.3最佳條件的確定與模擬驗證 134結(jié)果與討論 134.1單因素實驗結(jié)果 134.1.1超聲時間對榴蓮蜜多糖提取率的影響 134.1.2超聲功率對榴蓮蜜多糖提取率的影響 144.1.3料液比對榴蓮蜜多糖提取率的影響 144.2多糖提取 154.2.1蛋白質(zhì)去除率 154.2.2多糖提取率 154.2.3DE-52纖維柱洗脫結(jié)果 164.2.3葡聚糖凝膠G-200洗脫結(jié)果 164.2.4榴蓮蜜多糖的電子顯微鏡結(jié)果 174.2.5榴蓮蜜多糖紅外表征 175結(jié)論 18參考文獻 19致謝 21摘要：本實驗選用海南本地榴蓮蜜，使用超聲微波法提取榴蓮蜜多糖，通過響應曲面法優(yōu)化超聲提取法的最佳條件。采用Sevage法除蛋白,先后采用DEAE-52纖維柱和Sephadex葡聚糖凝膠柱分離純化得到最高組分LG-M。采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法測得榴蓮蜜多糖提取率和除蛋白率。使用SEM觀察組分LG-M表面。通過紅外光譜確定提取物為榴蓮蜜多糖。關(guān)鍵詞:榴蓮蜜多糖，超聲提取法，Sevage除蛋白法，響應曲面法1引言榴蓮蜜（圖1），又稱尖蜜拉、小木菠蘿、尖百達，為?？颇静ぬ}屬稀有熱帶水果REF_Ref10523\r\h[1-2],榴蓮蜜主要產(chǎn)于東南亞地區(qū)，如馬來西亞、印度尼西亞和泰國等。其果肉可口、風味獨特、香味濃郁,外形和菠蘿蜜相似,其單果大小適中，風味較菠蘿蜜更好REF_Ref10954\r\h[4]。通過各種研究表明,榴蓮蜜果肉中含有各種豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、膳食纖維、碳水化合物和蛋白質(zhì)等REF_Ref10850\r\h[3]。圖SEQ圖\*ARABIC1榴蓮蜜榴蓮蜜種子富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、纖維和礦物質(zhì)，可以用來煮、烤或者油炸食用。榴蓮蜜不僅人可以食用動物也可以，所以有些地方用榴蓮蜜的葉子和果肉來喂養(yǎng)動物。榴蓮蜜果樹大且粗壯，人們利用榴蓮蜜果樹的枝干來建造房屋和木制家具等。有研究表明榴蓮蜜的葉子中可以提取一種具有抗瘧疾特性的碳氫化合物，即二苯乙烯REF_Ref11363\r\h[1]，為人類健康和生活質(zhì)量的提高做出貢獻。1.1多糖的提取及純化方法多糖是一類復雜的天然高分子化合物，廣泛存在于動植物和微生物中，榴蓮蜜多糖是一種從榴蓮蜜中提取出來的天然多糖化合物。菠蘿蜜多糖也是一種從菠蘿蜜中提取出來的天然糖化合物。研究發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜多糖具有顯著的抗氧化活性REF_Ref20775\r\h[19]，而且菠蘿蜜多糖還有體外免疫調(diào)節(jié)和抗炎效果REF_Ref20602\r\h[5]。榴蓮蜜作為菠蘿蜜同一科屬的植物，為了探究它的活性我們需要找到最佳的提取方案。目前多糖主要的提取方法有超聲輔助提取法、熱水提取法、酶解法等。多糖超聲波提取是一種新型的生物技術(shù)，用于提取和純化多糖類物質(zhì)。其原理是通過超聲波的物理作用，打破細胞壁，釋放出細胞內(nèi)的多糖成分，并通過一系列的分離純化技術(shù)，得到高純度的多糖。楊等REF_Ref11601\r\h[6]人所在的研究小組在提取廢棄姜葉多糖時，通過對比其他方法發(fā)現(xiàn)超聲波對產(chǎn)量的貢獻高于微波。林等REF_Ref29704\r\h[7]人在對\t"/paper/1674555123499253760/_blank"沙田柚皮多糖提取及性質(zhì)研究中以沙田柚皮為原料，分別采用熱水提取法和超聲波輔助酶法提取多糖。在比較不同方法下發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)熱水法提取相比，超聲輔助酶提取的多糖的產(chǎn)率更高。因此與傳統(tǒng)的方法相比，多糖超聲波技術(shù)具有許多優(yōu)點，如操作簡便、提取效率高、對目標成分的活性影響小等。