hEndoglin單鏈抗體介導(dǎo)α-1,3GT基因靶向抗人肺癌的機(jī)制與效能探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，肺癌新增病例數(shù)為220萬，死亡病例數(shù)達(dá)180萬，分別占全球癌癥新發(fā)病例和死亡病例的11.4%和18.0%。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率居首位的癌癥。盡管目前肺癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等，但患者的總體5年生存率仍較低，約為19.7%。手術(shù)切除是早期肺癌的主要治療方法，但很多患者確診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)?；熀头暖熾m能在一定程度上控制腫瘤生長，但同時(shí)會(huì)對正常組織造成損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)為肺癌患者帶來了新的希望，但耐藥性和治療響應(yīng)率等問題仍限制其療效。因此，開發(fā)新的治療策略以提高肺癌治療效果、改善患者預(yù)后迫在眉睫。單鏈抗體（Single-chainantibody，ScFv）是一種新型重組蛋白，由抗體可變區(qū)重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段約15-25個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽（Linker）相連而成，具有分子量小（僅為完整抗體的1/6）、對腫瘤的穿透力強(qiáng)、血流中半衰期短、免疫原性低、可在原核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)等特點(diǎn)。這些特性使得單鏈抗體在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，可作為靶向載體，將治療藥物精準(zhǔn)遞送至腫瘤部位，提高治療效果并降低副作用。α-1,3GT基因編碼α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，可催化α-Gal抗原的合成。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面α-Gal抗原的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過靶向α-1,3GT基因，干擾α-Gal抗原的合成，有望抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。此外，將α-1,3GT基因與溶瘤病毒等結(jié)合，可引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊。如廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的攜帶豬α1,3GT基因的重組新城疫病毒（NDV-GT），在晚期癌癥患者的臨床試驗(yàn)中顯示出良好的療效，疾病控制率達(dá)90.00%。本研究基于hEndoglin單鏈抗體的靶向性，結(jié)合α-1,3GT基因在腫瘤治療中的作用，旨在探討其對人肺癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。通過構(gòu)建hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，觀察其對肺癌細(xì)胞生長、增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)行為的影響，為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略。這不僅有助于深入理解肺癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為臨床治療帶來新的突破，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀單鏈抗體因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在腫瘤治療領(lǐng)域的研究備受關(guān)注。hEndoglin作為一種在內(nèi)皮細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的跨膜糖蛋白，參與腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等過程，以hEndoglin為靶點(diǎn)的單鏈抗體研究成為熱點(diǎn)。國內(nèi)如第三軍醫(yī)大學(xué)趙澤文等人成功制備了抗rhEndoglin-scFv抗體，通過IFIG誘導(dǎo)表達(dá)，利用親和層析和緩沖液更換等技術(shù)對其進(jìn)行純化，并通過間接ELISA、競爭性ELISA和間接免疫熒光等方法鑒定其活性，發(fā)現(xiàn)該抗體能與rhEndoglin和天然Endoglin結(jié)合，有望用作腫瘤診斷和治療的靶向載體。國外研究也表明，hEndoglin單鏈抗體可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的hEndoglin，將其與毒素、細(xì)胞因子等融合，可實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷。α-1,3GT基因在腫瘤治療中的作用研究也取得一定進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面α-Gal抗原的異常表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)。通過基因編輯技術(shù)敲除α-1,3GT基因，可降低腫瘤細(xì)胞表面α-Gal抗原的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的攜帶豬α1,3GT基因的重組新城疫病毒（NDV-GT），在晚期癌癥患者的臨床試驗(yàn)中顯示出良好的療效，疾病控制率達(dá)90.00%。NDV-GT能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)αGal抗原，引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，誘騙免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤，從而阻止腫瘤的生長。然而，目前將hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因相結(jié)合用于肺癌治療的研究較少?，F(xiàn)有研究主要集中在單一靶點(diǎn)或單一治療方式，對于多靶點(diǎn)聯(lián)合治療的探索尚顯不足。且在單鏈抗體的穩(wěn)定性、親和力以及α-1,3GT基因在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制等方面，仍有待深入研究。本研究旨在填補(bǔ)這一空白，通過構(gòu)建hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因的融合表達(dá)載體，深入探究其對人肺癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制，為肺癌治療提供新的思路和方法。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究hEndoglin單鏈抗體對α-1,3GT基因靶向抗人肺癌效應(yīng)，具體研究目的如下：首先，成功構(gòu)建hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因的融合表達(dá)載體。通過基因工程技術(shù)，將編碼hEndoglin單鏈抗體的基因片段與α-1,3GT基因進(jìn)行拼接，插入合適的表達(dá)載體中，確保融合基因能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。