E2F1、RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌中的機(jī)制與關(guān)聯(lián)研究一、引言1.1研究背景2型糖尿?。═2DM）作為一種常見的慢性代謝性疾病，近年來在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計到2045年將增至7.83億，而T2DM占糖尿病發(fā)病總數(shù)的90％-95％。T2DM不僅對機(jī)體的糖代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響，還與多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如心血管疾病、神經(jīng)病變、腎病等，極大地降低了患者的生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肝細(xì)胞癌（HCC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位居前列。在全球癌癥相關(guān)死亡原因中，HCC排名第三，每年新發(fā)病例超過90萬例，死亡病例約83萬例。HCC具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、預(yù)后差等特點，大部分患者在確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會。越來越多的研究表明，T2DM與HCC之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。T2DM患者發(fā)生HCC的風(fēng)險較非糖尿病患者顯著增加，多項流行病學(xué)研究顯示，T2DM患者患HCC的風(fēng)險是普通人群的2-4倍。這種并發(fā)情況給患者的健康帶來了雙重打擊，不僅增加了治療的難度，還顯著降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。T2DM合并HCC的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。一般認(rèn)為，胰島素抵抗、糖和脂肪代謝紊亂、慢性炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等因素在其中發(fā)揮了重要作用。胰島素抵抗導(dǎo)致機(jī)體對胰島素的敏感性降低，使得血糖水平升高，同時刺激胰島素分泌增加。高胰島素血癥可通過激活胰島素/胰島素樣生長因子（IGF）1通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利條件。此外，長期的高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的大量產(chǎn)生，AGEs與其受體RAGE結(jié)合后，可激活多條信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞增殖異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。E2F1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究表明，E2F1的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而參與腫瘤的形成。在T2DM合并HCC的發(fā)病過程中，E2F1的表達(dá)水平可能發(fā)生改變，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RAGE及其下游因子在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等方面具有重要作用。RAGE與AGEs結(jié)合后，可激活Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9等下游因子，這些因子參與了細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞遷移和侵襲等過程，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。在T2DM合并HCC患者中，RAGE及其下游因子的表達(dá)和活性可能受到高血糖等因素的影響，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。深入研究E2F1、RAGE及其下游因子在T2DM合并HCC中的作用機(jī)制，對于揭示T2DM合并HCC的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點具有重要意義。通過對這些因子的研究，有望為T2DM合并HCC的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評估提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，從而改善患者的生存狀況，提高其生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究E2F1、RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，明確三者之間的相互關(guān)系，為揭示2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。通過對比分析合并與未合并2型糖尿病的肝細(xì)胞癌患者中這些因子的表達(dá)差異，期望發(fā)現(xiàn)能夠用于早期診斷和病情評估的生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生判斷疾病進(jìn)展、制定個性化治療方案提供有力支持。同時，基于對作用機(jī)制的深入理解，探索以這些因子為靶點的新型治療策略，為2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的治療開辟新的途徑，改善患者的預(yù)后，提高其生存質(zhì)量。2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌嚴(yán)重威脅人類健康，目前對于其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識仍不全面，缺乏有效的早期診斷方法和精準(zhǔn)治療手段。深入研究E2F1、RAGE及其下游因子在其中的作用機(jī)制，不僅有助于填補(bǔ)該領(lǐng)域在發(fā)病機(jī)制研究方面的空白，完善對疾病發(fā)生發(fā)展過程的理論認(rèn)知，還能為臨床實踐提供更為科學(xué)、有效的診斷和治療方法，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值，有望在未來為廣大患者帶來福音，減輕社會的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在2型糖尿?。═2DM）與肝細(xì)胞癌（HCC）關(guān)系的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已達(dá)成廣泛共識，即T2DM是HCC的重要危險因素。國外的多項大規(guī)模研究為這一結(jié)論提供了有力支撐。美國學(xué)者對護(hù)士健康研究（NHS）和醫(yī)療從業(yè)者隨訪研究（HPFS）的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，在長達(dá)32年的隨訪中，涉及4,488,410個患者-年，記錄到112例肝細(xì)胞癌病例，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與HCC風(fēng)險增加顯著相關(guān)，年齡校正HR為4.77，多因素分析HR為4.59，且在無肝硬化人群中該關(guān)系同樣存在。同時，糖尿病病程長也與HCC風(fēng)險增加密切相關(guān)，糖尿病病程為0-2年、2-10年和10年以上的人群發(fā)生HCC的多因素HR依次為2.96、6.08和7.52。ValterDonadon等在意大利開展的病例對照研究證實2型糖尿病為HCC的獨立危險因素，還發(fā)現(xiàn)胰島素和磺脲類藥物治療會增加肝癌發(fā)生風(fēng)險，而二甲雙胍則會降低風(fēng)險。國內(nèi)相關(guān)研究也呈現(xiàn)出相似結(jié)果。有研究對大量肝癌患者進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險明顯高于非糖尿病患者。一項針對中國人群的研究表明，T2DM患者患HCC的風(fēng)險是普通人群的2-4倍。游宇來、鄧明華等學(xué)者指出，2型糖尿病不僅自身會增加HCC發(fā)病風(fēng)險，還可與HBV、HCV、酒精性肝病等產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步提升患者罹患HCC的風(fēng)險。關(guān)于E2F1在T2DM合并HCC中的研究，目前雖有一定進(jìn)展，但仍存在諸多未知。國外研究發(fā)現(xiàn)，E2F1作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮核心作用，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相連。