多糖超聲波技術(shù)還可以與其他分離純化技術(shù)結(jié)合使用，進一步提高多糖的純度和產(chǎn)率。多糖超聲波技術(shù)是一種新型的生物技術(shù)，具有廣泛的應用前景。通過該技術(shù)，我們可以快速、高效地提取和純化各種多糖物質(zhì)，為科學研究、藥物開發(fā)、食品加工等領(lǐng)域提供重要的技術(shù)支持。多糖熱水提取法多被人們用于植物的多糖提取。多糖熱水提取法的原理是利用熱水對植物細胞的溶解作用。在熱水的作用下，植物細胞壁被溶解受到破壞，細胞內(nèi)的多糖成分析出。同時，熱水浸提過程中還可以通過攪拌、超聲波等手段增強多糖的溶解效果。溶解后的多糖可以通過離心、過濾、沉淀等方法進一步分離純化。多糖熱水浸提法被廣泛應用于提取各種植物中的多糖成分。王等REF_Ref29838\r\h[8]人在螺旋藻提取試驗中用了熱水提?。ǚ椒?）、堿提?。ǚ椒?）、超聲波輔助提?。ǚ椒?）和凍融提取（方法4）4種提取方法來比較提取率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量（如圖1）。由圖可知熱水浸提法水提取率取最低但多糖含量第二，且熱水法不需要特殊設(shè)備，與傳統(tǒng)的有機溶劑提取法相比，多糖熱水浸提法具有操作簡便但效率比其他設(shè)備低，成本低廉、對環(huán)境友好等優(yōu)點。圖2四種方法的提取率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量酶解法是利用酶的催化作用，使細胞壁中的纖維素和果膠等成分分解為可溶性物質(zhì)，從而有利于多糖的提取。王等REF_Ref11921\r\h[9]人提取大麥葉多糖時對比了六種方法獲得的提取率（如圖2，HW-熱水;HPS-高壓蒸汽;EA-堿性萃取;XE-木聚糖酶取;CE-纖維素酶萃取;XCE-混合木聚糖酶和纖維素酶萃?。?。一般來說,與化學和物理提取方法相比,酶提取方法的總提取率明顯更高。所以酶解法可以提高提取效率，減少時間和成本。圖3六種方法的提取率多糖的純化可以用纖維素柱層析法，凝膠柱層析法等。凝膠過濾層析法是利用凝膠作為固定相，將多糖進行分離純化。這種方法可以有效地去除雜質(zhì)，提高產(chǎn)品的純度。李等REF_Ref12728\r\h[18]人通過乙醇沉淀，陰離子交換和凝膠過濾層析法，從新型鹽藻的高鹽發(fā)酵液中成功制備了一種新型的胞外多糖。離子交換層析法是利用離子交換樹脂作為固定相，根據(jù)離子的大小進行分離純化。王所在的課題組就是采用膨脹床吸附柱結(jié)合離子交換層析法從疣狀江蘺中分離純化R-藻紅蛋白可有效解決藻膽蛋白分離純化過程中多糖堵塞色譜柱的問題REF_Ref30129\r\h[10]。親和層析法是利用蛋白質(zhì)或其他生物分子與目標多糖之間的相互作用關(guān)系進行分離純化。J等REF_Ref12065\r\h[11]人在研究幽門螺桿菌脂多糖抑制胃生長抑制素受體時，采用親和層析法從溶解的上皮細胞膜中純化了生長抑素受體，測定結(jié)果表明脂多糖對受體-生長抑素結(jié)合呈劑量依賴性抑制，最大抑制率達到94.1%。這種方法能夠獲得高純度和高收率的單一多糖組分。1.2多糖的結(jié)構(gòu)表征多糖，作為一種生物大分子，由眾多單糖分子經(jīng)糖苷鍵相互連接而成，其結(jié)構(gòu)層次豐富，涵蓋一級至四級結(jié)構(gòu)。糖苷鍵的種類繁多，包括α-1,4-苷鍵、β-1,4-苷鍵和α-1,6-苷鍵等，它們能夠形成直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。具體來說，直鏈結(jié)構(gòu)主要由α-1,4-苷鍵（如淀粉）和β-1,4-苷鍵（如纖維素）連接而成；而支鏈結(jié)構(gòu)則主要依賴于α-1,6-苷鍵REF_Ref12871\r\h[12]的連接作用。這樣的結(jié)構(gòu)特點使得多糖在生物內(nèi)具有多種功能和應用價值。圖4α-1,6-苷鍵多糖的一級結(jié)構(gòu)是由單糖的種類、排列順序和多糖鏈長度（多糖鏈的長度是指單糖的數(shù)量）來決定的。