二輪復習雙脫氧鏈終止法測序雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法（Sanger測序）是一種用于確定DNA序列的經(jīng)典方法，由FrederickSanger在1977年發(fā)明。該方法的核心原理是在DNA聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸存在的情況下，通過引入四種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），這些ddNTP的3'端缺少羥基，不能與下一個dNTP結合，導致DNA合成在遇到ddNTP時停止。這樣，在每個反應系統(tǒng)中，都會合成一系列長度不等的核酸片段，通過電泳分離后，可以根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基順序讀取合成片段的堿基序列，從而確定DNA的序列。雙脫氧法測序原理雙脫氧法測序脫去兩個磷酸基團后，是腺嘌呤脫氧核苷酸，DNA的原料之一。雙脫氧法測序PCR過程中，dNTP脫去兩個磷酸基團后作為子鏈合成的原料，并且斷開特殊化學鍵所釋放的能量還能供能。雙脫氧法測序雙脫氧法測序注意1、ddNTP的3’端沒有-OH，所以其后面無法與另一個dNTP或ddNTP形成磷酸二酯鍵。注意2、ddNTP與dNTP在反應體系中是相互競爭的。雙脫氧法測序雙脫氧法測序雙脫氧法測序過程1、擴增出足夠多的待測樣本，加熱解旋，保留單鏈作為測序模板鏈。2、測序模板鏈結合引物后，加入試管中，并向試管中加入足量的DNA聚合酶、4種dNTP和1種特定的ddNTP。雙脫氧法測序過程雙脫氧法測序過程3、延伸。在進行DNA擴增時，一旦ddNTP與模板鏈發(fā)生互補配對，子鏈延伸就停止了，從而得到不同長度的擴增產(chǎn)物。雙脫氧法測序過程4、將擴增得到的不同長度的產(chǎn)物進行電泳分離，得到子鏈種某種ddNTP的相對含量。雙脫氧法測序過程5、按照相同的方法，得到分別加入ddTTP、ddGTP、ddCTP的擴增產(chǎn)物電泳圖。雙脫氧法測序過程6、根據(jù)擴增產(chǎn)物電泳圖，分析測序模板鏈的堿基序列。由于小片段在前，大片段在后，因此我們需要逆向讀取序列。模板CCGGTAGCAACT3′5′GG引物酶dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCddAGGCCATCGTTGddAGGddCGGCddCGGCCATddCGGCCATCGTTddGGGCCATCddGGGCCAddTGGCCATCGddTGGCCATCGTddTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補序列讀出模板序列自動化DNA測序4種發(fā)射波長不同的熒光物質(zhì)分別標記4種ddNTP，終止反應后，4管反應物在同一泳道電泳(毛細管電泳)，用激光掃描收集電泳信號，計算機處理，可將序列直接打印出來。一次可測定700個左右核苷酸序列。1、雙脫氧末端終止法測定DNA序列是指將3’碳脫氧的雙脫核苷酸（ddATP/ddTTP/ddGTP/ddCTP）混入正常的PCR體系進行擴增，并通過電泳結果讀出DNA序列。例如，在通過單側引物對單鏈DNA進行延伸時，將ddATP混入正常的4種脫氧核苷酸（dATP/dTTP/dGTP/dCTP）中作為原料。則每次遇到模版堿基為T時，子鏈上添加的單體可能是ddATP，也可能是dATP。若連接的是dATP，則延伸可繼續(xù)進行；若連接的是ddATP，則此時3’末端無氧原子，不能連接下一個單體，延伸終止。反應結束后，將產(chǎn)物加入A泳道內(nèi)電泳。C、G、T泳道內(nèi)情況依次類推，最終電泳結果如下圖所示。練一練（1）T泳道內(nèi)有3個不同長度的條帶，說明合成子鏈時，T堿基被添加了____次；在電泳圖中，最小的產(chǎn)物位于______泳道，說明延伸時第一個添加的堿基是________；（2）合成的全長的子鏈序列是5’-_____________________________-3’，被測序的單鏈的序列是5’-_____________________________-3’。3CCCCATCGTTGATCAACGATGG練一練2、雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與脫氧核苷三磷酸（dNTP）的結構如圖所示。已知ddNTP按堿基互補配對的方式加到正在復制的子鏈中后，子鏈的延伸立即終止。某同學要通過PCR技術獲得被32P標記且以堿基"C"為末端的、不同長度的子鏈DNA片段。在反應管中已經(jīng)有單鏈模板、引物、DNA聚合酶和相應的緩沖液等，還需要加入下列哪些原料()A練一練①dGTP,dATP,dTTP,dCTP②dGTP,dATP,dTTP③a位32P標記的ddCTP④γ位32P標記的ddCTPA.①③

B.①④C.②③

D.②④3、Sanger法(雙脫氧鏈終止法)是核酸序列測定的一種方法。實驗所用的反應體系包括待測序的單鏈DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸(其中一種用放射性同位素標記)和DNA聚合酶。整個實驗分為四組，每組按一定比例加入一種底物類似物(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP)，它能隨機摻入合成的DNA鏈，一旦摻入后DNA合成立即終止，獲取DNA片段的電泳(其分離原理僅依據(jù)分子量大小)結果如圖所示。下列分析錯誤的是()A.該測定過程需要借助PCR技術完成B.圖中①②處分別為ddTTP和ddATPC.據(jù)圖可知，本次測序凝膠電泳的方向為從上往下D.終止DNA合成的原因是底物類似物不能與下一個脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵B練一練4、(不定項)(2024·湖南，15)最早的雙脫氧測序法是在PCR反應體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及