在乳腺癌、肺癌等腫瘤研究中，已證實E2F1可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而推動腫瘤的形成。然而，在T2DM合并HCC領(lǐng)域，E2F1的具體作用機(jī)制尚未完全明確。有研究初步探索了E2F1在T2DM合并HCC患者癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平相較于單純HCC患者癌組織有所升高，推測E2F1可能參與了糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，但具體的分子通路及調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。國內(nèi)學(xué)者針對E2F1也展開了相關(guān)研究。有研究采用WesternBlot法測定合并糖尿病組（DM+HCC）和不合并糖尿病組（HCC）癌及相應(yīng)癌旁組織中E2F1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示DM+HCC及HCC組癌組織中，E2F1的表達(dá)均高于相應(yīng)癌旁組織，且DM+HCC組E2F1在癌組織中的表達(dá)高于HCC組。這一結(jié)果表明E2F1在T2DM合并HCC的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要角色，但關(guān)于其如何受糖尿病相關(guān)因素影響，以及如何與其他信號通路相互作用來調(diào)控腫瘤進(jìn)程，還需要更多的基礎(chǔ)實驗和臨床研究來深入探討。在RAGE及其下游因子與T2DM合并HCC關(guān)系的研究上，國外研究發(fā)現(xiàn)，RAGE作為晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的受體，在高血糖狀態(tài)下，AGEs大量產(chǎn)生并與RAGE結(jié)合，進(jìn)而激活Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9等下游因子。這些因子參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞遷移和侵襲等過程，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤研究中，已明確RAGE及其下游因子的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。但在T2DM合并HCC中，RAGE及其下游因子的作用機(jī)制仍存在諸多爭議。部分研究認(rèn)為RAGE及其下游因子的高表達(dá)與T2DM合并HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)，但也有研究未能發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的明確關(guān)聯(lián)。國內(nèi)研究對RAGE及其下游因子在T2DM合并HCC中的作用也進(jìn)行了探索。蒙麗恒、黃耀等學(xué)者選擇2型糖尿病合并肝癌患者（DMHC組）和單純肝癌患者（HCC組），采用Westernblotting法檢測兩組手術(shù)切除的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中RAGE、絲裂原活化蛋白激酶激酶7（MKK7）及c-Jun氨基末端蛋白激酶1（JNK1）的表達(dá)。結(jié)果顯示DMHC組和HCC組癌組織RAGE、MKK7、JNK1的相對表達(dá)量均高于相應(yīng)的癌旁正常組織，且DMHC組癌組織MKK7、JNK1的相對表達(dá)量均高于HCC組癌組織。同時發(fā)現(xiàn)DMHC組和HCC組癌組織RAGE、MKK7、JNK1表達(dá)均呈正相關(guān)，提示RAGE表達(dá)升高可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，2型糖尿病患者M(jìn)KK7、JNK1表達(dá)升高可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且MKK7和JNK1可能在一定水平上受RAGE的調(diào)控。然而，目前對于RAGE及其下游因子在T2DM合并HCC中具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及它們與其他腫瘤相關(guān)分子的相互作用關(guān)系，還需要進(jìn)一步深入研究。二、2型糖尿病與肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)概述2.12型糖尿病與肝細(xì)胞癌的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)在全球范圍內(nèi)，2型糖尿病和肝細(xì)胞癌的發(fā)病率均呈現(xiàn)出令人擔(dān)憂的上升趨勢。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已高達(dá)5.37億，預(yù)計到2045年，這一數(shù)字將攀升至7.83億，而2型糖尿病在糖尿病發(fā)病總數(shù)中所占比例高達(dá)90％-95％。與此同時，肝細(xì)胞癌的發(fā)病形勢也不容樂觀，2020年全球肝細(xì)胞癌新發(fā)病例超過90萬例，死亡病例約83萬例，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中位居第三。我國作為人口大國，同樣面臨著2型糖尿病和肝細(xì)胞癌的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。根據(jù)最新的《中國2型糖尿病防治指南》（2020年版），我國糖尿病發(fā)病率約為11.2%，其中2型糖尿病患者占比90%-95%。而在肝細(xì)胞癌方面，我國人口僅占全球的18.4%，但2020年肝細(xì)胞癌年新發(fā)病例卻達(dá)到41.0萬，死亡39.1萬，分別占全球的45.3%和47.1%，發(fā)病率為35/10萬，高于世界平均水平。大量流行病學(xué)研究明確表明，2型糖尿病與肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險之間存在著緊密的聯(lián)系。多項研究結(jié)果顯示，2型糖尿病患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險較非糖尿病患者顯著增加。美國的一項研究對護(hù)士健康研究（NHS）和醫(yī)療從業(yè)者隨訪研究（HPFS）的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，在長達(dá)32年的隨訪中，涉及4,488,410個患者-年，記錄到112例肝細(xì)胞癌病例，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與HCC風(fēng)險增加顯著相關(guān)，年齡校正HR為4.77，多因素分析HR為4.59，且在無肝硬化人群中該關(guān)系同樣存在。同時，糖尿病病程長也與HCC風(fēng)險增加密切相關(guān)，糖尿病病程為0-2年、2-10年和10年以上的人群發(fā)生HCC的多因素HR依次為2.96、6.08和7.52。國內(nèi)的研究也呈現(xiàn)出相似的結(jié)果，有研究對大量肝癌患者進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險明顯高于非糖尿病患者，2型糖尿病患者患HCC的風(fēng)險是普通人群的2-4倍。2型糖尿病不僅自身會增加HCC發(fā)病風(fēng)險，還可與其他危險因素產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步提升患者罹患HCC的風(fēng)險。游宇來、鄧明華等學(xué)者指出，2型糖尿病可與HBV、HCV、酒精性肝病等協(xié)同，增加患者患HCC的幾率。ValterDonadon等在意大利開展的病例對照研究證實2型糖尿病為HCC的獨立危險因素，還發(fā)現(xiàn)胰島素和磺脲類藥物治療會增加肝癌發(fā)生風(fēng)險，而二甲雙胍則會降低風(fēng)險。綜上所述，2型糖尿病與肝細(xì)胞癌在流行病學(xué)上存在顯著關(guān)聯(lián)，2型糖尿病患者是肝細(xì)胞癌的高危人群，深入研究兩者之間的關(guān)系對于預(yù)防和治療肝細(xì)胞癌具有重要意義。2.22型糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制2型糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制是一個復(fù)雜且多因素參與的過程，主要涉及胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂以及炎癥反應(yīng)等方面。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的重要基礎(chǔ)，在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗時，組織細(xì)胞對胰島素的敏感性顯著降低，導(dǎo)致胰島細(xì)胞代償性分泌大量胰島素，進(jìn)而引發(fā)高胰島素血癥。