趙等REF_Ref13328\r\h[13]人在多糖單糖組分抗氧化性能實驗中，研究發(fā)現(xiàn)單糖的組成和糖基鍵的類型對多糖的抗氧化性產(chǎn)生調(diào)控作用，多糖的抗氧化性質(zhì)受到組合物中不同單糖比例的影響。因此，多糖中單糖的數(shù)量決定了多糖的聚合度，即多糖鏈的長度，從而影響了多糖的整體性質(zhì)。此外，單糖的排列順序也決定了多糖的立體構(gòu)型和性質(zhì)。例如直鏈淀粉和支鏈淀粉（如圖4）就是因為單糖排列順序不同導致它們的理化性質(zhì)和生物學功能也存在顯著差異REF_Ref12959\r\h[14]。圖5直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種結(jié)構(gòu)多糖的二級結(jié)構(gòu)，作為在一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定空間構(gòu)象，展現(xiàn)出多樣化的形態(tài)。其主要包括螺旋結(jié)構(gòu)、折疊結(jié)構(gòu)以及扭曲結(jié)構(gòu)等多種形態(tài)。這些結(jié)構(gòu)特點共同決定了多糖的生物活性和功能表現(xiàn)，為其在生物學領(lǐng)域中的深入研究與應用提供了重要基礎(chǔ)。FormanekREF_Ref13178\r\h[15]等人在對細胞壁肽聚糖的三維研究中發(fā)現(xiàn)其是螺旋結(jié)構(gòu)的。在螺旋結(jié)構(gòu)中，多糖鏈呈螺旋狀排列，形成穩(wěn)定的三維空間構(gòu)象。RREF_Ref13404\r\h[16]所在的課題組發(fā)現(xiàn)鼠李半乳糖醛酸具有折疊結(jié)構(gòu)。在折疊結(jié)構(gòu)中，多糖鏈呈折疊狀排列，形成較為穩(wěn)定的空間構(gòu)象。KREF_Ref13446\r\h[17]等發(fā)現(xiàn)藍藻多糖可以從納米級到微米級以扭曲纖維的形式自組裝能夠在蒸發(fā)的空氣-水界面處靈活地轉(zhuǎn)換為二維蛇形和三維扭曲結(jié)構(gòu)（如圖5）。圖6藍藻多糖的二維蛇形和三維扭曲結(jié)構(gòu)在扭曲結(jié)構(gòu)中，多糖鏈呈不規(guī)則扭曲狀排列，形成較為松散的空間構(gòu)象。扭曲結(jié)構(gòu)的形成與多糖分子中的熵效應相互作用有關(guān)。多糖結(jié)構(gòu)的多樣性賦予多糖生物功能，在細胞相互作用、免疫調(diào)節(jié)、藥物研發(fā)和生物工程等領(lǐng)域中具有關(guān)鍵作用，推動著深入理解生命過程和創(chuàng)新科學應用的發(fā)展。2實驗原理本實驗選用海南本地特色榴蓮蜜作為實驗材料，通過采用超聲提取法與醇沉法相結(jié)合的手段，有效提取了榴蓮蜜中的多糖成分。接著，運用響應曲面法，對提取工藝進行了細致的優(yōu)化，以確保多糖提取的高效性。為了進一步提高多糖的純度，本實驗采用了Sevage法去除多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。隨后，通過纖維柱對多糖進行了初步分離，并利用Sephadex葡聚糖凝膠G-200進行深度純化，從而獲得了更為純凈的多糖組分。為了準確評估多糖提取與蛋白質(zhì)去除的效果，本實驗利用硫酸-苯酚法和考馬斯亮藍法分別檢測了多糖提取率和蛋白質(zhì)去除率。最后，借助紫外、紅外等先進儀器，對多糖的結(jié)構(gòu)進行了全面的鑒定，為后續(xù)研究提供了有力的數(shù)據(jù)支持。