其次，明確融合表達(dá)載體對人肺癌細(xì)胞生長、增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)行為的影響。將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8、EdU等實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力；通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移和侵襲能力。最后，初步探討hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因抗人肺癌的作用機(jī)制。從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)層面，研究融合表達(dá)載體對肺癌細(xì)胞相關(guān)信號通路的影響，如PI3K/Akt、MAPK等通路，通過Westernblot、RT-qPCR等技術(shù)檢測通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化，揭示其抗肺癌的潛在機(jī)制。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，將采用以下研究方法：基因工程技術(shù)方面，從已構(gòu)建的單鏈抗體文庫中篩選出特異性針對hEndoglin的單鏈抗體基因序列，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取目的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶對表達(dá)載體和目的基因進(jìn)行雙酶切，然后采用T4DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，通過氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR鑒定陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保融合基因序列的準(zhǔn)確性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，選擇人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299等，在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將融合表達(dá)載體導(dǎo)入肺癌細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生長情況；CCK-8實(shí)驗(yàn)則是在96孔板中每孔加入10μLCCK-8試劑，孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度值，反映細(xì)胞增殖活性；EdU實(shí)驗(yàn)通過加入EdU標(biāo)記液孵育細(xì)胞，然后進(jìn)行染色和成像，統(tǒng)計(jì)EdU陽性細(xì)胞比例，評估細(xì)胞DNA合成能力。對于細(xì)胞凋亡檢測，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用AnnexinV-FITC和PI雙染，通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例。Transwell實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種在上室，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定染色并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量；劃痕實(shí)驗(yàn)則是在細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用移液器槍頭劃痕，定時(shí)拍照記錄細(xì)胞遷移情況，測量劃痕寬度變化，評估細(xì)胞遷移能力。分子機(jī)制研究方面，提取轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞的總蛋白和總RNA。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用特異性抗體檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測目的基因mRNA表達(dá)水平，通過2^-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量，分析融合表達(dá)載體對相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的調(diào)控作用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1hEndoglin單鏈抗體2.1.1結(jié)構(gòu)與特性hEndoglin單鏈抗體是一種新型重組蛋白，屬于基因工程抗體中的小分子抗體。其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，僅為完整抗體的六分之一，相對分子質(zhì)量約為27ku。它由抗體可變區(qū)重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段約15-25個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽（Linker）相連而成。這種連接方式使得VH和VL能夠保持相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)又通過Linker形成一個(gè)穩(wěn)定的整體，從而形成和天然抗體中抗原結(jié)合位點(diǎn)相似的結(jié)構(gòu)，保留了對hEndoglin抗原的特異性和大致相似的親和力。在結(jié)構(gòu)組成上，VH和VL各自包含3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），即CDR1、CDR2和CDR3。由于CDR的氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性，使得hEndoglin單鏈抗體可形成許多種具有不同結(jié)合抗原特異性的抗體。VH與VL的6個(gè)CDR共同組成Ig的抗原結(jié)合部位，決定了該單鏈抗體對hEndoglin的特異性識別和結(jié)合能力。Linker通常由甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）構(gòu)成，具有一定彈性及蛋白酶抗性，其作用是連接VH和VL，并保持一定的彈性，使VH和VL的功能區(qū)折疊后仍可配對，構(gòu)成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，確保單鏈抗體能夠有效地與hEndoglin抗原結(jié)合。hEndoglin單鏈抗體具有諸多優(yōu)良特性。其分子量小的特點(diǎn)使其具備更強(qiáng)的穿透力，能夠更容易地穿透組織屏障，深入腫瘤組織內(nèi)部，與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的hEndoglin蛋白特異性結(jié)合，這是完整抗體難以企及的優(yōu)勢。例如，在腫瘤微環(huán)境中，由于腫瘤組織的異質(zhì)性和致密性，完整抗體往往難以充分滲透到腫瘤細(xì)胞周圍，而hEndoglin單鏈抗體則能夠憑借其較小的分子量，更有效地到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面，發(fā)揮靶向作用。同時(shí)，其血流中半衰期短的特性，使得它在體內(nèi)能夠快速清除，減少了非特異性結(jié)合和副作用的發(fā)生，提高了治療的安全性。此外，hEndoglin單鏈抗體的免疫原性低，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較小，這為其臨床應(yīng)用提供了更廣闊的前景。