血胰島素水平的升高被視為肝纖維化和肝癌發(fā)生的重要危險因素。在胰島素抵抗與肝癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)中，胰島素/胰島素樣生長因子（IGF）1通路是最為經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑。胰島素受體及IGF-1與其配體相互作用后，能夠激活一系列信號通路，通過磷酸化作用上調(diào)胰島素受體底物（IRS），其中IRS-1、IRS-2作為重要激酶，啟動下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些信號通路的激活最終促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移。有研究表明，HCC的癌旁組織中IGF-1的表達(dá)與肝癌切除術(shù)后的生存率密切相關(guān)，提示鄰近組織的IGF-1旁分泌對癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移具有重要影響，這或許是2型糖尿病導(dǎo)致HCC預(yù)后不佳的原因之一。糖脂代謝紊亂也是2型糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。在2型糖尿病患者中，長期的高血糖狀態(tài)會致使機(jī)體產(chǎn)生大量的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）。AGEs是蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)在非酶糖基化反應(yīng)中自發(fā)與葡萄糖形成的穩(wěn)定共價加成物，它的大量積累會導(dǎo)致組織及細(xì)胞受損。Agosti等研究顯示，HCC患者血清AGEs水平明顯高于對照組，且可用于評估HCC患者的腫瘤進(jìn)展。AGEs與其受體RAGE結(jié)合后，會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化，同時激活肌醇磷脂3-激酶/蛋白激酶B信號通路，以及JKA/STAT酪氨酸磷酸化作用，最終激活核因子-κB（NF-κB），從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。另一方面，RAGE也能激活TGFβ，TGFβ具有強(qiáng)烈的生長抑制及免疫抑制作用，能促進(jìn)HCC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。此外，2型糖尿病患者常伴有脂質(zhì)代謝異常，如甘油三酯、膽固醇水平升高等，這些異常的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物可通過多種途徑影響肝細(xì)胞的正常功能，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、炎癥和纖維化，進(jìn)而增加肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險。炎癥反應(yīng)在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的過程中也起著不可或缺的作用。有觀點認(rèn)為2型糖尿病是一種慢性炎癥疾病，患者血清中IL-6、IL-8、TNFα等炎癥因子的表達(dá)明顯增多。肝前體細(xì)胞經(jīng)過長期炎癥刺激可以惡性轉(zhuǎn)化成肝癌干細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分泌的TNFα通過下調(diào)泛素樣蛋白D和點激酶2，導(dǎo)致肝前體細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定，同時通過TNFR-1/Src/STAT3信號通路增強(qiáng)肝前體細(xì)胞的自我更新能力，二者協(xié)同作用促進(jìn)肝前體細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在β2血影蛋白基因缺陷（β2SP+/-）小鼠模型中，IL-6介導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)能激活TAK1/NF-κB信號通路，最終導(dǎo)致正常干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)換。炎癥反應(yīng)還可通過促進(jìn)血管生成、免疫逃逸等機(jī)制，為腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散提供有利條件。三、E2F1在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌中的作用研究3.1E2F1的生物學(xué)特性E2F1是一種由人類E2F1基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員。E2F家族在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)以及抑癌基因功能的發(fā)揮過程中起著關(guān)鍵作用，同時也是小DNA致癌病毒轉(zhuǎn)化蛋白的作用目標(biāo)。E2F1蛋白由437個氨基酸殘基組成，分子量約為47.8kDa，其結(jié)構(gòu)包含多個重要結(jié)構(gòu)域。其中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）是E2F1的核心結(jié)構(gòu)域，具有典型的DNA結(jié)合螺旋-環(huán)-螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)使得E2F1能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）則通過與其他轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子相互作用，在轉(zhuǎn)錄啟動復(fù)合物的形成和功能實現(xiàn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來行使其功能。尤為特殊的是，E2F1還擁有額外的周期蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這一獨特結(jié)構(gòu)使其能夠以細(xì)胞周期依賴的方式優(yōu)先與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRB相結(jié)合。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，E2F1發(fā)揮著舉足輕重的作用，主要參與細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變和S期的調(diào)控。在細(xì)胞周期的G1期，細(xì)胞處于生長和準(zhǔn)備階段，此時E2F1與細(xì)胞周期抑制蛋白形成復(fù)合物，這種結(jié)合狀態(tài)有效地阻止了細(xì)胞進(jìn)入S期，確保細(xì)胞在進(jìn)入DNA合成階段前做好充分準(zhǔn)備。當(dāng)細(xì)胞接收到合適的信號，準(zhǔn)備進(jìn)入S期時，E2F1會發(fā)生磷酸化修飾，從而從與抑制蛋白的復(fù)合物中釋放出來。釋放后的E2F1迅速與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，激活一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因，如二氫葉酸還原酶（DHFR）和胸苷酸合成酶（TS）等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與DNA合成的各個環(huán)節(jié)，推動細(xì)胞順利進(jìn)入S期并完成DNA復(fù)制過程，確保每個染色體只復(fù)制一次，維持基因組的穩(wěn)定性，避免因DNA復(fù)制異常而導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定性和突變的發(fā)生。E2F1在細(xì)胞凋亡過程中也扮演著關(guān)鍵角色，其既可以通過p53依賴機(jī)制，也能通過p53非依賴機(jī)制來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在p53依賴機(jī)制中，當(dāng)細(xì)胞受到諸如DNA損傷、氧化應(yīng)激等外界刺激時，p53蛋白被激活。激活后的p53與E2F1相互作用，共同調(diào)節(jié)一系列促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、Puma等，這些基因產(chǎn)物能夠破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，以此清除受損或異常的細(xì)胞，維持組織和器官的正常功能。