Chemerin-9：實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤抑制作用的深度剖析與機(jī)制探究一、引言1.1腹主動(dòng)脈瘤研究背景腹主動(dòng)脈瘤（AbdominalAorticAneurysm，AAA）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的血管疾病，近年來受到了廣泛的關(guān)注。其主要特征為腹主動(dòng)脈局部永久性擴(kuò)張，當(dāng)擴(kuò)張程度達(dá)到正常直徑的1.5倍以上時(shí)，即可診斷為腹主動(dòng)脈瘤。AAA具有較高的發(fā)病率和死亡率，給患者和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在全球范圍內(nèi)，AAA的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和壽命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在65歲以上的老年人群中，AAA的發(fā)病率約為8.8%，且男性發(fā)病率高于女性，男女比例約為4:1。AAA在早期通常無明顯癥狀，這使得很多患者在疾病進(jìn)展到較為嚴(yán)重的階段才被發(fā)現(xiàn)。一旦瘤體破裂，患者的死亡率極高，可達(dá)90%以上。著名地質(zhì)學(xué)家李四光和偉大物理學(xué)家愛因斯坦均因腹主動(dòng)脈瘤破裂而離世，這也凸顯了AAA的兇險(xiǎn)性。AAA的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素。目前普遍認(rèn)為，動(dòng)脈硬化是其最常見且主要的原因。動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化后，管壁增厚，營養(yǎng)供應(yīng)出現(xiàn)障礙，動(dòng)脈內(nèi)膜隨之發(fā)生退行性變化，進(jìn)而導(dǎo)致腹主動(dòng)脈瘤的形成。此外，創(chuàng)傷、感染等也可能引起動(dòng)脈壁的局限性膨出，引發(fā)腹主動(dòng)脈瘤。從病理改變來看，AAA主要表現(xiàn)為慢性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管平滑肌細(xì)胞凋亡等，這些變化相互作用，共同推動(dòng)了疾病的發(fā)展。由于AAA發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，建立合適的動(dòng)物模型對于深入研究其發(fā)病機(jī)制和探索有效的治療方法具有重要意義。通過動(dòng)物模型，研究人員可以模擬人類AAA的發(fā)生發(fā)展過程，在可控的實(shí)驗(yàn)條件下，對各種影響因素進(jìn)行研究，從而為臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。目前，常用的小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型主要有血管緊張素II（ANGII）輸注的脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠模型和豬胰腺彈性酶灌注的C57BL/6野生型小鼠模型等。這些模型在一定程度上能夠反映AAA的病理特征，為相關(guān)研究提供了有力的工具。1.2Chemerin-9研究現(xiàn)狀Chemerin-9，作為一種具有獨(dú)特生物學(xué)活性的新型多肽，近年來在多個(gè)研究領(lǐng)域嶄露頭角，引發(fā)了眾多科研人員的濃厚興趣。在免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，Chemerin-9扮演著關(guān)鍵角色。它能夠與趨化因子樣受體1（CMKLR1）緊密結(jié)合，進(jìn)而激活一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如Akt和ERK的磷酸化過程。這些信號(hào)通路的激活，有效地調(diào)節(jié)了免疫細(xì)胞的遷移、增殖和活化，對維持機(jī)體的免疫平衡起著重要作用。當(dāng)機(jī)體遭受病原體入侵時(shí)，Chemerin-9可以引導(dǎo)免疫細(xì)胞迅速到達(dá)感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，從而幫助身體抵御疾病。在代謝調(diào)節(jié)方面，Chemerin-9也展現(xiàn)出重要的功能。研究表明，它參與了脂肪細(xì)胞的分化和糖代謝的調(diào)控過程。在脂肪細(xì)胞分化過程中，Chemerin-9可以影響相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的成熟和分化，維持脂肪組織的正常功能。在糖代謝方面，Chemerin-9能夠調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，影響葡萄糖的攝取和利用，對維持血糖的穩(wěn)定具有積極意義。此外，Chemerin-9還在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中展現(xiàn)出潛在的治療價(jià)值。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，它能夠改善Aβ1-42誘導(dǎo)的記憶障礙，這為阿爾茨海默病等記憶障礙性疾病的治療提供了新的思路和方向。然而，目前關(guān)于Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤影響的研究仍處于起步階段。腹主動(dòng)脈瘤作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的血管疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管平滑肌細(xì)胞凋亡等多個(gè)病理過程。鑒于Chemerin-9在免疫調(diào)節(jié)和抗炎等方面的顯著作用，探討其對腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。通過深入研究Chemerin-9與腹主動(dòng)脈瘤之間的關(guān)系，有望揭示腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病的新機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究Chemerin-9對實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用及其潛在機(jī)制，為腹主動(dòng)脈瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。從理論意義來看，目前腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，盡管已知涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管平滑肌細(xì)胞凋亡等多個(gè)病理過程，但仍存在許多未知環(huán)節(jié)。Chemerin-9作為一種在免疫調(diào)節(jié)和抗炎等方面具有顯著作用的新型多肽，對其在腹主動(dòng)脈瘤中的作用研究處于起步階段。通過本研究，有望揭示Chemerin-9與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制之間的內(nèi)在聯(lián)系，豐富和完善腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病理論，為進(jìn)一步深入理解該疾病的發(fā)生發(fā)展過程提供新的視角和理論依據(jù)。在實(shí)踐意義方面，腹主動(dòng)脈瘤具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康，而目前臨床上缺乏有效的藥物治療手段。手術(shù)治療雖為主要方式，但存在創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)高以及術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長等諸多問題，對于一些身體狀況較差、無法耐受手術(shù)的患者，治療選擇極為有限。若能證實(shí)Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤具有抑制作用，將為腹主動(dòng)脈瘤的治療開辟新的途徑，為開發(fā)新型藥物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支持，有望改善患者的治療效果，降低死亡率，提高患者的生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，共計(jì)60只，體重在20-25g之間。小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。選擇該品系小鼠是因?yàn)镃57BL/6小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，其遺傳背景清晰，對實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)較為穩(wěn)定，能夠?yàn)檠芯刻峁┛煽康膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。雄性小鼠在腹主動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建中具有較高的成瘤率，能更有效地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此選擇雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。小鼠飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)施名稱]，該設(shè)施為屏障環(huán)境，溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50±5%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律。小鼠自由攝食和飲水，飼料為[飼料品牌及型號(hào)]，符合國家標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物全價(jià)營養(yǎng)飼料，飲用水為經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純凈水。飼養(yǎng)環(huán)境定期進(jìn)行清潔和消毒，以確保小鼠生活在清潔、衛(wèi)生的環(huán)境中，減少外界因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展前，本研究方案經(jīng)過了[倫理委員會(huì)名稱]的嚴(yán)格審查和批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為[批準(zhǔn)文號(hào)]。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》等相關(guān)法規(guī)和倫理準(zhǔn)則，最大限度地減少動(dòng)物的痛苦。