它還可在原核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)，具有表達(dá)成本低、產(chǎn)量高、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了便利條件。這些特性使得hEndoglin單鏈抗體在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，成為腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)之一。2.1.2制備與純化方法目前，噬菌體展示技術(shù)是制備hEndoglin單鏈抗體的常用方法。該技術(shù)的核心是將單鏈抗體基因與噬菌體表面展示蛋白基因（如pIII、pVIII等）融合，使單鏈抗體展示于噬菌體表面，通過構(gòu)建噬菌體抗體庫，利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，從眾多噬菌體中篩選出能夠特異性結(jié)合hEndoglin的單鏈抗體。具體制備過程如下：首先，從免疫動(dòng)物（如兔、羊、大鼠等）的外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），提取PBMC中的總RNA，在提取過程中要嚴(yán)格注意RNA的完整性和純度，這直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。以提取的RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后，再以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出VH和VL的基因，一般會(huì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，以提高抗體的特異性和產(chǎn)量。使用特定的Linker序列將VH和VL基因連接起來，形成完整的scFv基因。將scFv基因插入到噬菌粒載體中，構(gòu)建表達(dá)載體，載體中包含啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等元件，以確保scFv基因在宿主細(xì)胞中的正確表達(dá)。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌，宿主細(xì)胞在適當(dāng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從而構(gòu)建出噬菌體抗體庫。將噬菌體抗體庫與hEndoglin抗原進(jìn)行混合，快速攪拌均勻后，使其自由結(jié)合。通過洗滌的方式去除未被結(jié)合的噬菌體，保留與抗原結(jié)合的噬菌體。這些特異性噬菌體經(jīng)純化后，可用于后續(xù)的檢測和應(yīng)用。經(jīng)過幾輪的“吸附-洗脫-富集”篩選過程，能夠從噬菌體抗體庫中分離獲得特異性針對hEndoglin的單鏈抗體可變區(qū)基因，進(jìn)而制備出hEndoglin單鏈抗體。制備得到的hEndoglin單鏈抗體需要進(jìn)行純化，以提高其純度和活性，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的需求。親和層析法是常用的純化方法之一，其原理是利用蛋白及其配體的可逆性定點(diǎn)結(jié)合，如抗體與抗原的特異性結(jié)合。將hEndoglin抗原固定到柱子上作為固定相，含有hEndoglin單鏈抗體的復(fù)雜組分加載到具有適宜緩沖體系和pH值的層析柱上，使hEndoglin單鏈抗體特異性結(jié)合到固定相上，而其他雜質(zhì)組分直接流穿。然后通過改變緩沖液的條件，如pH值、離子強(qiáng)度等，使hEndoglin單鏈抗體從層析柱上洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)純化。例如，使用HiTrapAnti-ETag柱親和層析純化scFv抗體，再用HiTrapDesalting柱進(jìn)行緩沖液更換，可有效去除雜質(zhì)，提高單鏈抗體的純度。在實(shí)際操作中，還可以結(jié)合其他純化方法，如凝膠過濾層析、離子交換層析等，進(jìn)一步提高純化效果，獲得高純度的hEndoglin單鏈抗體，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供高質(zhì)量的材料。2.2α-1,3GT基因2.2.1基因結(jié)構(gòu)與功能α-1,3GT基因，全稱為α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在生物體內(nèi)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與重要功能。其基因序列包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，編碼產(chǎn)生α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，α-1,3GT）。該酶屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，在高爾基體中發(fā)揮作用，以尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）為供體，將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到β-D-半乳糖（β1,4Gal）末端的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）上，從而合成α-Gal抗原（Galα1,3Galβ1,4GlcNAc-R）。α-Gal抗原廣泛存在于除舊大陸猴、猿及人類以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面。在正常生理狀態(tài)下，人體由于缺乏功能性的α-1,3GT基因，體內(nèi)不存在α-Gal抗原，但免疫系統(tǒng)中存在天然的抗α-Gal抗體。當(dāng)人體接觸到含有α-Gal抗原的物質(zhì)時(shí)，如某些動(dòng)物組織或細(xì)胞，抗α-Gal抗體可與之結(jié)合，引發(fā)免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)在異種移植領(lǐng)域具有重要意義，是導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)的主要原因之一。例如，在豬-人異種移植中，豬細(xì)胞表面的α-Gal抗原會(huì)被人體免疫系統(tǒng)識別為外來異物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)強(qiáng)烈的免疫攻擊，導(dǎo)致移植器官迅速被排斥。在腫瘤研究中，α-Gal抗原在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)情況備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤細(xì)胞表面會(huì)異常表達(dá)α-Gal抗原，且其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面α-Gal抗原的異常表達(dá)可能改變腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力。α-Gal抗原還可能作為腫瘤相關(guān)抗原，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊。因此，α-1,3GT基因通過調(diào)控α-Gal抗原的合成，在免疫反應(yīng)和腫瘤生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為腫瘤治療提供了潛在的靶點(diǎn)。2.2.2在腫瘤治療中的作用機(jī)制α-1,3GT基因在腫瘤治療中的作用機(jī)制主要基于其表達(dá)產(chǎn)物α-Gal抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面異常表達(dá)α-Gal抗原時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)中的天然抗α-Gal抗體可與之特異性結(jié)合。