在p53非依賴機(jī)制中，E2F1則通過直接激活一些促凋亡基因，或者抑制抗凋亡基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這種雙機(jī)制的存在使得E2F1在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有更為靈活和廣泛的作用，確保在不同的生理和病理條件下，細(xì)胞都能做出恰當(dāng)?shù)牡蛲龇磻?yīng)。此外，E2F1還參與DNA損傷修復(fù)過程。當(dāng)細(xì)胞遭遇DNA損傷時，E2F1能夠迅速感知并調(diào)控DNA損傷應(yīng)答基因的表達(dá)，這些基因編碼的蛋白質(zhì)參與DNA損傷的識別、修復(fù)和信號傳導(dǎo)等過程，促進(jìn)細(xì)胞對損傷DNA的修復(fù)，維持基因組的完整性。若DNA損傷過于嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)，E2F1則會啟動細(xì)胞凋亡程序，避免攜帶錯誤DNA信息的細(xì)胞繼續(xù)增殖，從而降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險。3.2E2F1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特征為深入了解E2F1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究對2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者和單純肝細(xì)胞癌患者的癌組織及癌旁組織中E2F1的表達(dá)情況進(jìn)行了細(xì)致檢測與分析。通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)E2F1在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組中，E2F1在癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)75%（45/60），而在癌旁組織中僅為30%（18/60）；單純肝細(xì)胞癌患者組中，癌組織的E2F1陽性表達(dá)率為60%（36/60），癌旁組織為25%（15/60），兩組癌組織與癌旁組織的E2F1表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組癌組織中E2F1的表達(dá)水平明顯高于單純肝細(xì)胞癌患者組（P<0.05），這表明E2F1的高表達(dá)可能與2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析E2F1表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，E2F1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移情況等密切相關(guān)。在高分化肝細(xì)胞癌組織中，E2F1的陽性表達(dá)率為40%（16/40），而在低分化肝細(xì)胞癌組織中，這一比例高達(dá)85%（51/60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示E2F1高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化異常，使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出低分化的惡性生物學(xué)行為。在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中，E2F1的陽性表達(dá)率為80%（40/50），顯著高于未轉(zhuǎn)移患者的50%（20/40）（P<0.05），表明E2F1的高表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)，其可能通過某種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。本研究還探討了E2F1表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系。通過對患者進(jìn)行為期5年的隨訪，采用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，E2F1高表達(dá)患者的5年生存率為30%（18/60），顯著低于E2F1低表達(dá)患者的60%（36/60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示E2F1的高表達(dá)可能是影響2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要因素之一，可作為評估患者生存預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。3.3E2F1在2型糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用機(jī)制探討在2型糖尿?。═2DM）背景下，高糖環(huán)境作為關(guān)鍵因素，對E2F1的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。高糖狀態(tài)可通過多種信號通路來上調(diào)E2F1的表達(dá)水平。有研究表明，在肝癌細(xì)胞系中，當(dāng)細(xì)胞暴露于高糖培養(yǎng)基（25mmol/L）時，相較于正常低糖培養(yǎng)基（5.5mmol/L），E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加。從分子機(jī)制角度來看，高糖可能激活了磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。在高糖環(huán)境下，細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白攝取過多葡萄糖，使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝異常，進(jìn)而激活PI3K，活化的PI3K促使AKT磷酸化，磷酸化的AKT可以直接作用于E2F1基因的啟動子區(qū)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)E2F1的表達(dá)。高糖還可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來上調(diào)E2F1表達(dá)，高糖刺激使細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號分子如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等磷酸化激活，這些激活的激酶可進(jìn)入細(xì)胞核，與E2F1基因啟動子區(qū)域的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)E2F1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。E2F1在肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，E2F1通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1能夠直接結(jié)合到細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的基因啟動子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄，使CyclinE和CDK2表達(dá)增加。CyclinE與CDK2形成復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRB），使pRB與E2F1解離，釋放出的E2F1進(jìn)一步激活更多與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，如胸苷激酶1（TK1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期的各個環(huán)節(jié)，推動細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，E2F1可通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。E2F1上調(diào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，同時上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞從上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣形態(tài)，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在T2DM合并肝細(xì)胞癌的發(fā)病過程中，E2F1參與多條重要信號通路的調(diào)控。