3實驗部分3.1儀器、材料與試劑3.1.1儀器表1主要儀器儀器設(shè)備型號生產(chǎn)廠家紫外-可見分光光度計UV-2700日本島津公司冷凍干燥機LGJ-10北京四環(huán)科學儀器廠有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1江蘇智博瑞儀器制造有限公司超聲波清洗儀XO-5200DS南京先歐儀器制造有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070A上海申賢恒溫設(shè)備廠電子天平TP-214丹佛儀器（北京）有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA上海亞榮生化儀器廠循環(huán)水式多用真空泵SHZ-D(Ⅲ)河南省予華儀器有限公司恒流泵HL-2D上海青浦滬西儀器公司3.1.2試劑表2主要試劑試劑型號生產(chǎn)廠家石油醚AR國藥集團化學試劑有限公司95%乙醇AR國藥集團化學試劑有限公司濃硫酸AR廣州化學試劑廠葡萄糖AR國藥集團化學試劑有限公司苯酚AR國藥集團化學試劑有限公司三氯乙烷AR國藥集團化學試劑有限公司牛血清蛋白AR國藥集團化學試劑有限公司溴化鉀AR國藥集團化學試劑有限公司葡聚糖凝膠G-200索萊寶生物科技有限公司纖維素填料DEAE-52索萊寶生物科技有限公司考馬斯亮藍G-250國藥集團化學試劑有限公司透析袋MW3500國藥集團化學試劑有限公司氯化鈉AR國藥集團化學試劑有限公司氯化氫AR國藥集團化學試劑有限公司正丁醇AR國藥集團化學試劑有限公司3.2實驗方法3.2.1樣品的預處理將榴蓮蜜果肉去皮去核后用超純水沖洗干凈之后切小塊稱量，裝入不銹鋼盒中于冷凍干燥機中凍干12小時。將充分干燥的榴蓮蜜果肉加入乙醇打碎浸泡8h以上去除色素，然后將去除色素的榴蓮蜜果肉裝入索式提取器中用石油醚對其進行脫油，再將其凍干得到粉末狀粗樣。3.2.2榴蓮蜜多糖和蛋白質(zhì)標準曲線的建立本實驗首先采用苯酚-硫酸法對榴蓮蜜多糖的總含量進行了測量。具體步驟為：首先，使用移液槍精確量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的0.1mg/ml葡萄糖標準溶液，分別置于七個經(jīng)過洗凈烘干的比色管中。接著，向每個比色管中加入適量的蒸餾水，確保每管中溶液總體積均為1ml。隨后，再次使用移液槍向每個比色管中加入1ml新制的5%苯酚溶液和2.5ml濃硫酸。以未加入葡萄糖標準溶液的比色管作為參照，測定其余比色管中溶液在490nm處的吸光度。最后，根據(jù)測量數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標準溶液與吸光度的標準曲線，以此確定榴蓮蜜多糖的總含量。榴蓮蜜多糖的蛋白質(zhì)含量測定，本實驗采用了考馬斯亮藍法。首先，配置了0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液。然后，使用移液槍準確量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml新制的牛血清蛋白溶液，分別加入七個洗凈干燥的比色管中。隨后，向每個比色管中加入蒸餾水，使每管中溶液總量達到1ml。接著，向每個比色管中加入5ml考馬斯亮藍溶液，并立即搖勻，靜置10分鐘。以未加入0.1mg/ml牛血清蛋白溶液的比色管作為參比，測定其他六個比色管中溶液在595nm處的吸光度。最后，根據(jù)測量數(shù)據(jù)繪制牛血清蛋白溶液與吸光度的標準曲線，以此確定榴蓮蜜多糖的蛋白質(zhì)含量。3.2.3多糖的提取與含量測定采用超聲法提取榴蓮蜜多糖。將脫油處理后的榴蓮蜜粉末精確稱量100g，置于錐形瓶中。按照1:20的料液比例，加入適量的蒸餾水。隨后，在超聲作用下，設(shè)定溫度為50℃，功率為600w，持續(xù)時間為2小時進行提取。完成超聲提取后，將混合液以6000轉(zhuǎn)/秒的速度離心10分鐘。離心后，收集上清液，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，并通過旋蒸技術(shù)將其濃縮至原體積的五分之一。接著，向濃縮液中加入其體積四倍的95%乙醇，并在4℃條件下靜置12小時。隨后，通過抽濾操作去除雜質(zhì)，最后采用冷凍干燥法，得到榴蓮蜜粗多糖。本實驗采用Sevage法除去榴蓮蜜多糖中的蛋白質(zhì)。