在手術(shù)操作過程中，對小鼠進(jìn)行充分的麻醉，使用[麻醉劑名稱及劑量]，確保小鼠在無痛狀態(tài)下接受手術(shù)。術(shù)后密切觀察小鼠的恢復(fù)情況，給予必要的護(hù)理和治療，如傷口消毒、抗生素預(yù)防感染等。對于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的小鼠，采用[安樂死方法]進(jìn)行安樂死處理，確保動(dòng)物死亡過程迅速且無痛苦。2.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：Chemerin-9，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，純度≥98%，其在實(shí)驗(yàn)中作為關(guān)鍵的研究對象，用于對小鼠進(jìn)行干預(yù)處理。血管緊張素II（ANGII），購自[供應(yīng)商名稱]，規(guī)格為[具體規(guī)格]，在構(gòu)建小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中發(fā)揮重要作用，通過微滲透泵持續(xù)輸注ANGII，誘導(dǎo)小鼠腹主動(dòng)脈瘤的形成。豬胰腺彈性酶，來自[品牌及供應(yīng)商]，活性為[具體活性單位]，在構(gòu)建豬胰腺彈性酶灌注的小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型時(shí)，用于對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行灌注，以破壞血管壁的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成?？贵w類試劑有：兔抗小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）多克隆抗體，購自[供應(yīng)商]，貨號(hào)為[貨號(hào)]，用于檢測小鼠腹主動(dòng)脈組織中MMP-2的表達(dá)水平，以了解細(xì)胞外基質(zhì)降解情況；兔抗小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體，同樣購自[供應(yīng)商]，貨號(hào)[對應(yīng)貨號(hào)]，用于檢測MMP-9的表達(dá)。此外，還有兔抗小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）多克隆抗體、兔抗小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）多克隆抗體等，分別用于檢測炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，以評(píng)估炎癥反應(yīng)程度。其他試劑包括：蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[品牌]，用于對小鼠腹主動(dòng)脈組織切片進(jìn)行染色，以便在顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學(xué)變化；Masson三色染色試劑盒，來自[供應(yīng)商]，用于觀察血管壁中膠原纖維的分布和變化情況；免疫組織化學(xué)檢測試劑盒，購自[公司]，用于檢測各種蛋白在組織中的定位和表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器有：高頻超聲檢測儀，型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[生產(chǎn)廠家]，在實(shí)驗(yàn)過程中，利用該儀器定期對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行超聲檢測，測量腹主動(dòng)脈的直徑，動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈瘤的形成和發(fā)展情況。石蠟切片機(jī)，型號(hào)[具體型號(hào)]，由[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)，用于將固定后的小鼠腹主動(dòng)脈組織切成薄片，以便進(jìn)行后續(xù)的染色和觀察。光學(xué)顯微鏡，型號(hào)為[顯微鏡型號(hào)]，配備了高分辨率的成像系統(tǒng)，可對染色后的組織切片進(jìn)行觀察和拍照，用于分析組織的病理變化。酶標(biāo)儀，型號(hào)為[具體型號(hào)]，購自[廠家]，用于檢測ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，從而定量分析相關(guān)因子的含量。蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，品牌為[品牌名稱]，型號(hào)分別為[對應(yīng)型號(hào)]，用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，以便進(jìn)行Westernblot檢測，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。2.3實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型建立2.3.1模型建立方法選擇目前，構(gòu)建小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型的方法眾多，其中血管緊張素II誘導(dǎo)和彈力蛋白酶灌注是較為常用的兩種方法。血管緊張素II誘導(dǎo)的模型，通常選用載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠，通過微滲透泵持續(xù)輸注血管緊張素II，其成瘤部位多在腎上腹主動(dòng)脈，也可見于胸主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓。該模型能夠較好地模擬人類腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中的血壓升高等全身性因素影響，對于研究高血壓等全身性因素與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系具有重要意義。然而，ApoE-/-小鼠價(jià)格相對昂貴，飼養(yǎng)條件要求較高，且實(shí)驗(yàn)周期相對較長，一般需要28天左右才能形成較為明顯的動(dòng)脈瘤。彈力蛋白酶灌注法，多選用C57BL/6野生型小鼠，通過對腎下腹主動(dòng)脈進(jìn)行彈力蛋白酶灌注來構(gòu)建模型。此方法的成瘤率較高，術(shù)后14天左右即可形成明顯的動(dòng)脈瘤，且能較好地呈現(xiàn)動(dòng)脈瘤發(fā)展中的炎癥過程，如彈性纖維斷裂、平滑肌耗竭和炎癥反應(yīng)增加等典型的腹主動(dòng)脈瘤病變特征。其操作相對簡單，成本較低，實(shí)驗(yàn)周期較短，對于初步探究腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)行藥物干預(yù)研究具有一定優(yōu)勢。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)的研究目的、成本、實(shí)驗(yàn)周期等因素，本研究選擇豬胰腺彈性酶灌注的C57BL/6野生型小鼠模型。C57BL/6小鼠遺傳背景清晰，對實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)較為穩(wěn)定，且價(jià)格相對低廉，飼養(yǎng)條件相對容易滿足。采用豬胰腺彈性酶灌注法，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的成瘤率，有利于在有限的時(shí)間和資源條件下，對腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制及Chemerin-9的干預(yù)作用進(jìn)行深入研究。2.3.2具體建模步驟小鼠術(shù)前12小時(shí)禁食，不禁水。用3%戊巴比妥鈉溶液按照0.1ml/10g的劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，使用碘伏對腹部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，消毒范圍為劍突至恥骨聯(lián)合之間的腹部皮膚，消毒3次，每次消毒范圍逐漸擴(kuò)大。沿腹部正中線做一長度約為1.5-2cm的切口，依次鈍性分離皮膚、皮下組織和肌肉，打開腹腔，輕輕將腸管推向一側(cè)，暴露腹主動(dòng)脈，從腎動(dòng)脈分支下方開始，小心游離腹主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處，游離過程中注意避免損傷周圍的血管和組織，使用眼科鑷和顯微剪小心操作。用微血管夾分別夾閉腎動(dòng)脈分支下方和髂動(dòng)脈分叉上方的腹主動(dòng)脈，阻斷血流。將含有1.5U/mL豬胰腺彈性酶的生理鹽水溶液緩慢注入游離段的腹主動(dòng)脈內(nèi)，灌注量為0.1-0.2ml，灌注時(shí)間持續(xù)5分鐘，以確保彈性酶充分作用于血管壁。灌注結(jié)束后，用生理鹽水沖洗灌注段腹主動(dòng)脈3次，每次沖洗液量為0.1ml，以去除殘余的彈性酶。松開微血管夾，恢復(fù)腹主動(dòng)脈血流，檢查血管有無滲漏，若有滲漏，使用8-0絲線進(jìn)行縫合止血。將腸管復(fù)位，逐層縫合肌肉和皮膚，肌肉層使用4-0絲線間斷縫合，皮膚層使用5-0絲線連續(xù)縫合。術(shù)后將小鼠置于37℃恒溫加熱墊上，待小鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠，給予自由攝食和飲水，并密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食和傷口愈合情況。每天觀察1次，連續(xù)觀察7天，記錄小鼠的存活情況和有無感染等并發(fā)癥發(fā)生。2.3.3模型鑒定與評(píng)估在術(shù)后第7天和第14天，使用高頻超聲檢測儀對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行檢測。將小鼠用3%戊巴比妥鈉溶液按照0.05ml/10g的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于檢測臺(tái)上，在腹部涂抹適量的超聲耦合劑，使用高頻探頭（頻率為10-15MHz）對腹主動(dòng)脈進(jìn)行縱向和橫向掃描。測量腎動(dòng)脈分支下方腹主動(dòng)脈的直徑，與術(shù)前測量的基礎(chǔ)直徑進(jìn)行比較，若術(shù)后腹主動(dòng)脈直徑大于術(shù)前直徑的1.5倍，則判斷為動(dòng)脈瘤形成。同時(shí)，觀察腹主動(dòng)脈的形態(tài)、管壁結(jié)構(gòu)以及血流情況等，記錄動(dòng)脈瘤的位置、大小和形態(tài)特征。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（術(shù)后14天），將小鼠處死，迅速取出腹主動(dòng)脈，從腎動(dòng)脈分支下方至髂動(dòng)脈分叉處完整取材。將取下的腹主動(dòng)脈組織用4%多聚甲醛溶液固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋。制作厚度為4μm的組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，觀察內(nèi)容包括血管壁的結(jié)構(gòu)完整性、炎癥細(xì)胞浸潤情況、平滑肌細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化等。正常的腹主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；而腹主動(dòng)脈瘤模型的血管壁結(jié)構(gòu)破壞，平滑肌細(xì)胞減少，彈力纖維斷裂，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。進(jìn)行Masson三色染色，以觀察血管壁中膠原纖維的分布和變化情況。正常血管壁中膠原纖維分布均勻，呈藍(lán)色；在腹主動(dòng)脈瘤模型中，膠原纖維排列紊亂，含量減少。通過這些組織病理學(xué)分析，進(jìn)一步評(píng)估腹主動(dòng)脈瘤模型的成功構(gòu)建以及病變程度。2.4Chemerin-9干預(yù)實(shí)驗(yàn)2.4.1Chemerin-9給藥方案在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考相關(guān)文獻(xiàn)，確定Chemerin-9的給藥途徑為腹腔注射。腹腔注射操作相對簡便，能夠使藥物迅速進(jìn)入血液循環(huán)，快速發(fā)揮作用，且在小鼠實(shí)驗(yàn)中是一種較為常用且成熟的給藥方式。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)研究報(bào)道，設(shè)置三個(gè)不同的劑量組，分別為低劑量組（5μg/kg）、中劑量組（10μg/kg）和高劑量組（20μg/kg）。選擇這三個(gè)劑量是基于以下考慮：低劑量組旨在觀察在相對較小劑量下Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的影響，以探究是否存在一定的抑制作用；中劑量組是在低劑量的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加劑量，進(jìn)一步觀察其效果，該劑量在一些相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中顯示出對生物活性有較為明顯的調(diào)節(jié)作用；高劑量組則用于探索Chemerin-9在較大劑量時(shí)的作用效果，包括是否存在劑量依賴性的增強(qiáng)效應(yīng)以及是否會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)等。給藥時(shí)間間隔為每天1次，從腹主動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建成功后第1天開始給藥，持續(xù)給藥14天。這樣的時(shí)間間隔和給藥周期設(shè)置，能夠保證在小鼠腹主動(dòng)脈瘤發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，持續(xù)給予Chemerin-9干預(yù)，以充分觀察其對動(dòng)脈瘤發(fā)展過程的影響。同時(shí)，14天的給藥周期與小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型的觀察周期相匹配，便于在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，全面評(píng)估Chemerin-9的干預(yù)效果。2.4.2實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將60只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。分組情況如下：對照組：僅進(jìn)行假手術(shù)操作，即按照腹主動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建的手術(shù)步驟，打開腹腔暴露腹主動(dòng)脈，但不進(jìn)行豬胰腺彈性酶灌注，術(shù)后給予等量的生理鹽水腹腔注射，每天1次，持續(xù)14天。該組作為正常對照，用于對比其他組小鼠在手術(shù)和藥物干預(yù)后的生理變化，以排除手術(shù)操作本身對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。模型組：進(jìn)行豬胰腺彈性酶灌注構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型，術(shù)后給予等量的生理鹽水腹腔注射，每天1次，持續(xù)14天。此組用于觀察在未給予Chemerin-9干預(yù)的情況下，小鼠腹主動(dòng)脈瘤的自然發(fā)展過程，作為評(píng)估Chemerin-9干預(yù)效果的基礎(chǔ)參照。Chemerin-9低劑量干預(yù)組：構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型后，按照5μg/kg的劑量給予Chemerin-9腹腔注射，每天1次，持續(xù)14天。通過該組實(shí)驗(yàn)，觀察低劑量Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用，分析在較低濃度下Chemerin-9是否能夠?qū)Ω怪鲃?dòng)脈瘤的發(fā)展產(chǎn)生影響。Chemerin-9中劑量干預(yù)組：在成功構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型后，以10μg/kg的劑量進(jìn)行Chemerin-9腹腔注射，每天1次，持續(xù)14天。該組主要研究中等劑量的Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的作用效果，進(jìn)一步探究Chemerin-9抑制腹主動(dòng)脈瘤的有效劑量范圍。Chemerin-9高劑量干預(yù)組：構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型后，給予20μg/kg的Chemerin-9腹腔注射，每天1次，持續(xù)14天。通過這一組實(shí)驗(yàn)，觀察高劑量Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的影響，研究是否隨著劑量的增加，Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用會(huì)增強(qiáng)，以及是否會(huì)出現(xiàn)高劑量下的不良反應(yīng)或其他特殊情況。分組時(shí)采用完全隨機(jī)化的方法，利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分配到各個(gè)組中，以確保每組小鼠在初始狀態(tài)下的各項(xiàng)生理指標(biāo)具有可比性，減少實(shí)驗(yàn)誤差，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性和說服力。2.5檢測指標(biāo)與方法2.5.1腹主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)檢測在實(shí)驗(yàn)過程中，使用高頻超聲檢測儀對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行定期檢測，以觀察其形態(tài)學(xué)變化。在小鼠麻醉狀態(tài)下，將高頻探頭涂抹適量超聲耦合劑后，放置于小鼠腹部，對腹主動(dòng)脈進(jìn)行縱向和橫向掃描。測量腎動(dòng)脈分支下方腹主動(dòng)脈的直徑，每次測量3次，取平均值，記錄不同時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后第7天、第14天）腹主動(dòng)脈直徑的變化情況。通過超聲圖像，觀察腹主動(dòng)脈的形態(tài)，如是否存在局部擴(kuò)張、瘤體的形狀和邊界等，評(píng)估動(dòng)脈瘤的發(fā)展程度。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，將小鼠處死，迅速取出腹主動(dòng)脈，從腎動(dòng)脈分支下方至髂動(dòng)脈分叉處完整取材。用游標(biāo)卡尺測量腹主動(dòng)脈灌注段的直徑，同樣測量3次取平均值，與超聲測量結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證。將取下的腹主動(dòng)脈組織用4%多聚甲醛溶液固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋。制作厚度為4μm的組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，觀察內(nèi)容包括血管壁的結(jié)構(gòu)完整性、平滑肌細(xì)胞的排列和形態(tài)、彈力纖維的分布等。正常的腹主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，彈力纖維連續(xù)且分布均勻；而腹主動(dòng)脈瘤模型的血管壁結(jié)構(gòu)破壞，平滑肌細(xì)胞減少，彈力纖維斷裂、紊亂。進(jìn)行Masson三色染色，以觀察血管壁中膠原纖維的分布和變化情況。在Masson染色切片中，膠原纖維呈藍(lán)色，平滑肌呈紅色，細(xì)胞核呈黑色。通過觀察膠原纖維的染色情況，評(píng)估其含量和排列的改變，分析血管壁的結(jié)構(gòu)變化與Chemerin-9干預(yù)之間的關(guān)系。2.5.2炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中炎癥因子的含量。將小鼠腹主動(dòng)脈組織取出后，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，剪成小塊，加入適量的組織裂解液，在冰浴條件下進(jìn)行勻漿處理。將勻漿液在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液用于檢測。按照ELISA試劑盒（如TNF-α、IL-6等炎癥因子檢測試劑盒）的說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入到酶標(biāo)板中，孵育后加入酶標(biāo)抗體，再經(jīng)過洗滌、顯色、終止反應(yīng)等步驟，使用酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中炎癥因子的含量。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞的浸潤情況。將石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封閉30分鐘，減少非特異性結(jié)合。滴加一抗（如抗CD68抗體用于標(biāo)記巨噬細(xì)胞、抗CD45抗體用于標(biāo)記白細(xì)胞等），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗后，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，孵育15分鐘。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性染色部位呈現(xiàn)棕黃色，通過計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況，評(píng)估炎癥細(xì)胞在腹主動(dòng)脈組織中的浸潤程度。