DB11北京市市場監(jiān)督管理局發(fā)布 ）；）；）；）；）；f)實(shí)驗(yàn)豬和實(shí)驗(yàn)小型豬各等級病原微生物檢測方法增加了豬流感、非洲豬瘟、豬輪狀病毒（見）；）；本文件由北京市科學(xué)技術(shù)委員會、中關(guān)村科技園區(qū)管理委員會業(yè)協(xié)會、北京市標(biāo)準(zhǔn)化研究院、北京大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)本文件主要起草人：岳秉飛、王淑菁、馮育芳、李曉波、邢進(jìn)、王吉、付瑞、賀爭鳴、姚文生、康凱、任小俠、印春生、范學(xué)政、吳思捷、張瑩輝、趙俊杰、劉瑩、程君生、薛麟、李根平、王熙、文、杜小燕、韋玉生、李夏瑩、田永路、代解杰、孫實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測貓、實(shí)驗(yàn)雞、實(shí)驗(yàn)鴨、實(shí)驗(yàn)鵝、實(shí)驗(yàn)鴿、實(shí)驗(yàn)魚（斑馬魚法對待檢實(shí)驗(yàn)動物的精神狀態(tài)、行為、被毛、天然孔分泌物進(jìn)行外觀病毒流行性乙型腦炎（Japaneseencephalitis▲▲●-▲▲豬瘟病毒（Classicalswinefev▲▲偽狂犬病病毒（Pseudorabies●●非洲豬瘟病毒（Africanswine●●（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespirator●-●●▲▲○○○-（Porcinereproductiveandrespirato-▲-●流行性乙型腦炎病毒（Japaneseencephaliti●●●○豬流感病毒（Swineinfluenz●●●●豬水泡病毒（Swinevesicula●●●●（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespirator●-●●○○●●偽狂犬病病毒（Pseudorabies●●非洲豬瘟病毒（Africanswin●●●●豬細(xì)小病毒（Porcineparv●●（Porcinereproductiveandrespirato●●●●●●●●豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastro●●豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrhe●-支氣管敗血波氏桿菌（Bordetellabronchiseptica）/產(chǎn)毒素性多殺巴氏桿菌●●●-豬輪狀病毒（Porcinerota●●-●豬水泡病病毒（Swinevesiculardiseas-○-○●●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物▲▲▲▲●-○○○○○-○○小反芻獸疫病毒（Pestedespetitsru-▲綿羊/山羊痘病毒（Sheep/Goat-▲●●●●●-○○○○○-○○牛病毒性腹瀉-粘膜病毒（Bovineviraldiar●-牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectiousbovinerhinotrac●-●●胎兒彎曲桿菌（Campylobacterfetus）●●●-●-●●○○牛流行熱病毒（Bovineephemera○-小反芻獸疫病毒（Pestedespetitsru-●綿羊/山羊痘病毒（Sheep/Goat-●偽狂犬病病毒（Pseudorabies-●-●-●梅迪-維斯納病毒（Maedi-visn-○山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒b（Caprinea-○綿羊肺腺瘤病毒a（Ovinepulmonary-○●●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物物●○●●●●●○●●●●○猴免疫缺陷病毒（Simianimmunodefi●●●●空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni）○○●物●物●●●○●●●○●●小鼠肺炎病毒（PneumoniaVirusofMice）●●小鼠細(xì)小病毒（MinuteVirusofMice）●●●●●●●幽門螺桿菌（Helicobacterpyl●●●●○○○○○物●物●●●●犬瘟熱病毒（Caninedistemp▲▲▲●●●●●●●○○○○○○○●犬瘟熱病毒（Caninedistemp●●●○物●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物物貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Felinepanleukopenia▲貓杯狀病毒（Felinecalic▲▲▲●○貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Felinepanleukopenia●貓杯狀病毒（Felinecalic●●●●○貓免疫缺陷病毒（Felineimmunodeficien●貓傳染性腹膜炎病毒（Felineinfectiousperitonit●貓腸道冠狀病毒（Felineentericcorona○貓白血病病毒（Felineleuke○●●○○○○○○物●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物表7實(shí)驗(yàn)雞、實(shí)驗(yàn)鴨、實(shí)驗(yàn)鵝、實(shí)驗(yàn)鴿各等級物▲▲▲○▲●●●▲---▲---傳染性喉氣管炎病毒（InfectionLary▲---傳染性法氏囊病病毒（InfectionBu▲---▲---▲---▲---●---▲---▲----▲●--●●○-●●●-●●●--▲-動物●●●○●●●●●---●---傳染性喉氣管炎病毒（InfectionLary●---傳染性法氏囊病病毒（InfectionBu●---●---●○○-●---●---●---●---●---●●●-●---●---●--○●---●---○●●○-●●--●●●-●●●-●---●●---●----●物●●●●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物●●●●●●○●●●●●●○●●●●●●○○○○○●物●●●●●●●●○○○●●空腸彎曲桿菌（Campylobaceterjejuni）○○○物●注：?▲”表示必檢項(xiàng)，普通級實(shí)驗(yàn)動物可以免疫，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物6.1.1實(shí)驗(yàn)小型豬、實(shí)驗(yàn)豬、實(shí)驗(yàn)牛、實(shí)驗(yàn)羊、實(shí)驗(yàn)狨猴、實(shí)驗(yàn)長6.1.2麻醉應(yīng)根據(jù)不同動物種類、采集部位決定是否需要麻醉。需6.1.3釆血以及毛發(fā)、皮屑、鼻咽拭子、肛拭子（或新鮮糞便）的采樣方法參照N!↓!!!!↓!!!!↓↓禽腺病毒III群注：抗酸染色（ZIRC）方法參考2012年4月ZebrafishDiseaseManual,M.L.Ke按微生物和寄生蟲采樣要求聯(lián)合取樣，隨機(jī)抽樣。抽樣月齡按表1>500按照檢測規(guī)則，若檢測指標(biāo)有1項(xiàng)（含）以上不合空白對照：在擴(kuò)增反應(yīng)階段設(shè)置。