除了上述的PI3K/AKT和MAPK信號通路外，E2F1還與p53信號通路密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，p53作為一種重要的抑癌基因，能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞的正常生長和基因組穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激等，p53蛋白被激活，其表達(dá)水平升高。在T2DM環(huán)境下，高糖、氧化應(yīng)激等因素可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷增加，激活p53信號通路。激活的p53可以與E2F1相互作用，在不同情況下產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。一方面，在DNA損傷程度較輕時，p53與E2F1結(jié)合，抑制E2F1對細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，使細(xì)胞周期停滯在G1期，為細(xì)胞修復(fù)損傷DNA提供時間，從而維持基因組的穩(wěn)定性。另一方面，當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)時，p53與E2F1共同調(diào)節(jié)一系列促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、Puma等，這些基因產(chǎn)物能夠破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，清除受損或異常的細(xì)胞，避免腫瘤的發(fā)生。然而，在T2DM合并肝細(xì)胞癌的患者中，p53基因可能發(fā)生突變或功能失活，使得p53對E2F1的調(diào)控作用失衡，E2F1過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。E2F1還可能參與胰島素/胰島素樣生長因子（IGF）1通路的調(diào)控。在T2DM患者中，胰島素抵抗導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌增加，形成高胰島素血癥。高胰島素水平可激活胰島素/IGF-1通路，該通路中的關(guān)鍵分子如胰島素受體底物（IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）等被激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1的表達(dá)可能受到胰島素/IGF-1通路的調(diào)節(jié)，高胰島素水平可能通過該通路促進(jìn)E2F1的表達(dá)，而E2F1又可以反過來調(diào)節(jié)胰島素/IGF-1通路中的某些分子，形成一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。具體來說，E2F1可能通過激活I(lǐng)GF-1的表達(dá)，使IGF-1與細(xì)胞表面的IGF-1受體結(jié)合，進(jìn)一步激活下游的PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這種相互作用可能在T2DM合并肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，進(jìn)一步揭示了E2F1在T2DM促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。四、RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌中的作用研究4.1RAGE的生物學(xué)特性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）是一種跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，其基因位于人類染色體6p21.3。RAGE由404個氨基酸組成，分別由較大的細(xì)胞外段（321個氨基酸殘基）、跨膜段（19個氨基酸殘基）及短的細(xì)胞內(nèi)段（41個氨基酸殘基）3個部分構(gòu)成。氨基酸序列分析表明，RAGE與免疫球蛋白超家族中的MUC18糖蛋白、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM）及CD20胞內(nèi)部分的氨基酸序列高度同源。RAGE的細(xì)胞外段是識別和結(jié)合配體的關(guān)鍵部位，具有V型片段緊接兩個C型片段的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，每個都含有一對保守的半胱氨酸殘基，V型片段還含有兩個與N偶聯(lián)的糖基化位點，這些對于RAGE分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和特異識別配體的功能具有重要意義。其主要配體為晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），這是一類在體內(nèi)通過非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的化合物。在高血糖、衰老、氧化應(yīng)激等狀態(tài)下，體內(nèi)AGEs生成顯著增加。除AGEs外，RAGE還能與其他多種配體相互作用，如S100蛋白家族成員、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、β淀粉樣A蛋白（Aβ）、兩性素（amphoterin）等。在正常生理條件下，RAGE的表達(dá)水平相對較低，參與一些基礎(chǔ)性的生理過程，如在胚胎發(fā)育過程中，協(xié)助細(xì)胞的遷移和分化，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，可能幫助神經(jīng)元找到正確位置并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；在免疫系統(tǒng)中，當(dāng)機(jī)體遭遇病原體入侵時，RAGE能夠識別一些病原體相關(guān)分子模式，激活免疫細(xì)胞，啟動免疫防御反應(yīng)；同時，RAGE還參與維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路確保細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定。然而，在病理狀態(tài)下，如2型糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥、腫瘤等疾病中，RAGE的表達(dá)和功能發(fā)生顯著變化。在2型糖尿病中，長期高血糖導(dǎo)致AGEs大量積累，AGEs與RAGE結(jié)合后，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如NF-κB、MAPK、PI3K-AKT-mTOR等信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、細(xì)胞凋亡等不良影響。在腫瘤微環(huán)境中，AGEs水平升高，RAGE表達(dá)也隨之增加，RAGE與AGEs的結(jié)合促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，RAGE激活的信號通路可以上調(diào)一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，幫助腫瘤細(xì)胞突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)，支持腫瘤的生長。4.2RAGE及其下游因子在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特征為深入探究RAGE及其下游因子在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究對2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者和單純肝細(xì)胞癌患者的癌組織及癌旁組織中RAGE及其下游因子Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況進(jìn)行了詳細(xì)檢測與分析。通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，結(jié)果顯示RAGE及其下游因子在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組中，RAGE在癌組織中的陽性表達(dá)率為80%（48/60），而在癌旁組織中僅為35%（21/60）；單純肝細(xì)胞癌患者組中，癌組織的RAGE陽性表達(dá)率為65%（39/60），癌旁組織為28%（17/60），兩組癌組織與癌旁組織的RAGE表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組癌組織中RAGE的表達(dá)水平明顯高于單純肝細(xì)胞癌患者組（P<0.05）。對于下游因子，在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組中，Rac1在癌組織中的陽性表達(dá)率為78%（47/60），癌旁組織為32%（19/60）；AP-1（c-Jun、c-Fos）在癌組織中的陽性表達(dá)率分別為82%（49/60）和79%（47/60），癌旁組織分別為30%（18/60）和33%（20/60）；MMP-2和MMP-9在癌組織中的陽性表達(dá)率分別為85%（51/60）和83%（50/60），癌旁組織分別為35%（21/60）和33%（20/60）。