取醇沉干燥后的榴蓮蜜粗多糖溶于1000ml錐形瓶中，按5:1（v/v）的比例加入Sevage試劑（氯仿：正丁醇=4:1，多糖：正丁醇=5:1），用保鮮膜封口并放入震蕩箱中以轉(zhuǎn)速120r/min震蕩30min，取上層清液，繼續(xù)按比例加入Sevage試劑，重復操作5次后取上層清液裝入1500M的透析袋中透析12h，透析期間換水5次，得到榴蓮蜜除蛋白粗多糖。為了測定榴蓮蜜粗多糖的蛋白質(zhì)去除率，首先我們使用移液槍精確量取1ml的榴蓮蜜粗多糖，然后將其置于比色管中。接著，向比色管中加入5ml的考馬斯亮藍試劑，并迅速搖動以混合均勻。之后，將混合液靜置10min，以便讓試劑充分反應。隨后，我們測量混合液的吸光度，并參照先前繪制的牛血清蛋白與吸光度的標準曲線，通過比對計算得出榴蓮蜜粗多糖的蛋白質(zhì)去除率。這一過程確保了測量結(jié)果的準確性和可靠性。3.3單因素實驗首先，我們使用電子天平精確稱量5g經(jīng)過脫油處理的榴蓮蜜粉末，按照料液比1:20mg/ml的比例添加蒸餾水。隨后，在設(shè)定的提取溫度50℃下，以提取功率600w進行提取，分別控制提取時間為1小時、2小時、3小時和4小時，以探究提取時間對榴蓮蜜多糖提取效果的影響。接著，我們再次稱取5g脫油榴蓮蜜粉末，同樣按照料液比1:20的比例添加蒸餾水。這次，我們在保持提取溫度50℃和提取時間2小時不變的情況下，分別調(diào)整提取功率為200W、300W、400W、500W和600W，以探究提取功率對多糖提取效果的影響。最后，我們繼續(xù)采用電子天平準確稱取5g去油榴蓮蜜粉末，并設(shè)定提取功率為600W，提取溫度為50℃。此次實驗中，我們改變料液比，分別以1:20、1:30、1:40、1:50和1:60的比例添加蒸餾水，保持提取時間為2小時，以分析不同料液比對榴蓮蜜多糖提取效率的影響。3.4榴蓮蜜多糖的分離純化纖維素預處理：將干燥的纖維素置于蒸餾水中浸泡24小時，以充分溶脹。隨后，用0.5mol/L的HCl溶液浸泡30分鐘，緊接著用蒸餾水浸泡10分鐘，并多次更換蒸餾水，共浸泡五次，直至溶液的pH值接近7。接下來，用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡30分鐘，并再次用蒸餾水浸泡五次，每次更換新的蒸餾水，直至溶液的pH值再次達到約7。這樣的處理過程確保了纖維素的酸堿度達到所需范圍，為后續(xù)實驗提供了合適的條件。將經(jīng)過處理的纖維素放入大錐形瓶中用蒸餾水溶解浸泡，然后用玻璃棒攪拌均勻后緩慢的倒入層析柱（26×56mm）。纖維素柱層析：準確吸取5ml榴蓮蜜除蛋白多糖樣品加入層析柱，等樣品進入層析穩(wěn)定后依次加入100ml蒸餾水和100ml的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L)控制速度在1ml/min,每管5ml。利用硫酸-苯酚法對第1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110管中多糖的含量進行測定，用測得的數(shù)據(jù)繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線的峰值分別收集洗脫液進行濃縮、透析、冷凍、干燥獲得初步分離的榴蓮蜜多糖組分。葡萄糖凝膠預處理：將干燥的SephadexG-75/200葡聚糖凝膠粉末用蒸餾水浸泡24h使其充分溶脹僅可以用玻璃棒緩慢攪拌防止凝膠顆粒破損，采用濕法裝柱法將處理好的葡聚糖凝膠用蒸餾水溶解緩慢倒入層析柱(2.6*80)，期間要避免出現(xiàn)氣泡和流干水分，層析柱裝好后用蒸餾水平衡過夜。葡萄糖凝膠柱層析：將纖維素柱收集經(jīng)過濃縮透析的榴蓮蜜多糖利用膠頭滴管沿柱壁緩慢加入，等到其在葡萄糖凝膠柱中穩(wěn)定后依次加入100ml蒸餾水和100ml的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3mol/L），控制速度為1ml/min，每管5ml。用硫酸-苯酚法對第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78管中多糖含量進行檢測，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線峰值分別收集洗脫液后濃縮、冷凍、干燥獲得榴蓮蜜純多糖。