以滅菌雙蒸水作根據(jù)vp2基因序列（GenBank：AF015上游引物序列（5′-3′）：AGTTCAACAAG）：A.4.1PCR反應(yīng)體系20μL體系包括10×PCRbuffer（含Mg2+）2μL，dNTP（21μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA2μL，最后用滅菌雙A.4.2PCR反應(yīng)條件陽性對照出現(xiàn)301bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)301bp目的片段時，判定貓泛白細(xì)胞減少癥病毒陽性；未出現(xiàn)301bp目的片段時，判定貓泛白細(xì)胞減少癥病毒陰性?？瞻讓φ眨涸跀U(kuò)增反應(yīng)階段設(shè)置。以滅菌雙蒸水作U/μL）0.5μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。上游引物序列（5′-3′）：AACCTGCGC）：25μL體系包括10×PCRbuffer（含Mg2各1.5μL，Taq酶（5U/μL）1.0μL，模板cDNA2μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。陽性對照出現(xiàn)926bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)926bp目的片段時，空白對照：在擴(kuò)增反應(yīng)階段設(shè)置。以滅菌雙蒸水作上游引物序列（5′-3′）：ATACTGTCCGCA）：20μL體系包括10×PCRbuffer（含Mg2+）2μL，dNTP（21μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA2μL，最后用滅菌雙陽性對照出現(xiàn)531bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)531bp目的片段時，判定貓皰疹病毒I型陽性；未出現(xiàn)531bp目的片段時，判定貓皰疹病毒I型陰性?？瞻讓φ眨涸跀U(kuò)增反應(yīng)階段設(shè)置。以滅菌雙蒸水作U/μL）0.5μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。上游引物序列（5′-3′）：AGAACCTGGTGATA）：探針（5′-3′FAM）TATGCCTGTGGAGGGCCTTCCT（TAMRA）50μL體系包括2×Mixbuffer25μL，上下游引物（10μM）待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，判定貓免疫U/μL）0.5μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。）：）：25μL體系包括10×PCRbuffer（含Mg2各1.5μL，Taq酶（5U/μL）1.0μL，模板cDNA2μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。陽性對照出現(xiàn)223bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)223bp目的片段時，判定貓傳染性腹膜炎病毒陽性；未出現(xiàn)223bp目的U/μL）0.5μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。）：）：各1.0μL，Taq酶（4U/μL）0.5μL，模板cDNA1.0μL，最后用滅菌雙蒸水陽性對照出現(xiàn)366bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)366bp目的片段時，判定貓腸道冠狀病毒陽性；未出現(xiàn)366bU/μL）0.5μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。）：）：），待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，判定貓白血）：）：）：），待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，判定巴）：）：陽性對照出現(xiàn)269bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)有效；待檢樣品出現(xiàn)269bp目的片段時，判定空腸彎曲桿菌陽性；未出現(xiàn)269bp目的片段時，判定空腸彎曲桿菌陰性。）：）：），待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，判定鴿實(shí)驗(yàn)魚中偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和海分枝桿菌的區(qū)分鑒定方法按照表K.1的規(guī)---+---±--++-+-+++±+++±++++--按照WS/T-2024實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用指南進(jìn)行細(xì)菌DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳和結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)魚有關(guān)細(xì)菌的屬或種特異性PCR擴(kuò)增引物見表L.1。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的分子克隆AGRGTTTGATCMTGGCTCAGFlavobacteriumpsychrophAGAGTTTGATCATGGCTCAGF.psychrophilum巢式PCRMycobacterium巢式PCRAATGGGCGCAAGCCTGATGMycobacteriumhaemophiAAATCAGGCTCGGGCCCTGCAATTTT(A/G)TC(A/G/T)AC(CACCAAGAAGGTGACTTTAACGTTCGATTTCATCACGTTGAAGGGGAAATCGCAAGTGCCATATCTGATTGGGCCGTCTAAU/μL）1μL，模板RNA8μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至20μL。外圍上游引物TRV-F15’-CCATGATACTGACTCAGTTTGGACCG-3’下游引物TRV-R15’-CACTAAGAAAATACCRCTAGTRCAWGCCAT-內(nèi)圍上游引物TRV-F25’-GATTAAGGC下游引物TRV-R25’-GACAAGGGCRTRRCTCCCATGTACAT-雙蒸水補(bǔ)至25μL。在陰性、陽性對照有效的條件下，待測樣品擴(kuò)增得到513bp特異性條帶判為陽性，未擴(kuò)增則判為陰性。對陽性檢測結(jié)果，再用同一PCR或E上游引物5’-GCGGAGCAAATTGTAGGGTA-3’下游引物5’-TCGTGCGGCTGGCGTTTT-3’25μL體系包括10×Mixbuffer2.5μL，上下游雙蒸水補(bǔ)至25μL。在陰性、陽性對照有效的條件下，待測樣品擴(kuò)增得到495bp特異性條帶判為陽性，未擴(kuò)增則判為陰性。對陽性檢測結(jié)果，再用同一PCR或E在血瓊脂平板上35℃±2℃培養(yǎng)18-24h，可蔓延成波紋狀薄膜，布滿整個平板表面（遷徙現(xiàn)象）；在SS平板上為無色透明中心黑色或灰色、中等大小菌落；在麥康凱瓊脂平