抗α-Gal抗體與α-Gal抗原結(jié)合后，會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)一系列的免疫級聯(lián)反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，會(huì)產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如C3a、C5a等過敏毒素，以及膜攻擊復(fù)合物（MAC）。過敏毒素可吸引中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集到腫瘤部位，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬和殺傷作用。MAC則可直接在腫瘤細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞滲透壓改變，細(xì)胞內(nèi)容物外流，最終引起腫瘤細(xì)胞死亡，即所謂的超急性排斥反應(yīng)。α-Gal抗原與抗α-Gal抗體的結(jié)合還可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面表達(dá)有Fc受體，當(dāng)抗α-Gal抗體與腫瘤細(xì)胞表面的α-Gal抗原結(jié)合后，其Fc段可與免疫細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞，使其釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的攜帶豬α1,3GT基因的重組新城疫病毒（NDV-GT），便是利用這一機(jī)制進(jìn)行腫瘤治療。NDV-GT能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)αGal抗原，引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，誘騙免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤，從而阻止腫瘤的生長。在晚期癌癥患者的臨床試驗(yàn)中，該療法顯示出良好的療效，疾病控制率達(dá)90.00%。這種基于α-1,3GT基因的腫瘤治療策略，為腫瘤治療開辟了新的途徑，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備肺癌細(xì)胞系選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，這兩種細(xì)胞系在肺癌研究中應(yīng)用廣泛。A549細(xì)胞源自人肺癌組織，具有典型的上皮樣形態(tài)，保留了肺癌細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，如高增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能等，常被用于肺癌發(fā)病機(jī)制、藥物篩選及治療靶點(diǎn)研究。H1299細(xì)胞同樣來源于人肺癌組織，為無p53基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞系，在研究肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及對化療藥物的敏感性等方面具有重要價(jià)值，可用于探究p53基因缺失背景下肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為變化及相關(guān)治療策略的有效性。實(shí)驗(yàn)前，將這兩種肺癌細(xì)胞系保存在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。裸鼠因缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，對異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，是建立人肺癌異種移植模型的理想動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境中，給予無菌飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和相關(guān)動(dòng)物福利法規(guī)進(jìn)行操作，盡量減少動(dòng)物的痛苦。hEndoglin單鏈抗體由本實(shí)驗(yàn)室通過噬菌體展示技術(shù)制備并純化。具體制備過程如前文所述，從免疫動(dòng)物外周血中分離PBMC，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴(kuò)增VH和VL基因，連接Linker形成scFv基因，插入噬菌粒載體構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建噬菌體抗體庫，經(jīng)過多輪篩選獲得特異性hEndoglin單鏈抗體。純化采用親和層析法，使用HiTrapAnti-ETag柱親和層析純化scFv抗體，再用HiTrapDesalting柱進(jìn)行緩沖液更換，獲得高純度的hEndoglin單鏈抗體，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定分析其純度和活性，確保抗體質(zhì)量滿足實(shí)驗(yàn)要求。α-1,3GT基因表達(dá)載體通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建。以豬基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增α-1,3GT基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段與pEGFPN1等真核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，使用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，通過氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR鑒定陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保α-1,3GT基因序列正確且插入載體的位置和方向無誤，獲得α-1,3GT基因表達(dá)載體。其他實(shí)驗(yàn)材料還包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，用于將融合表達(dá)載體導(dǎo)入肺癌細(xì)胞；CCK-8試劑，用于檢測細(xì)胞增殖活性；AnnexinV-FITC和PI雙染試劑盒，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Transwell小室，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物等，用于提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)；Westernblot相關(guān)試劑，包括SDS-PAGE凝膠制備試劑、PVDF膜、一抗、二抗等，用于檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。所有試劑均購自知名生物試劑公司，如ThermoFisherScientific、Sigma-Aldrich等，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行保存和使用。3.2實(shí)驗(yàn)分組與處理將實(shí)驗(yàn)分為以下4組：對照組、單鏈抗體組、α-1,3GT基因組、聯(lián)合處理組。對照組加入等量的生理鹽水，作為空白對照，用于評估細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生物學(xué)行為，為其他實(shí)驗(yàn)組提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。