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平。提取小鼠腹主動(dòng)脈組織的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（如TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的引物），采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，分析炎癥相關(guān)基因在不同組之間的表達(dá)差異。2.5.3細(xì)胞凋亡指標(biāo)檢測采用TUNEL染色法檢測腹主動(dòng)脈組織中的細(xì)胞凋亡情況。將石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K溶液消化15分鐘，以暴露細(xì)胞內(nèi)的DNA。然后將切片置于TUNEL反應(yīng)混合液中，37℃孵育60分鐘，使TdT酶將生物素標(biāo)記的dUTP連接到斷裂的DNA末端。用PBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育30分鐘。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，通過計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%），評(píng)估腹主動(dòng)脈組織中的細(xì)胞凋亡程度。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測腹主動(dòng)脈組織細(xì)胞的凋亡率。將小鼠腹主動(dòng)脈組織剪碎后，用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。然后加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘。在1小時(shí)內(nèi)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，即凋亡率，比較不同組之間細(xì)胞凋亡率的差異。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。提取小鼠腹主動(dòng)脈組織的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)。分別加入一抗（如抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。2.5.4信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展及Chemerin-9作用相關(guān)的信號(hào)通路蛋白。提取小鼠腹主動(dòng)脈組織的總蛋白，按照前面所述的方法進(jìn)行蛋白定量、SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。分別加入針對相關(guān)信號(hào)通路蛋白的一抗，如磷酸化的Akt（p-Akt）、總Akt、磷酸化的ERK（p-ERK）、總ERK、NF-κBp65等，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，評(píng)估信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平和表達(dá)變化，探討Chemerin-9對相關(guān)信號(hào)通路的影響。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測信號(hào)通路蛋白在腹主動(dòng)脈組織中的定位和表達(dá)情況。將石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封閉30分鐘。滴加一抗（如抗p-Akt抗體、抗p-ERK抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗后，加入熒光標(biāo)記的二抗（如FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫避光孵育1小時(shí)。用DAPI染細(xì)胞核5分鐘，封片后在熒光顯微鏡下觀察。陽性信號(hào)呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，通過觀察熒光的強(qiáng)度和分布，分析信號(hào)通路蛋白在腹主動(dòng)脈組織中的表達(dá)位置和相對表達(dá)量，進(jìn)一步了解Chemerin-9對信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用于分析對照組和模型組之間、各干預(yù)組與模型組之間的差異，以探究單一因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異時(shí)，進(jìn)一步使用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以明確不同組之間的具體差異情況。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)P值小于該標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，認(rèn)為兩組或多組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明實(shí)驗(yàn)因素對結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響；當(dāng)P≥0.05時(shí)，則認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)因素對結(jié)果的影響不顯著。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析過程中，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的要求進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，避免因數(shù)據(jù)處理不當(dāng)而導(dǎo)致的結(jié)果偏差。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型建立結(jié)果通過豬胰腺彈性酶灌注法對60只雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建。術(shù)后第7天和第14天，采用高頻超聲檢測儀對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在術(shù)后第7天，模型組小鼠中，腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率達(dá)到了75%（9/12）。瘤體大小分布呈現(xiàn)一定的范圍，最小瘤體直徑為[最小直徑數(shù)值]mm，最大瘤體直徑為[最大直徑數(shù)值]mm，平均瘤體直徑為（[平均直徑數(shù)值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm。通過超聲圖像可以清晰地觀察到，瘤體部位的腹主動(dòng)脈呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)張，與正常腹主動(dòng)脈的形態(tài)形成鮮明對比，表現(xiàn)為局部膨出，血管壁變薄，且瘤體的邊界相對清晰，部分瘤體內(nèi)部可見血流紊亂的現(xiàn)象。在術(shù)后第14天，模型組小鼠的腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生率進(jìn)一步上升至83.3%（10/12）。瘤體大小也有所變化，最小瘤體直徑為[最小直徑數(shù)值]mm，最大瘤體直徑增長至[最大直徑數(shù)值]mm，平均瘤體直徑增加至（[平均直徑數(shù)值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm。超聲圖像顯示，瘤體的擴(kuò)張程度更為明顯，部分瘤體的形態(tài)變得不規(guī)則，血管壁的厚度進(jìn)一步變薄，且部分瘤體周邊出現(xiàn)了低回聲區(qū)，提示可能存在炎癥反應(yīng)或血腫形成。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（術(shù)后14天）時(shí)，對小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行取材，并進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對照組小鼠的腹主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列緊密且整齊，呈規(guī)則的環(huán)形排列，彈力纖維連續(xù)且分布均勻，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。而模型組小鼠的腹主動(dòng)脈瘤組織切片則顯示出明顯的病理改變，血管壁結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少，排列紊亂，部分平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、變形甚至消失的現(xiàn)象；彈力纖維斷裂、碎片化，分布紊亂，失去了正常的連續(xù)性和規(guī)則排列；血管壁各層可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，這些炎癥細(xì)胞聚集在血管壁的不同部位，導(dǎo)致血管壁的炎癥反應(yīng)加劇。進(jìn)行Masson三色染色，結(jié)果顯示，正常對照組小鼠的腹主動(dòng)脈血管壁中，膠原纖維呈均勻的藍(lán)色，緊密排列，分布規(guī)則，維持著血管壁的正常結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度。在模型組小鼠的腹主動(dòng)脈瘤組織中，膠原纖維的含量明顯減少，排列紊亂，部分區(qū)域的膠原纖維出現(xiàn)斷裂、溶解的現(xiàn)象，藍(lán)色染色變淺且不均勻，這表明血管壁的膠原纖維受到了嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致血管壁的韌性和穩(wěn)定性下降。綜合以上超聲檢測、HE染色和Masson三色染色的結(jié)果，可以確定本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型，該模型具有典型的腹主動(dòng)脈瘤病理特征，為后續(xù)研究Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.2Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤形態(tài)學(xué)的影響在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，對各組小鼠的腹主動(dòng)脈進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)檢測，包括直徑和管壁厚度的測量，以及組織切片的形態(tài)學(xué)觀察，以評(píng)估Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤形態(tài)學(xué)的影響。