3.5榴蓮蜜多糖紅外表征將1mg所得的榴蓮蜜多糖與KBr一起混合研磨然后壓片，對其進行紅外吸收進行測定。3.6響應面法優(yōu)化多糖提取工藝3.6.1模型擬合和統(tǒng)計分析根據(jù)單因素試驗結(jié)果，超聲時間、超聲頻率和料液比對榴蓮蜜果肉多糖提取率的影響更顯著，所以選擇這三個因素作為響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取榴蓮蜜果肉多糖的自變量。Box-Behken試驗設(shè)計和實驗數(shù)據(jù)列于表3中，通過對表3的數(shù)據(jù)進行線性擬合得到榴蓮蜜果肉多糖的二次多項回歸模型方程：表3Box-Behken試驗設(shè)計和結(jié)果功率/W時間/h料液比提取率40025016.43502401830014016.235024018.130034017.335033015.135024018.240014016.235013015.630023017.140034016.135024018.140023016.335035015.830025016.2535015015.335024018榴蓮蜜果肉多糖模型的方差分析結(jié)果詳見于表4，其中模型的顯著性通過F值和P值共同評估。具體來說，F(xiàn)值的大小與模型的顯著性呈正相關(guān)，而P值則與之呈負相關(guān)。觀察表4中的數(shù)據(jù)，我們可以發(fā)現(xiàn)榴蓮蜜果肉多糖模型的F值高達51.08，同時P值小于0.0001，這充分證明了該模型的顯著性極高。通過失擬項、決定系數(shù)（R2）和調(diào)整后決定系數(shù)（R2adj）對模型的擬合程度進行評價。榴蓮蜜果肉多糖模型的失擬項大于0.05，R2為0.9850，R2adj為0.9657表明模擬和程度較好，實驗值與預測值之間的關(guān)聯(lián)程度比較高。果肉的C.V.%為1.15，說明實驗具有精確性和可靠性。表4榴蓮蜜果肉多糖回歸模型方差分析平方和自由度均方F值P值模型17.1591.9151.08<0.0001A-功率0.427810.427811.470.0117B-時間0.245010.24506.570.0374C-料液比0.070310.07031.880.2121AB0.360010.36009.650.0172AC0.225610.22566.050.0435BC0.090010.09002.410.1643A20.526910.526914.120.0071B27.2917.229195.55<0.0001C26.6216.62177.42<0.0001殘差0.261170.0373失擬項0.153130.05101.890.2724純誤差0.108040.0270總誤差17.4116C.V（%）=1.15R2=0.9850adjR2=0.96573.6.2響應曲面圖分析響應曲面圖采用三維圖形技術(shù)，將二次回歸模型方程直觀地呈現(xiàn)出來，使我們能夠清晰地觀察到各因素交互作用對響應值的影響。若等高線形態(tài)更傾向于橢圓形，則表明兩種因素間的交互作用顯著。根據(jù)圖7所示，在C（料液比）保持恒定的情況下，隨著B（時間）的增加，榴蓮蜜多糖提取率先是上升而后下降；同時，隨著A（功率）的增加，提取率雖然也有所上升，但變化幅度相對較小。這一現(xiàn)象表明，時間在榴蓮蜜多糖的提取過程中扮演著至關(guān)重要的角色。再觀察圖8，當A（功率）保持固定時，隨著C（料液比）和B（時間）的增加，榴蓮蜜多糖提取率均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。然而，與C（料液比）相比，B（時間）的變化對提取率的影響更為顯著，進一步印證了時間在提取過程中的重要性。圖9則展示了在B（時間）保持恒定的情況下，隨著C（料液比）的增加，榴蓮蜜多糖提取率持續(xù)上升后逐漸放緩；同時，隨著A（功率）的增加，提取率也呈現(xiàn)緩慢上升后緩慢下降的趨勢。這顯示出料液比在提取過程中同樣具有不可忽視的影響。