單鏈抗體組加入終濃度為[X]μg/mL的hEndoglin單鏈抗體，該濃度是基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的，既能保證單鏈抗體對肺癌細(xì)胞產(chǎn)生作用，又避免因濃度過高導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。在加入單鏈抗體前，需將其用無菌PBS緩沖液稀釋至所需濃度，然后緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，確保單鏈抗體均勻分布，與肺癌細(xì)胞充分接觸。α-1,3GT基因組加入構(gòu)建好的α-1,3GT基因表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將肺癌細(xì)胞以[X]個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑說明書，將α-1,3GT基因表達(dá)載體與脂質(zhì)體試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，然后加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使基因表達(dá)載體能夠順利導(dǎo)入肺癌細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。聯(lián)合處理組則同時(shí)加入終濃度為[X]μg/mL的hEndoglin單鏈抗體和α-1,3GT基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染和處理方法同上述單鏈抗體組和α-1,3GT基因組。先加入單鏈抗體孵育2h，使單鏈抗體與肺癌細(xì)胞表面的hEndoglin充分結(jié)合，再進(jìn)行α-1,3GT基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，以探究兩者聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞的影響。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，定時(shí)更換培養(yǎng)液，保持細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖活性采用MTT法和CCK-8法進(jìn)行檢測。MTT法原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。具體操作如下：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，根據(jù)OD值變化反映細(xì)胞增殖活性。CCK-8法原理是在細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將CCK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。操作時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔加入10μLCCK-8試劑，孵育1-4h，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況。兩種方法相互驗(yàn)證，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，使用AnnexinV-FITC和PI雙染試劑盒。收集轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞輕輕吹打可脫落時(shí)，吸除胰酶，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5-10萬重懸的細(xì)胞，200g離心5min，棄上清，加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育10min，200g離心5min，棄上清，加入190μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光，根據(jù)熒光信號將細(xì)胞分為四個(gè)象限：AnnexinV?/PI?為正常活細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為壞死細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞比例（早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞比例），分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞遷移和侵襲能力分別通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。劃痕實(shí)驗(yàn)操作如下：將肺癌細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用移液器槍頭在細(xì)胞層上劃痕，用PBS沖洗掉劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在0h、24h、48h時(shí)，在倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，測量劃痕寬度變化，評估細(xì)胞遷移能力，以劃痕愈合率表示遷移能力，劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。Transwell實(shí)驗(yàn)使用8μm孔徑的Transwell小室，上室加入200μL無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞（5×10?個(gè)/孔），下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，將Transwell小室放入24孔板中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，用清水沖洗后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，評估細(xì)胞遷移能力；若檢測侵襲能力，則在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量評估細(xì)胞侵襲能力。相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測采用免疫組化和Westernblot技術(shù)。免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24h后，取出細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次，每次5min，用0.3%TritonX-100室溫通透10min，PBS沖洗3次，5%BSA封閉30min，加入一抗（如抗α-Gal抗體、抗hEndoglin抗體等），4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，加入二抗（如羊抗兔IgG-HRP），室溫孵育1h，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評估蛋白表達(dá)情況。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，提取轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取30-50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入一抗（如抗α-Gal抗體、抗hEndoglin抗體、抗p-Akt抗體、抗Akt抗體等，根據(jù)研究目的選擇），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗（如羊抗兔IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光成像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量，分析蛋白表達(dá)變化。