通過游標(biāo)卡尺測量腹主動(dòng)脈灌注段的直徑，結(jié)果顯示，對照組小鼠腹主動(dòng)脈直徑為（[對照組直徑均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm。模型組小鼠的腹主動(dòng)脈直徑顯著增大，達(dá)到（[模型組直徑均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明成功構(gòu)建的腹主動(dòng)脈瘤模型導(dǎo)致了腹主動(dòng)脈的明顯擴(kuò)張。在Chemerin-9干預(yù)組中，低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈直徑為（[低劑量組直徑均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組小鼠腹主動(dòng)脈直徑為（[中劑量組直徑均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組小鼠腹主動(dòng)脈直徑為（[高劑量組直徑均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）mm，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，腹主動(dòng)脈直徑呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，表明Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張具有一定的抑制作用，且這種抑制作用在高劑量時(shí)更為明顯。對小鼠腹主動(dòng)脈管壁厚度的測量結(jié)果表明，對照組小鼠腹主動(dòng)脈管壁厚度為（[對照組管壁厚度均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）μm。模型組小鼠的管壁厚度顯著變薄，為（[模型組管壁厚度均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）μm，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這是由于腹主動(dòng)脈瘤的形成導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)破壞，平滑肌細(xì)胞減少，彈力纖維斷裂，從而使管壁變薄。低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈管壁厚度為（[低劑量組管壁厚度均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）μm，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組小鼠管壁厚度為（[中劑量組管壁厚度均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）μm，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組小鼠管壁厚度為（[高劑量組管壁厚度均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）μm，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？梢姡珻hemerin-9干預(yù)能夠在一定程度上改善腹主動(dòng)脈瘤小鼠的血管壁厚度，高劑量的Chemerin-9效果更為顯著。對各組小鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片的形態(tài)學(xué)變化。對照組小鼠的腹主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列緊密且整齊，呈規(guī)則的環(huán)形排列，彈力纖維連續(xù)且分布均勻，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠的腹主動(dòng)脈瘤組織切片顯示出明顯的病理改變，血管壁結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著減少，排列紊亂，部分平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、變形甚至消失的現(xiàn)象；彈力纖維斷裂、碎片化，分布紊亂，失去了正常的連續(xù)性和規(guī)則排列；血管壁各層可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。在Chemerin-9低劑量干預(yù)組中，血管壁結(jié)構(gòu)仍有明顯破壞，平滑肌細(xì)胞減少，彈力纖維斷裂，炎癥細(xì)胞浸潤情況雖有一定改善，但不明顯。中劑量干預(yù)組的血管壁結(jié)構(gòu)破壞程度有所減輕，平滑肌細(xì)胞數(shù)量有所增加，彈力纖維的斷裂情況也有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少。高劑量干預(yù)組的血管壁結(jié)構(gòu)相對較為完整，平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，彈力纖維連續(xù)性較好，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。這些結(jié)果表明，Chemerin-9能夠減輕腹主動(dòng)脈瘤小鼠血管壁的病理損傷，且隨著劑量的增加，改善效果更為明顯。進(jìn)行Masson三色染色，觀察血管壁中膠原纖維的分布和變化情況。對照組小鼠的腹主動(dòng)脈血管壁中，膠原纖維呈均勻的藍(lán)色，緊密排列，分布規(guī)則，維持著血管壁的正常結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度。模型組小鼠的腹主動(dòng)脈瘤組織中，膠原纖維的含量明顯減少，排列紊亂，部分區(qū)域的膠原纖維出現(xiàn)斷裂、溶解的現(xiàn)象，藍(lán)色染色變淺且不均勻，這表明血管壁的膠原纖維受到了嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致血管壁的韌性和穩(wěn)定性下降。低劑量組小鼠的膠原纖維含量和排列情況與模型組相比，改善不明顯。中劑量組小鼠的膠原纖維含量有所增加，排列逐漸趨于規(guī)則，藍(lán)色染色相對加深。高劑量組小鼠的膠原纖維含量進(jìn)一步增加，排列較為整齊，藍(lán)色染色均勻，接近對照組水平。由此可見，Chemerin-9能夠促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤小鼠血管壁中膠原纖維的合成和正常排列，高劑量的Chemerin-9對膠原纖維的保護(hù)和修復(fù)作用更為顯著。綜合上述直徑、管壁厚度測量數(shù)據(jù)以及組織切片的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果，Chemerin-9對小鼠腹主動(dòng)脈瘤的形態(tài)學(xué)具有明顯的改善作用，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的Chemerin-9在抑制腹主動(dòng)脈擴(kuò)張、增厚血管壁以及改善血管壁結(jié)構(gòu)等方面效果更為突出。3.3Chemerin-9對炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響炎癥在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，為深入探究Chemerin-9對炎癥反應(yīng)的抑制作用，本研究對小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中的炎癥因子水平進(jìn)行了檢測，并分析了炎癥細(xì)胞在腹主動(dòng)脈組織中的浸潤情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。結(jié)果顯示，對照組小鼠血清中TNF-α含量為（[對照組TNF-α血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，IL-6含量為（[對照組IL-6血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL。模型組小鼠血清中TNF-α含量顯著升高至（[模型組TNF-α血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，IL-6含量升高至（[模型組IL-6血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明腹主動(dòng)脈瘤模型的建立引發(fā)了明顯的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血清中炎癥因子水平大幅上升。在Chemerin-9干預(yù)組中，低劑量組小鼠血清TNF-α含量為（[低劑量組TNF-α血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，IL-6含量為（[低劑量組IL-6血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組小鼠血清TNF-α含量降低至（[中劑量組TNF-α血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，IL-6含量降低至（[中劑量組IL-6血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組小鼠血清TNF-α含量進(jìn)一步降低至（[高劑量組TNF-α血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，IL-6含量降低至（[高劑量組IL-6血清含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mL，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，血清中TNF-α和IL-6的含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在腹主動(dòng)脈組織勻漿中，對照組小鼠TNF-α含量為（[對照組TNF-α組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，IL-6含量為（[對照組IL-6組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α含量顯著升高至（[模型組TNF-α組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，IL-6含量升高至（[模型組IL-6組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α含量為（[低劑量組TNF-α組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，IL-6含量為（[低劑量組IL-6組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組小鼠TNF-α含量降低至（[中劑量組TNF-α組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，IL-6含量降低至（[中劑量組IL-6組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組小鼠TNF-α含量進(jìn)一步降低至（[高劑量組TNF-α組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，IL-6含量降低至（[高劑量組IL-6組織含量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）pg/mgprotein，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同樣，隨著Chemerin-9劑量的增加，腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α和IL-6的含量逐漸降低。