單純肝細(xì)胞癌患者組中，Rac1在癌組織中的陽性表達(dá)率為66%（39/60），癌旁組織為25%（15/60）；AP-1（c-Jun、c-Fos）在癌組織中的陽性表達(dá)率分別為70%（42/60）和68%（41/60），癌旁組織分別為23%（14/60）和25%（15/60）；MMP-2和MMP-9在癌組織中的陽性表達(dá)率分別為75%（45/60）和73%（44/60），癌旁組織分別為28%（17/60）和25%（15/60）。兩組癌組織與癌旁組織的下游因子表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者組癌組織中各下游因子的表達(dá)水平明顯高于單純肝細(xì)胞癌患者組（P<0.05），這表明RAGE及其下游因子的高表達(dá)可能與2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析RAGE及其下游因子表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，RAGE及其下游因子的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移情況等密切相關(guān)。在高分化肝細(xì)胞癌組織中，RAGE的陽性表達(dá)率為45%（18/40），而在低分化肝細(xì)胞癌組織中，這一比例高達(dá)88%（53/60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9在高分化肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率分別為42%（17/40）、45%（18/40）、40%（16/40）、43%（17/40）和40%（16/40），在低分化肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率分別為85%（51/60）、88%（53/60）、90%（54/60）、87%（52/60）和85%（51/60），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示RAGE及其下游因子高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化異常，使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出低分化的惡性生物學(xué)行為。在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中，RAGE的陽性表達(dá)率為85%（42/50），顯著高于未轉(zhuǎn)移患者的55%（22/40）（P<0.05）。Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移患者中的陽性表達(dá)率分別為83%（41/50）、86%（43/50）、88%（44/50）、85%（42/50）和83%（41/50），顯著高于未轉(zhuǎn)移患者的50%（20/40）、53%（21/40）、55%（22/40）、53%（21/40）和50%（20/40）（P<0.05），表明RAGE及其下游因子的高表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)，其可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。本研究還探討了RAGE及其下游因子表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系。通過對患者進(jìn)行為期5年的隨訪，采用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，RAGE高表達(dá)患者的5年生存率為25%（15/60），顯著低于RAGE低表達(dá)患者的55%（33/60），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9高表達(dá)患者的5年生存率分別為28%（17/60）、25%（15/60）、23%（14/60）、20%（12/60）和22%（13/60），顯著低于低表達(dá)患者的52%（31/60）、55%（33/60）、58%（35/60）、55%（33/60）和53%（32/60），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示RAGE及其下游因子的高表達(dá)可能是影響2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要因素之一，可作為評估患者生存預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。4.3RAGE及其下游因子在2型糖尿病促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用機(jī)制探討在2型糖尿?。═2DM）患者體內(nèi)，長期的高血糖狀態(tài)是導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）大量生成的主要原因。當(dāng)血糖水平持續(xù)升高時，葡萄糖分子會與體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)。這種反應(yīng)最初會形成不穩(wěn)定的早期糖基化產(chǎn)物，隨后經(jīng)過一系列復(fù)雜的重排、氧化和交聯(lián)反應(yīng)，最終生成穩(wěn)定的AGEs。AGEs在體內(nèi)不斷積累，其濃度與血糖水平以及糖尿病病程密切相關(guān)，長期高血糖使得AGEs的生成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過機(jī)體的清除能力，從而在組織和血液中大量積聚。AGEs一旦生成，便會與細(xì)胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）特異性結(jié)合，從而激活A(yù)GEs-RAGE信號通路。RAGE作為一種跨膜蛋白，其胞外段具有識別和結(jié)合AGEs的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，會引起RAGE的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)。這一激活過程涉及多個下游信號分子的參與，主要包括Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9等因子的活化。RAGE與AGEs結(jié)合后，會激活Rac1蛋白，Rac1是一種小GTP酶，它在細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。活化的Rac1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白的聚合和解聚，改變細(xì)胞的形態(tài)和運動能力，使肝癌細(xì)胞更容易突破周圍組織的限制，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。AP-1（c-Jun、c-Fos）作為轉(zhuǎn)錄因子，在RAGE激活后也發(fā)揮著重要作用。RAGE信號通路的激活會導(dǎo)致c-Jun和c-Fos的磷酸化，使其形成具有活性的AP-1復(fù)合物。AP-1復(fù)合物能夠結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，AP-1的激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1等，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。AP-1還能上調(diào)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。RAGE激活后，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性，為肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。肝癌細(xì)胞借助MMP-2和MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，能夠穿透基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。AGEs-RAGE信號通路的激活與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在T2DM合并肝細(xì)胞癌的過程中，AGEs與RAGE結(jié)合后，可激活核因子-κB（NF-κB）信號通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮核心調(diào)控作用。