《實驗動物呼腸孤病毒Ⅲ型檢測方法》GB14926.25修訂編制說明根據(jù)國家標準委員會2023年國家標準復審修訂計劃（國標委發(fā)[2023]642025年2月，標準編制組在北京召開線下會議，就標準的編制格式做了統(tǒng)一部依據(jù)工作分工，廣東省生物技術研究院（廣小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠必須排除的病原項目。1994年，國家質量技術監(jiān)督局發(fā)布實施實驗動物質量標準準GB14922，第一次以技術標準的形式提出實驗動的提高起到了非常重要的作用。實驗動物國家標準呼腸孤病毒Ⅲ型檢測方法做確認試驗。ELISA抗體檢測因方法穩(wěn)定、高通量、高敏感性而且商品化試劑較成熟，易于操作，仍然是我國實驗動物呼腸歐盟許多實驗動物質量檢測實驗室都推薦采用抗體檢測結合核酸檢測作為設施質量控制的完整技術體系。國內一些實驗動物檢測機構也開展了實驗動物病原量檢測之外，還可以應用于實驗動物產品、實驗動物接種物和污染環(huán)境評價等，孤病毒Ⅲ型核酸檢測方法研究。所建立的Reo3核酸檢測方法與小鼠肝炎病毒1.科學性原則。在尊重科學、親身實踐、調查研究的基礎上2.可操作性原則。本標準無論是從樣品采集，處理，RNA抽提，PCR反應，均c.新增核酸檢測方法，包括核酸檢測原理（見第3六、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技度（0.05~0.5μM）進行優(yōu)化，以反應的前3-15個循環(huán)的熒光信號為熒光本底信來判斷優(yōu)化結果；采用二溫循環(huán)法對反應的退火溫度表2Reo3實時熒光RT-PCR特異性試驗編號樣本平均Ct特異性樣本N-1陰性樣本NotN-2陰性樣本NotN-3陰性樣本NotN-4BHK細胞對照NotN-5仙臺病毒NotN-6小鼠肝炎（MHV）NotN-7小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）NotN-8小鼠肺炎病毒（PVM）NotN-9小鼠諾如病毒（MNV）NotN-10小鼠出血熱病毒（HV）NotN-11淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）NotP1呼腸孤病毒（Reo3）24圖1Reo3實時熒光RT-PCR特異性試驗6.4敏感性試驗將Reo3RNA標準品Easydilution（Takara公司）做10倍系列稀釋，得到結果可見各梯度之間間隔的Ct值基本相等，無模板對照（Notemplatecontrol，2標準品在1×109copies/μL~1×102copies/圖2Reo3實時熒光RT-PCR敏感性檢測結果1-8依次為1×109copies/μL至1×102copies/μL標準品，9、10為NTC和無模板對照。表3標準曲線對應Ct值樣品名稱拷貝數(shù)標準品19標準品28標準品37標準品46標準品55標準品64標準品7標準品800只進行人工感染小鼠Reo3試驗，感染后（0-129d）不同時間段采集樣本進行抗接種后18d抗體陽性，之后抗體效價逐漸升高，在25d抗體稀釋度達到128表4染小鼠抗Reo-3血清抗體的測定047 ±±±±±±±±±±±抗體滴度為能檢出陽性結果的最大稀釋倍數(shù)log2數(shù)值。、感染靶器官病毒含量的測定（圖3）感染早期小鼠以肝(Liver)病毒載量最高,其次是心(Heart)、脾(Spleen)、圖3感染小鼠各內臟組織核酸測定（n=1~3）表5抗體檢測與核酸檢測規(guī)律圖樣本采集時間00/160/1640/38/168/163/3256/6355/56/163/16729/90/243/33/24應同時設置陽性對照和陰性對照。對2012-2015年送檢的96份SPF級小鼠盲腸內容物進行檢測，結果檢出0份陽性，陽性率為0。6.6第三方實驗室驗證依據(jù)廣東省生物技術研究院（原廣東省實驗動物監(jiān)測所，簡稱廣東生研6.5.2驗證單位：中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所、蘇州西山生物技術有限6.5.3驗證方法：由廣東生研院負責樣品的制備、驗證及發(fā)樣，驗證單位采用各廣東省實驗動物監(jiān)測所采用實驗動物團體標準所述Reo-3PCR檢測方法與3測，檢測結果均與被檢項目結果一致。說明所建立的ReoReo3核酸檢測實驗室間比對結果序號比對樣本編號驗證單位檢測方法結果符合性1T20170703-F1中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所RT-PCR一致2T201