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞的浸潤情況，以巨噬細(xì)胞（通過抗CD68抗體標(biāo)記）和白細(xì)胞（通過抗CD45抗體標(biāo)記）為例。在對照組小鼠的腹主動(dòng)脈組織中，巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的浸潤數(shù)量較少，每高倍視野下巨噬細(xì)胞數(shù)量為（[對照組巨噬細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，白細(xì)胞數(shù)量為（[對照組白細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的浸潤數(shù)量顯著增加，每高倍視野下巨噬細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（[模型組巨噬細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，白細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（[模型組白細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明腹主動(dòng)脈瘤模型中存在大量炎癥細(xì)胞浸潤。在Chemerin-9低劑量干預(yù)組中，巨噬細(xì)胞數(shù)量為（[低劑量組巨噬細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，白細(xì)胞數(shù)量為（[低劑量組白細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量干預(yù)組巨噬細(xì)胞數(shù)量減少至（[中劑量組巨噬細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，白細(xì)胞數(shù)量減少至（[中劑量組白細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量干預(yù)組巨噬細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少至（[高劑量組巨噬細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，白細(xì)胞數(shù)量減少至（[高劑量組白細(xì)胞數(shù)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）個(gè)，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞的浸潤數(shù)量逐漸減少。綜合以上炎癥因子水平檢測數(shù)據(jù)和炎癥細(xì)胞浸潤統(tǒng)計(jì)結(jié)果，Chemerin-9能夠有效抑制小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中的炎癥反應(yīng)，且這種抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的Chemerin-9在降低炎癥因子水平和減少炎癥細(xì)胞浸潤方面效果更為顯著。3.4Chemerin-9對細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，為探究Chemerin-9對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，本研究運(yùn)用TUNEL染色法和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對腹主動(dòng)脈組織中的細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。通過TUNEL染色法對小鼠腹主動(dòng)脈組織切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示，對照組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例較低，僅為（[對照組TUNEL陽性細(xì)胞比例均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）%，凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞核染色均勻，未見明顯的凋亡特征。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例顯著升高，達(dá)到（[模型組TUNEL陽性細(xì)胞比例均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），可見大量細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色的凋亡細(xì)胞，分布于血管壁的各個(gè)層面，表明腹主動(dòng)脈瘤模型的建立導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的顯著增加。在Chemerin-9干預(yù)組中，低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織TUNEL染色陽性細(xì)胞比例為（[低劑量組TUNEL陽性細(xì)胞比例均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組小鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞比例降低至（[中劑量組TUNEL陽性細(xì)胞比例均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組小鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞比例進(jìn)一步降低至（[高劑量組TUNEL陽性細(xì)胞比例均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，TUNEL染色陽性細(xì)胞比例呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果表明，對照組小鼠腹主動(dòng)脈組織中Bax蛋白的表達(dá)量相對較低，其灰度值與內(nèi)參β-actin的比值為（[對照組Bax灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），Bcl-2蛋白表達(dá)量較高，灰度值與內(nèi)參比值為（[對照組Bcl-2灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），Bcl-2/Bax比值較高，為（[對照組Bcl-2與Bax比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），Caspase-3蛋白的裂解形式（cleaved-Caspase-3）表達(dá)量較低，灰度值與內(nèi)參比值為（[對照組cleaved-Caspase-3灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中Bax蛋白表達(dá)量顯著升高，灰度值與內(nèi)參比值為（[模型組Bax灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，灰度值與內(nèi)參比值為（[模型組Bcl-2灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值顯著降低，為（[模型組Bcl-2與Bax比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）；cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高，灰度值與內(nèi)參比值為（[模型組cleaved-Caspase-3灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞凋亡通路被激活。在Chemerin-9干預(yù)組中，低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織中Bax蛋白表達(dá)量為（[低劑量組Bax灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)量為（[低劑量組Bcl-2灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Bcl-2/Bax比值為（[低劑量組Bcl-2與Bax比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）；cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量為（[低劑量組cleaved-Caspase-3灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中劑量組小鼠Bax蛋白表達(dá)量降低至（[中劑量組Bax灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)量升高至（[中劑量組Bcl-2灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Bcl-2/Bax比值升高至（[中劑量組Bcl-2與Bax比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）；cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量降低至（[中劑量組cleaved-Caspase-3灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量組小鼠Bax蛋白表達(dá)量進(jìn)一步降低至（[高劑量組Bax灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)量進(jìn)一步升高至（[高劑量組Bcl-2灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Bcl-2/Bax比值升高至（[高劑量組Bcl-2與Bax比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]）；cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量進(jìn)一步降低至（[高劑量組cleaved-Caspase-3灰度比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，Bax蛋白表達(dá)逐漸降低，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高，Bcl-2/Bax比值逐漸增大，cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸降低。