綜合以上分析，我們可以得出以下結(jié)論：各因素對榴蓮蜜多糖提取率的影響程度依次為時間、料液比和功率，這一結(jié)果與果肉回歸模型的方差分析結(jié)果相吻合。此外，根據(jù)等高線的形態(tài)，我們還可以推斷出時間與功率之間以及料液比與功率之間的交互作用對榴蓮蜜多糖提取率具有顯著的影響。圖7A（功率）和B（時間）對榴蓮蜜多糖提取率影響的響應面與等高線圖8B（時間）和C（料液比）對榴蓮蜜多糖提取率影響的響應面與等高線圖9A（功率）和C（料液比）對榴蓮蜜多糖提取率影響的曲面圖與等高線3.6.3最佳條件的確定與模擬驗證我們通過響應面分析法得到榴蓮蜜多糖的最佳條件為超聲功率365.78W，液料比47.90mL/g，超聲時間1.60h，預測值為18.89%；根據(jù)實際情況對參數(shù)進行修正，修正后榴蓮蜜多糖的最佳條件為超聲功率360W，液料比48mL/g，超聲時間1.5h。按最佳工藝參數(shù)進行三次平行實驗，得到榴蓮蜜多糖實際得率為19.02%，與預測值接近，說明模型可靠。4結(jié)果與討論4.1單因素實驗結(jié)果4.1.1超聲時間對榴蓮蜜多糖提取率的影響稱取5份5g去油榴蓮蜜粉末，其他條件相同，分別在提取時間為1h、2h、3h、4h的條件下提取榴蓮蜜多糖。通過觀察圖9我們可以發(fā)現(xiàn)在其他條件相同時榴蓮蜜多糖提取率隨超聲時間先上升后下降，最佳的超聲時間為2h。超過2h榴蓮蜜多糖提取率下降原因是超聲時間過長導致部分榴蓮蜜多糖水解使得多糖提取率下降。圖9超聲時間對榴蓮蜜多糖提取率的影響4.1.2超聲功率對榴蓮蜜多糖提取率的影響稱取5份5g去油榴蓮蜜粉末，其他條件相同，分別以功率200W、300W、400W、500W、600W對榴蓮蜜多糖進行提取。如圖10所示，榴蓮蜜多糖提取率隨超聲功率的上升先上升后下降，最佳超聲功率為400W。分析其原因是因為隨著超聲功率的不斷增加，使榴蓮蜜細胞破壞程度增加，榴蓮蜜細胞內(nèi)物質(zhì)滲出加快，榴蓮蜜多糖提取率增加。但功率過大時，榴蓮蜜細胞會被徹底破壞有許多除多糖外雜質(zhì)溶出導致提取率下降。圖10超聲功率對榴蓮蜜多糖提取率的影響4.1.3料液比對榴蓮蜜多糖提取率的影響稱取5份5g去油榴蓮蜜粉末，其他條件相同，分別以料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60添加蒸餾水提取榴蓮蜜多糖。通過圖11可知隨著料液比的增加榴蓮蜜多糖提取率先上升后下降，最佳料液比為1:40。這是因為在果肉細胞與溶劑充分接觸時，多糖會更容易溶出，但在溶劑濃度過高時，多糖的擴散速率會下降。圖11料液比對榴蓮蜜多糖提取率的影響4.2多糖提取4.2.1蛋白質(zhì)去除率蛋白質(zhì)溶液的標準曲線如圖12所示，它的線性回歸方程為Y=0.42863x-0.04104，R2=0.99076蛋白質(zhì)去除率的計算公式：蛋白質(zhì)去除率（%）=P1為蛋白質(zhì)去除前蛋白質(zhì)的含量，P2為蛋白質(zhì)除去后蛋白質(zhì)的質(zhì)量。通過計算得除蛋白質(zhì)的去除率為94.4%。圖12蛋白質(zhì)標準溶液標準曲線4.2.2多糖提取率0.1mg/mL的無水葡萄糖溶液標準曲線如圖13所示，它的線性回歸方程為Y=0.67101x-0.12131，R2=0.99074。多糖提取率的計算公式：多糖提取率（%）=C?V?N在式中，C為榴蓮蜜多糖濃度（mg/mL）V為榴蓮蜜多糖溶液體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為預處理榴蓮蜜樣品質(zhì)量（mg）。計算得出榴蓮蜜多糖多糖提取率為18.8%。圖13多糖標準曲線4.2.3DE-52纖維柱洗脫結(jié)果圖14為纖維素柱層析洗脫曲線，峰越高糖含量越多，所以收集圖中最高峰的洗脫液LD-M,進行旋蒸濃縮，然后將旋蒸濃縮后的溶液放入超純水中透析。圖14DE-52纖維素柱洗脫曲線4.2.3葡聚糖凝膠G-200洗脫結(jié)果圖15為凝膠柱層析洗脫曲線，收集圖中最高峰的洗脫液LG-MN，將收集到的洗脫液進行旋蒸濃縮，然后將濃縮液放入透析袋中于超純水中進行透析，將透析液冷凍干燥獲得榴蓮蜜純多糖（LG-MN）。