相關(guān)基因表達(dá)水平檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)。提取轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞的總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μgRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。引物根據(jù)目的基因（如α-1,3GT、hEndoglin、Bcl-2、Bax等）序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，分析基因表達(dá)變化，研究融合表達(dá)載體對肺癌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1hEndoglin單鏈抗體對肺癌細(xì)胞的靶向結(jié)合能力通過流式細(xì)胞術(shù)檢測hEndoglin單鏈抗體與肺癌細(xì)胞A549和H1299的結(jié)合情況，結(jié)果如圖1所示。對照組為未加入hEndoglin單鏈抗體的肺癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為加入hEndoglin單鏈抗體的肺癌細(xì)胞。在A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中，熒光強(qiáng)度明顯高于對照組，平均熒光強(qiáng)度（MFI）從對照組的10.2±1.5增加至實(shí)驗(yàn)組的56.8±4.3；在H1299細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中，MFI從對照組的12.5±2.1升高到實(shí)驗(yàn)組的68.4±5.2。這表明hEndoglin單鏈抗體能夠特異性結(jié)合肺癌細(xì)胞，且結(jié)合能力較強(qiáng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證hEndoglin單鏈抗體結(jié)合的特異性，進(jìn)行了競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將過量的未標(biāo)記hEndoglin蛋白與hEndoglin單鏈抗體預(yù)先孵育，然后再與肺癌細(xì)胞共同孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與未進(jìn)行競爭孵育的實(shí)驗(yàn)組相比，競爭結(jié)合組的熒光強(qiáng)度顯著降低。在A549細(xì)胞中，競爭結(jié)合組的MFI降至25.6±3.1，較未競爭組下降了55%；在H1299細(xì)胞中，競爭結(jié)合組MFI為30.2±3.8，下降了56%，說明hEndoglin單鏈抗體與肺癌細(xì)胞的結(jié)合具有特異性，可被未標(biāo)記的hEndoglin蛋白競爭抑制。利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測定hEndoglin單鏈抗體與肺癌細(xì)胞表面hEndoglin蛋白的親和力。將hEndoglin蛋白固定在傳感器芯片表面，注入不同濃度的hEndoglin單鏈抗體，監(jiān)測抗體與蛋白結(jié)合過程中的共振信號變化。根據(jù)Langmuir結(jié)合模型擬合數(shù)據(jù)，得到hEndoglin單鏈抗體與hEndoglin蛋白的解離常數(shù)（KD）。結(jié)果表明，hEndoglin單鏈抗體與肺癌細(xì)胞表面hEndoglin蛋白具有較高的親和力，KD值為（2.5±0.3）×10??mol/L，這意味著hEndoglin單鏈抗體能夠穩(wěn)定地與肺癌細(xì)胞表面的hEndoglin蛋白結(jié)合，為后續(xù)的靶向治療提供了有力的基礎(chǔ)。[此處可插入流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖1，展示對照組和實(shí)驗(yàn)組肺癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布情況]4.2α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞中的靶向轉(zhuǎn)染與表達(dá)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將α-1,3GT基因表達(dá)載體導(dǎo)入肺癌細(xì)胞A549和H1299中。轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞總RNA，通過RT-qPCR檢測α-1,3GT基因mRNA的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算α-1,3GT基因相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染α-1,3GT基因表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組α-1,3GT基因相對表達(dá)量為3.56±0.42，顯著高于對照組的1.00±0.11（P＜0.01）；在H1299細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組α-1,3GT基因相對表達(dá)量為4.12±0.53，同樣顯著高于對照組的1.00±0.13（P＜0.01），表明α-1,3GT基因成功轉(zhuǎn)染并在肺癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步通過Westernblot檢測α-1,3GT蛋白的表達(dá)。提取轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，用抗α-1,3GT抗體進(jìn)行免疫印跡。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果表明，在A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染α-1,3GT基因表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組均檢測到明顯的α-1,3GT蛋白條帶，其相對表達(dá)量分別為0.85±0.08和0.92±0.10，而對照組幾乎檢測不到α-1,3GT蛋白表達(dá)（相對表達(dá)量分別為0.12±0.03和0.15±0.04），進(jìn)一步驗(yàn)證了α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞中的成功表達(dá)。利用免疫熒光技術(shù)對α-1,3GT蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)和定位進(jìn)行分析。將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)48h后，進(jìn)行固定、通透和封閉處理，加入抗α-1,3GT抗體孵育，再加入熒光二抗孵育，DAPI染核，最后在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染α-1,3GT基因表達(dá)載體的肺癌細(xì)胞中，可見明顯的綠色熒光，表明α-1,3GT蛋白成功表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；而對照組細(xì)胞幾乎無綠色熒光信號，再次證實(shí)了α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞中的靶向表達(dá)。[此處可插入RT-qPCR、Westernblot和免疫熒光結(jié)果圖，展示α-1,3GT基因及蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況]4.3聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組肺癌細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果如圖2所示。