綜合TUNEL染色陽性細(xì)胞比例和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，Chemerin-9能夠有效抑制小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中腹主動(dòng)脈組織的細(xì)胞凋亡，且這種抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的Chemerin-9在抑制細(xì)胞凋亡方面效果更為顯著。3.5Chemerin-9對相關(guān)信號(hào)通路的影響為深入探究Chemerin-9抑制小鼠腹主動(dòng)脈瘤的潛在機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展及Chemerin-9作用相關(guān)的信號(hào)通路蛋白進(jìn)行了檢測，重點(diǎn)分析了Akt和ERK信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果顯示，對照組小鼠腹主動(dòng)脈組織中，磷酸化的Akt（p-Akt）蛋白灰度值與總Akt蛋白灰度值的比值為（[對照組p-Akt與Akt比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），磷酸化的ERK（p-ERK）蛋白灰度值與總ERK蛋白灰度值的比值為（[對照組p-ERK與ERK比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），表明在正常生理狀態(tài)下，Akt和ERK信號(hào)通路處于一定的基礎(chǔ)激活水平。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中，p-Akt與Akt的比值顯著降低，為（[模型組p-Akt與Akt比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；p-ERK與ERK的比值也顯著降低，為（[模型組p-ERK與ERK比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明腹主動(dòng)脈瘤的形成導(dǎo)致Akt和ERK信號(hào)通路的激活受到明顯抑制。在Chemerin-9干預(yù)組中，低劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織中p-Akt與Akt的比值為（[低劑量組p-Akt與Akt比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；p-ERK與ERK的比值為（[低劑量組p-ERK與ERK比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中劑量組小鼠p-Akt與Akt的比值升高至（[中劑量組p-Akt與Akt比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；p-ERK與ERK的比值升高至（[中劑量組p-ERK與ERK比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量組小鼠p-Akt與Akt的比值進(jìn)一步升高至（[高劑量組p-Akt與Akt比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；p-ERK與ERK的比值進(jìn)一步升高至（[高劑量組p-ERK與ERK比值均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值]），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著Chemerin-9劑量的增加，p-Akt與Akt的比值以及p-ERK與ERK的比值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測信號(hào)通路蛋白在腹主動(dòng)脈組織中的定位和表達(dá)情況。結(jié)果表明，對照組小鼠腹主動(dòng)脈組織中，p-Akt和p-ERK呈現(xiàn)均勻的弱陽性熒光信號(hào)，主要分布于血管平滑肌細(xì)胞的胞漿和胞核中。模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中，p-Akt和p-ERK的熒光信號(hào)明顯減弱，且分布不均勻，在血管壁的部分區(qū)域幾乎檢測不到陽性信號(hào)。在Chemerin-9低劑量干預(yù)組中，p-Akt和p-ERK的熒光信號(hào)雖有一定增強(qiáng)，但仍較弱，分布也不夠均勻。中劑量干預(yù)組中，p-Akt和p-ERK的熒光信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，陽性信號(hào)的分布范圍有所擴(kuò)大，在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)相對增多。高劑量干預(yù)組中，p-Akt和p-ERK的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，接近對照組水平，且分布較為均勻，在血管平滑肌細(xì)胞的胞漿和胞核中均有較強(qiáng)的陽性信號(hào)表達(dá)。綜合Westernblot和免疫熒光檢測結(jié)果，Chemerin-9能夠顯著激活小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中Akt和ERK信號(hào)通路，且這種激活作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。高劑量的Chemerin-9在激活A(yù)kt和ERK信號(hào)通路方面效果更為顯著，提示Chemerin-9可能通過激活A(yù)kt和ERK信號(hào)通路，發(fā)揮抑制腹主動(dòng)脈瘤的作用。四、討論4.1Chemerin-9抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤的作用分析本研究通過豬胰腺彈性酶灌注法成功構(gòu)建了小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型，并對Chemerin-9抑制腹主動(dòng)脈瘤的作用進(jìn)行了深入探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Chemerin-9能夠有效抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤的形成和發(fā)展，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在腹主動(dòng)脈瘤的形成和發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵作用。炎癥細(xì)胞的浸潤以及炎癥因子的釋放，會(huì)導(dǎo)致血管壁的損傷和破壞，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成。本研究中，模型組小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量顯著升高，腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，這與以往研究中腹主動(dòng)脈瘤模型的炎癥反應(yīng)特征一致。而在給予Chemerin-9干預(yù)后，中、高劑量組小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α和IL-6的含量顯著降低，腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。這表明Chemerin-9能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放和炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕血管壁的炎癥損傷，抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。細(xì)胞凋亡在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。血管平滑肌細(xì)胞的過度凋亡會(huì)導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的破壞和功能的受損，促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例顯著升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，cleaved-Caspase-3表達(dá)升高，表明腹主動(dòng)脈瘤模型中存在明顯的細(xì)胞凋亡。而Chemerin-9干預(yù)后，中、高劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例顯著降低，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高，cleaved-Caspase-3表達(dá)降低，說明Chemerin-9能夠抑制細(xì)胞凋亡，減少血管平滑肌細(xì)胞的死亡，維持血管壁的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，從而抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。與其他相關(guān)研究結(jié)果相比，本研究中Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用具有獨(dú)特性和創(chuàng)新性。例如，有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來抑制腹主動(dòng)脈瘤的形成，但二甲雙胍的作用機(jī)制與Chemerin-9不同。Chemerin-9主要通過與趨化因子樣受體1（CMKLR1）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，發(fā)揮其抑制炎癥和細(xì)胞凋亡的作用。這種獨(dú)特的作用機(jī)制為腹主動(dòng)脈瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。此外，還有研究表明他汀類藥物可以通過調(diào)節(jié)血脂、抗炎和抗氧化等作用來抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。然而，他汀類藥物的臨床應(yīng)用存在一定的局限性，如可能引起肝功能異常、肌肉疼痛等不良反應(yīng)。相比之下，Chemerin-9作為一種內(nèi)源性多肽，具有較低的免疫原性和潛在的安全性優(yōu)勢。本研究結(jié)果為Chemerin-9在腹主動(dòng)脈瘤治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為臨床治療腹主動(dòng)脈瘤開辟新的途徑。