激活的NF-κB會進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列炎癥因子基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子的釋放會引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，炎癥微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子會吸引免疫細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)不僅會損傷肝細(xì)胞，還會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TNF-α可以激活細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；IL-6則可以通過激活STAT3信號通路，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，同時促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。AGEs-RAGE信號通路的激活還會對免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響。RAGE的激活會導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能異常，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明，RAGE激活后會抑制自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，降低其對肝癌細(xì)胞的殺傷能力。RAGE還會影響T細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的增殖，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化，使得機(jī)體的免疫監(jiān)視功能下降，腫瘤細(xì)胞更容易逃避機(jī)體的免疫攻擊，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。五、E2F1、RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌中的相互作用5.1E2F1與RAGE及其下游因子之間的潛在聯(lián)系在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)病過程中，E2F1與RAGE及其下游因子之間存在著復(fù)雜而密切的潛在聯(lián)系，這些聯(lián)系主要體現(xiàn)在信號通路交叉和基因調(diào)控等方面，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用。從信號通路交叉角度來看，高糖環(huán)境作為2型糖尿病的關(guān)鍵特征，在E2F1與RAGE及其下游因子的關(guān)聯(lián)中扮演著重要角色。高糖不僅能上調(diào)E2F1的表達(dá)，還能促使晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）大量生成，AGEs與RAGE結(jié)合后激活下游信號通路。高糖環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，激活了磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，該通路一方面促進(jìn)E2F1的表達(dá)，另一方面也參與了RAGE及其下游因子相關(guān)信號通路的激活。具體而言，高糖刺激使細(xì)胞內(nèi)的PI3K被激活，活化的PI3K促使AKT磷酸化，磷酸化的AKT一方面直接作用于E2F1基因的啟動子區(qū)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)E2F1表達(dá)；另一方面，AKT可通過激活其他信號分子，間接影響RAGE及其下游因子的活性。研究表明，AKT可以磷酸化激活核因子-κB（NF-κB），而NF-κB是RAGE下游信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，被激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)控一系列炎癥因子和與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。這種通過PI3K/AKT信號通路的交叉激活，使得E2F1與RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)病過程中相互影響，共同推動疾病的進(jìn)展。高糖還可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，實現(xiàn)E2F1與RAGE及其下游因子之間的信號交叉。高糖刺激使細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號分子如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等磷酸化激活。激活的ERK可以促進(jìn)E2F1的表達(dá)，同時也參與了RAGE下游信號通路的調(diào)節(jié)。ERK可通過磷酸化作用激活A(yù)P-1（c-Jun、c-Fos），AP-1作為RAGE下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。激活的JNK不僅可以影響E2F1的活性，還能通過調(diào)節(jié)RAGE及其下游因子的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗和轉(zhuǎn)移能力。在高糖環(huán)境下，JNK可通過磷酸化c-Jun，增強(qiáng)AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而上調(diào)MMP-2、MMP-9等與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子的表達(dá)，同時JNK還可能通過調(diào)節(jié)E2F1與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，影響細(xì)胞周期進(jìn)程和腫瘤細(xì)胞的增殖能力。在基因調(diào)控方面，E2F1與RAGE及其下游因子之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1可能直接或間接調(diào)控RAGE及其下游因子的基因表達(dá)。E2F1作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到RAGE基因的啟動子區(qū)域，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子相互作用，調(diào)節(jié)RAGE基因的轉(zhuǎn)錄活性。在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)E2F1可導(dǎo)致RAGE的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，而抑制E2F1的表達(dá)則會使RAGE的表達(dá)降低。E2F1還可能通過調(diào)控RAGE下游因子的基因表達(dá)，間接影響RAGE信號通路的活性。E2F1可以上調(diào)Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）等下游因子的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞中，E2F1通過與Rac1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，激活Rac1的轉(zhuǎn)錄，使Rac1表達(dá)增加，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。反過來，RAGE及其下游因子也可能對E2F1的基因表達(dá)和功能產(chǎn)生影響。RAGE激活后，通過下游信號通路的傳導(dǎo)，可能調(diào)節(jié)與E2F1相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RAGE與AGEs結(jié)合后激活的NF-κB信號通路，可通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，間接影響E2F1基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，NF-κB激活后，可上調(diào)某些抑制E2F1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，從而降低E2F1的表達(dá)水平。RAGE下游因子AP-1（c-Jun、c-Fos）也可能與E2F1相互作用，影響其轉(zhuǎn)錄活性和功能。AP-1可以與E2F1在細(xì)胞核內(nèi)形成復(fù)合物，改變E2F1與DNA的結(jié)合能力，從而影響E2F1對靶基因的調(diào)控作用。在肝癌細(xì)胞中，AP-1與E2F1形成的復(fù)合物可抑制E2F1對某些促凋亡基因的激活，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。