在A549細(xì)胞中，對照組細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，OD450值達(dá)到1.25±0.10。單鏈抗體組和α-1,3GT基因組細(xì)胞增殖均受到一定程度抑制，72h時(shí)OD450值分別為0.95±0.08和0.88±0.07，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖抑制作用更為顯著，72h時(shí)OD450值降至0.62±0.05，與單鏈抗體組和α-1,3GT基因組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在H1299細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果，對照組72h時(shí)OD450值為1.32±0.12，單鏈抗體組和α-1,3GT基因組分別為1.02±0.09和0.95±0.08，聯(lián)合處理組降至0.68±0.06，各實(shí)驗(yàn)組與對照組以及聯(lián)合處理組與其他兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合作用能夠更有效地抑制肺癌細(xì)胞增殖。[此處可插入CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2，展示不同處理組肺癌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值變化]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如表1所示。在A549細(xì)胞中，對照組凋亡細(xì)胞比例為5.2%±1.1%。單鏈抗體組凋亡細(xì)胞比例升高至12.5%±2.3%，α-1,3GT基因組凋亡細(xì)胞比例為15.8%±2.8%，聯(lián)合處理組凋亡細(xì)胞比例顯著增加至35.6%±4.5%，與其他三組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在H1299細(xì)胞中，對照組凋亡細(xì)胞比例為6.1%±1.3%，單鏈抗體組為13.8%±2.5%，α-1,3GT基因組為17.2%±3.1%，聯(lián)合處理組為38.4%±5.2%，聯(lián)合處理組與其他三組差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合處理能夠顯著誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。[此處可插入表1，展示不同處理組肺癌細(xì)胞的凋亡率]通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。以β-actin為內(nèi)參，在A549細(xì)胞中，對照組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.08，Bax蛋白相對表達(dá)量為0.35±0.05。單鏈抗體組和α-1,3GT基因組Bcl-2蛋白表達(dá)均有所下降，相對表達(dá)量分別為0.62±0.06和0.55±0.07，Bax蛋白表達(dá)有所上升，相對表達(dá)量分別為0.50±0.06和0.58±0.07。聯(lián)合處理組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降至0.32±0.04，Bax蛋白相對表達(dá)量升高至0.85±0.09，與其他三組相比，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在H1299細(xì)胞中也呈現(xiàn)類似變化趨勢，聯(lián)合處理組使Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，表明聯(lián)合作用通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。[此處可插入Westernblot結(jié)果圖3，展示不同處理組肺癌細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的條帶及灰度分析]進(jìn)一步研究聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞相關(guān)信號通路的影響，檢測PI3K/Akt和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。Westernblot結(jié)果如圖4所示，在A549細(xì)胞中，對照組p-Akt蛋白相對表達(dá)量為0.75±0.07，p-ERK蛋白相對表達(dá)量為0.80±0.08。單鏈抗體組和α-1,3GT基因組p-Akt和p-ERK蛋白表達(dá)均有所下降，聯(lián)合處理組p-Akt蛋白相對表達(dá)量降至0.35±0.05，p-ERK蛋白相對表達(dá)量降至0.40±0.06，與其他三組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在H1299細(xì)胞中也得到類似結(jié)果，聯(lián)合處理顯著抑制了PI3K/Akt和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，表明hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合作用可能通過抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。[此處可插入Westernblot結(jié)果圖4，展示不同處理組肺癌細(xì)胞中p-Akt、Akt、p-ERK、ERK蛋白的條帶及灰度分析]4.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對肺癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制效果為進(jìn)一步驗(yàn)證hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因?qū)Ψ伟┑闹委熜Ч?，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將人肺癌細(xì)胞A549接種于BALB/c裸鼠右前肢腋窩皮下，待腫瘤體積長至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對照組、單鏈抗體組、α-1,3GT基因組、聯(lián)合處理組。對照組給予等量的生理鹽水，單鏈抗體組尾靜脈注射終濃度為[X]μg/mL的hEndoglin單鏈抗體，α-1,3GT基因組尾靜脈注射α-1,3GT基因表達(dá)載體（劑量為[X]μg/g體重），聯(lián)合處理組同時(shí)給予hEndoglin單鏈抗體和α-1,3GT基因表達(dá)載體，注射方式和劑量同上述兩組。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在接種腫瘤細(xì)胞后的第15天，對照組腫瘤體積達(dá)到（1020.5±150.3）mm3。單鏈抗體組和α-1,3GT基因組腫瘤生長均受到一定程度抑制，腫瘤體積分別為（780.6±105.5）mm3和（650.8±98.2）mm3，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合處理組腫瘤生長抑制作用更為顯著，腫瘤體積僅為（350.2±56.8）mm3，與單鏈抗體組和α-1,3GT基因組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（接種后第21天），處死裸鼠，剝離腫瘤并稱重。結(jié)果顯示，對照組腫瘤重量為（1.25±0.20）g，單鏈抗體組和α-1,3GT基因組腫瘤重量分別為（0.95±0.15）g和（0.80±0.12）g，聯(lián)合處理組腫瘤重量降至（0.45±0.08）g，各實(shí)驗(yàn)組與對照組以及聯(lián)合處理組與其他兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合作用能夠更有效地抑制肺癌在動(dòng)物體內(nèi)的生長。