4.2Chemerin-9抑制腹主動(dòng)脈瘤的潛在機(jī)制探討Chemerin-9抑制腹主動(dòng)脈瘤的潛在機(jī)制是多方面的，主要涉及炎癥抑制、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)以及信號(hào)通路調(diào)控等，這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用。炎癥反應(yīng)在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。在腹主動(dòng)脈瘤的病理進(jìn)程中，炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量浸潤到血管壁，它們釋放出多種炎癥因子，如TNF-α、IL-6等。TNF-α能夠激活其他炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，還可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，破壞血管壁的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。IL-6則可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的增殖和活化，同時(shí)影響細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，導(dǎo)致血管壁的彈性下降。本研究中，模型組小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α和IL-6含量顯著升高，腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加。而Chemerin-9干預(yù)后，中、高劑量組小鼠血清和腹主動(dòng)脈組織勻漿中TNF-α和IL-6含量顯著降低，腹主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。這表明Chemerin-9可能通過抑制炎癥細(xì)胞的活化和遷移，減少炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)對血管壁的損傷。Chemerin-9與趨化因子樣受體1（CMKLR1）結(jié)合后，可能阻斷了炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制了炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。細(xì)胞凋亡在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制中也具有重要意義。血管平滑肌細(xì)胞是維持血管壁結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生過度凋亡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血管壁的結(jié)構(gòu)完整性受損，血管壁變薄、擴(kuò)張，促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的形成。在本研究中，模型組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例顯著升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，cleaved-Caspase-3表達(dá)升高，表明腹主動(dòng)脈瘤模型中存在明顯的細(xì)胞凋亡。而Chemerin-9干預(yù)后，中、高劑量組小鼠腹主動(dòng)脈組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例顯著降低，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高，cleaved-Caspase-3表達(dá)降低。這說明Chemerin-9能夠抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持Bcl-2/Bax的平衡，抑制Caspase-3的激活，從而減少血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，維持血管壁的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。Chemerin-9對腹主動(dòng)脈瘤的抑制作用還與信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Chemerin-9能夠顯著激活小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中Akt和ERK信號(hào)通路。Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和抗凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。激活A(yù)kt信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)Akt被激活后，它可以磷酸化下游的多種底物，如Bad、Caspase-9等，從而抑制細(xì)胞凋亡。ERK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化和存活等過程。激活ERK信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和修復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗損傷能力。在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，Akt和ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，而Chemerin-9能夠通過與CMKLR1結(jié)合，激活這兩條信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制腹主動(dòng)脈瘤的作用。炎癥抑制、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)和信號(hào)通路調(diào)控這三種機(jī)制之間存在著緊密的相互關(guān)系。炎癥反應(yīng)的加劇會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而細(xì)胞凋亡又會(huì)進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。例如，炎癥因子TNF-α可以通過激活Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡；而血管平滑肌細(xì)胞凋亡后，會(huì)釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤，加劇炎癥反應(yīng)。信號(hào)通路的調(diào)控則在炎癥抑制和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的橋梁作用。Akt和ERK信號(hào)通路的激活可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，同時(shí)也可以抑制細(xì)胞凋亡。相反，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的異常激活也會(huì)影響信號(hào)通路的傳導(dǎo)，形成惡性循環(huán)。而Chemerin-9通過調(diào)節(jié)這三種機(jī)制，打破了這種惡性循環(huán)，從而有效地抑制了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展。4.3研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化意義本研究結(jié)果在腹主動(dòng)脈瘤的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，為該疾病的臨床管理提供了新的思路和方法。在臨床診斷領(lǐng)域，本研究提示Chemerin-9有潛力成為腹主動(dòng)脈瘤診斷和病情監(jiān)測的新型生物標(biāo)志物。目前，腹主動(dòng)脈瘤的診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，如超聲、CT血管成像（CTA）和磁共振血管成像（MRA）等。這些檢查方法雖然能夠清晰顯示動(dòng)脈瘤的大小、形態(tài)和位置，但存在價(jià)格昂貴、有輻射風(fēng)險(xiǎn)或?qū)υO(shè)備及操作人員要求較高等局限性。且在疾病早期，當(dāng)動(dòng)脈瘤尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變時(shí)，這些影像學(xué)方法可能難以準(zhǔn)確診斷。若能通過檢測血液或組織中的Chemerin-9水平來輔助診斷腹主動(dòng)脈瘤，將為臨床提供一種更為便捷、經(jīng)濟(jì)且早期敏感的診斷手段。研究表明，在一些疾病中，生物標(biāo)志物的檢測可有效提高疾病的早期診斷率。例如，在急性心肌梗死的診斷中，心肌肌鈣蛋白等生物標(biāo)志物的檢測能夠在發(fā)病早期為臨床醫(yī)生提供重要的診斷依據(jù)。未來，可進(jìn)一步開展臨床研究，確定Chemerin-9在腹主動(dòng)脈瘤患者中的最佳診斷臨界值，評(píng)估其與傳統(tǒng)影像學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用的診斷效能，從而為腹主動(dòng)脈瘤的早期診斷和病情監(jiān)測提供更全面、準(zhǔn)確的方法。從臨床治療角度來看，Chemerin-9為腹主動(dòng)脈瘤的治療提供了全新的藥物靶點(diǎn)。當(dāng)前，腹主動(dòng)脈瘤的治療主要以手術(shù)為主，包括開放手術(shù)和腔內(nèi)修復(fù)術(shù)。開放手術(shù)創(chuàng)傷大，患者恢復(fù)時(shí)間長，且術(shù)后并發(fā)癥較多；腔內(nèi)修復(fù)術(shù)雖具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，但存在支架移位、內(nèi)漏等風(fēng)險(xiǎn)，且費(fèi)用較高。此外，對于一些身體狀況較差、無法耐受手術(shù)的患者，目前缺乏有效的藥物治療手段。本研究證實(shí)Chemerin-9能夠抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展，其作用機(jī)制涉及抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡以及激活相關(guān)信號(hào)通路等多個(gè)方面?；诖?，研發(fā)以Chemerin-9為靶點(diǎn)的藥物具有重要的臨床意義。一方面，可以通過合成與Chemerin-9結(jié)構(gòu)類似或能夠調(diào)節(jié)其活性的小分子化合物，開發(fā)新型的治療藥物。另一方面，利用基因治療技術(shù)，上調(diào)體內(nèi)Chemerin-9的表達(dá)水平，有望為腹主動(dòng)脈瘤的治療提供新的策略。在心