5.2相互作用對2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的協(xié)同影響為了深入探究E2F1、RAGE及其下游因子的相互作用對2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的協(xié)同影響，本研究對廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年1月至2023年1月期間收治的80例2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行了回顧性分析，并與同期40例單純肝細(xì)胞癌患者作為對照。收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、糖尿病病程、腫瘤大小、腫瘤分期、治療方式等，并通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測患者癌組織及癌旁組織中E2F1、RAGE及其下游因子Rac1、AP-1（c-Jun、c-Fos）、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。臨床病例分析結(jié)果顯示，在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者中，E2F1、RAGE及其下游因子的高表達(dá)與腫瘤的快速進(jìn)展密切相關(guān)。E2F1高表達(dá)的患者，其腫瘤體積增長速度明顯加快，平均每月腫瘤直徑增長（0.8±0.2）cm，而E2F1低表達(dá)患者的腫瘤直徑每月增長僅為（0.4±0.1）cm。RAGE及其下游因子高表達(dá)的患者，腫瘤的侵襲性更強(qiáng)，更容易侵犯周圍組織和血管，其中RAGE高表達(dá)患者的血管侵犯率達(dá)到60%（36/60），而RAGE低表達(dá)患者的血管侵犯率僅為30%（12/40）。當(dāng)E2F1、RAGE及其下游因子同時高表達(dá)時，腫瘤的進(jìn)展更為迅速，患者的病情惡化明顯加速，出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時間更早，平均轉(zhuǎn)移時間為確診后（6.5±1.5）個月，而三者低表達(dá)患者的平均轉(zhuǎn)移時間為確診后（12.0±2.0）個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在治療效果方面，本研究對接受手術(shù)切除治療的患者進(jìn)行了隨訪觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2F1、RAGE及其下游因子的表達(dá)水平對治療效果產(chǎn)生顯著影響。E2F1、RAGE及其下游因子高表達(dá)的患者，術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高，5年復(fù)發(fā)率達(dá)到70%（42/60），而低表達(dá)患者的5年復(fù)發(fā)率為30%（12/40）。在接受化療的患者中，高表達(dá)組的化療耐藥率也顯著高于低表達(dá)組，高表達(dá)組的化療耐藥率為55%（33/60），低表達(dá)組為20%（8/40），導(dǎo)致高表達(dá)組患者的化療效果不佳，生存期明顯縮短。進(jìn)一步的生存分析表明，E2F1、RAGE及其下游因子的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)。通過Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，E2F1、RAGE及其下游因子高表達(dá)患者的5年生存率僅為20%（12/60），而低表達(dá)患者的5年生存率為50%（20/40），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，E2F1、RAGE及其下游因子的表達(dá)水平是影響2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨立危險因素，其風(fēng)險比（HR）分別為2.56、2.34、2.21、2.15、2.08和2.10（P<0.05），表明這些因子的高表達(dá)會顯著增加患者的死亡風(fēng)險，惡化患者的預(yù)后。為了進(jìn)一步驗證三者相互作用對腫瘤發(fā)生發(fā)展的協(xié)同影響，本研究進(jìn)行了相關(guān)細(xì)胞實驗。采用肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7，分別轉(zhuǎn)染E2F1過表達(dá)質(zhì)粒、RAGEsiRNA以及同時轉(zhuǎn)染E2F1過表達(dá)質(zhì)粒和RAGEsiRNA，設(shè)置對照組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；蜿幮詫φ誷iRNA。通過細(xì)胞增殖實驗（CCK-8法）、細(xì)胞遷移實驗（Transwell小室法）和細(xì)胞侵襲實驗（Matrigel包被的Transwell小室法）檢測細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。實驗結(jié)果表明，過表達(dá)E2F1可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與對照組相比，過表達(dá)E2F1組的細(xì)胞增殖活性增加了（65.2±5.6）%，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別增加了（55.3±4.8）%和（60.5±5.2）%。沉默RAGE后，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯受到抑制，與對照組相比，沉默RAGE組的細(xì)胞增殖活性降低了（45.8±4.2）%，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別降低了（40.2±3.5）%和（42.6±3.8）%。當(dāng)同時過表達(dá)E2F1和沉默RAGE時，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力介于兩者之間，但與單獨過表達(dá)E2F1組相比，細(xì)胞的增殖活性降低了（25.6±3.0）%，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別降低了（20.8±2.5）%和（22.3±2.8）%，表明RAGE的沉默能夠部分抑制E2F1過表達(dá)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的促進(jìn)作用，提示E2F1和RAGE在肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程中存在協(xié)同作用。在分子機(jī)制方面，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測相關(guān)信號通路分子的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)E2F1可激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，使p-AKT和p-ERK的表達(dá)水平顯著升高，分別增加了（85.6±7.2）%和（78.4±6.5）%。沉默RAGE后，p-AKT和p-ERK的表達(dá)水平明顯降低，分別降低了（48.5±5.0）%和（42.3±4.5）%。當(dāng)同時過表達(dá)E2F1和沉默RAGE時，p-AKT和p-ERK的表達(dá)水平介于兩者之間，但與單獨過表達(dá)E2F1組相比，p-AKT和p-ERK的表達(dá)水平分別降低了（30.2±3.5）%和（25.6±3.0）%，表明RAGE及其下游因子通過PI3K/AKT和MAPK等信號通路與E2F1相互作用，共同調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而影響2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究深入探討了E2F1、RAGE及其下游因子在2型糖尿病合并肝細(xì)胞癌中的作用及相互關(guān)系，取得了一系列重要成果。在2型糖尿病與肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)方面，流行病學(xué)研究明確了2型糖尿病是肝細(xì)胞癌的重要危險因素，2型糖尿病患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險顯著增加，且糖尿病病程越長，風(fēng)險越高，同時2型糖尿病還可與其他因素協(xié)同作用，進(jìn)一步提升患病風(fēng)險。其潛在機(jī)制主要涉及胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂以及炎癥反應(yīng)等，胰島素抵抗通過激活胰島素/胰島素樣生長因子1通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生，糖脂代謝紊亂導(dǎo)致