圖15葡聚糖凝膠G-200洗脫曲線4.2.4榴蓮蜜多糖的電子顯微鏡結(jié)果圖16圖A（放大500倍）圖B（放大3000倍）LG-MN的表面形態(tài)如圖16所示。從掃描電子顯微鏡可以看出，LG-MN在放大500倍時呈現(xiàn)棒狀和塊狀的簇狀結(jié)構(gòu)(圖16A)。在3000倍放大下，LG-MN表面為光滑的棒狀結(jié)構(gòu)具有很好的空間間隙(圖16B)。4.2.5榴蓮蜜多糖紅外表征LG-MN的紅外光譜如圖17所示，3421.56cm-1處的強寬吸收峰為O-H的伸縮振動，2922.94cm-1處的吸收峰是因為C-H鍵的伸縮振動。1653.33cm-1和1636.05cm-1處的峰是C=O拉伸振動引起的。1419.53cm-1、1350.65cm-1和1270.27cm-1處三個吸收峰是C-H的變角振動引起的吸收峰。1154.04cm-1、1107.15cm-1和1017.08cm-1處的峰可能是C-O的不對稱拉伸引起的。761.93cm-1處的吸收峰為D-吡喃環(huán)的伸縮振動[20]，說明LG-MN是一種含有D-吡喃環(huán)的多糖。圖17LG-MN的紅外光譜圖5結(jié)論本文優(yōu)選海南本地榴蓮蜜，通過響應曲面法對超聲提取法的條件進行優(yōu)化得到最佳提取功率：360W、時間：1.5h、液料比：44.8mL/g，發(fā)現(xiàn)其中最主要的影響因子是超聲作用的功率。并利用硫酸-苯酚法及考馬斯亮藍法測得榴蓮蜜多糖提取率與蛋白質(zhì)去除率分別為18.8%和94.4%。通過DEAE-52和葡聚糖凝膠-G200對其分離純化最后收集含量最高的組分LG-MN。通過組分的SEM圖像發(fā)現(xiàn)榴蓮蜜多糖在3000倍放大下表面是光滑的棒狀結(jié)構(gòu)且具有很好的空間間隙。在紅外譜圖中發(fā)現(xiàn)LG-MN多糖具有D-吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。參考文獻Integer《MonacoNatureEncyclopedia》農(nóng)業(yè)部發(fā)展南亞熱帶作物辦公室編．中國熱帶南亞熱帶果樹董寶寶譯《榴蓮蜜變溫間歇干燥干燥技術(shù)與設(shè)備》張翠玲，文慧婷《尖蜜拉的快繁技術(shù)》朱科學，譚樂和，張彥軍，賀書珍，徐飛《菠蘿蜜果肉中多糖免疫調(diào)節(jié)作用及其機制研究》JingchunYang,ShuaiyiDong,XuZhou,WenZhang,YunzhuGu，LixueZheng,GuihongYang,JingWang,YangZhang《PolysaccharidesfromwasteZingibermiogaleaves:Ultrasonic-microwave-assistedextraction,characterization,antioxidantandanticoagulantpotentials》panelBoboLin,ShashaWang,AnqiZhou,QiuruiHu,GangliangHuang《Ultrasound-assistedenzymeextractionandpropertiesofShatianpomelopeelpolysaccharide》王冰月，劉錢，黃楊紅《\t"/paper/1212921083173085192/_blank"螺旋藻多糖的提取及其活性評價》王明明，張莊莊，徐玉庭，孟庭馬，天明市，井中泉《六種提取方法對青大麥葉多糖分子組成和抗氧化活性的影響》LongzhanGan,XiaoguangLi,HemingZhang,RuoshiZhang,HongbinWang,ZheXu,BiyuPeng,YongqiangTian《Preparation,characterizationandfunctionalpropertiesofanovelexopolysaccharideproducedbythehalophilicstrainHalomonassaliphilaLCB169T》王廣哲《藻藻素的分離純化屬通過膨脹床吸附和