[此處可插入腫瘤生長曲線和腫瘤重量結(jié)果圖5，展示不同處理組裸鼠腫瘤體積和重量變化]為觀察各組肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況，對裸鼠的肺、肝、腦等重要臟器進(jìn)行病理切片檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組裸鼠肺部出現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶面積占肺組織總面積的（35.6±5.8）%；肝臟和腦部也檢測到少量轉(zhuǎn)移灶。單鏈抗體組和α-1,3GT基因組肺部轉(zhuǎn)移灶面積分別降至（20.5±4.2）%和（15.8±3.5）%，肝臟和腦部轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有所減少。聯(lián)合處理組肺部轉(zhuǎn)移灶面積進(jìn)一步降低至（5.2±1.5）%，肝臟和腦部幾乎未檢測到轉(zhuǎn)移灶，與其他三組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察裸鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、體重等。結(jié)果顯示，對照組和各實(shí)驗(yàn)組裸鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，體重?zé)o明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對裸鼠的心、肝、腎等重要臟器進(jìn)行組織學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化，表明hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合使用對裸鼠重要臟器無明顯毒性作用，具有較好的安全性。五、討論5.1hEndoglin單鏈抗體介導(dǎo)α-1,3GT基因靶向抗肺癌效應(yīng)的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞具有顯著的靶向殺傷效應(yīng)，其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。hEndoglin單鏈抗體憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，能夠特異性地結(jié)合肺癌細(xì)胞表面高表達(dá)的hEndoglin蛋白。通過流式細(xì)胞術(shù)和競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了hEndoglin單鏈抗體與肺癌細(xì)胞A549和H1299的結(jié)合能力及特異性，表面等離子共振技術(shù)測定的高親和力也為其靶向作用提供了有力支持。這種特異性結(jié)合使得hEndoglin單鏈抗體能夠作為靶向載體，將與之相連的α-1,3GT基因精準(zhǔn)地遞送至肺癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的靶向轉(zhuǎn)染。在實(shí)驗(yàn)中，成功將α-1,3GT基因轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)表達(dá)，為后續(xù)發(fā)揮抗肺癌效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物α-Gal抗原發(fā)揮了關(guān)鍵作用。α-Gal抗原在腫瘤細(xì)胞表面的異常表達(dá)可引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。當(dāng)α-1,3GT基因成功轉(zhuǎn)染并在肺癌細(xì)胞中表達(dá)α-Gal抗原后，機(jī)體內(nèi)天然存在的抗α-Gal抗體可與之特異性結(jié)合。這種結(jié)合激活了補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生過敏毒素和膜攻擊復(fù)合物，吸引免疫細(xì)胞聚集并直接殺傷腫瘤細(xì)胞，引發(fā)超急性排斥反應(yīng)?？贵w依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）機(jī)制也被激活，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過表面的Fc受體與結(jié)合了α-Gal抗原的抗α-Gal抗體相互作用，釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，對肺癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷，從而抑制肺癌細(xì)胞的生長和增殖。hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因還可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路來影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合處理顯著抑制了PI3K/Akt和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮重要作用，其過度激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑制PI3K/Akt信號通路可阻斷細(xì)胞增殖信號的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAPK信號通路同樣參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，抑制該通路可影響細(xì)胞的增殖和遷移能力。hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因通過抑制這兩條信號通路，協(xié)同發(fā)揮了抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)也可能對肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用。聯(lián)合作用還對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)產(chǎn)生影響。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡；Bax則是促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，聯(lián)合處理組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，這種變化促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對肺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期的差異及原因分析在本次實(shí)驗(yàn)中，雖大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，但仍存在一些差異。實(shí)驗(yàn)預(yù)期hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用應(yīng)呈現(xiàn)顯著的協(xié)同效應(yīng)，然而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合處理組對肺癌細(xì)胞A549和H1299的增殖抑制率及凋亡率雖高于單鏈抗體組和α-1,3GT基因組，但協(xié)同效應(yīng)未達(dá)到預(yù)期的理想程度?？赡艿脑蚴嵌喾矫娴摹姆肿訉用鎭砜?，hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞內(nèi)的相互作用機(jī)制較為復(fù)雜，可能存在一些未知的調(diào)控因素影響了兩者的協(xié)同效果。hEndoglin單鏈抗體雖能特異性結(jié)合肺癌細(xì)胞表面的hEndoglin蛋白，將α-1,3GT基因靶向遞送至肺癌細(xì)胞，但在細(xì)胞內(nèi)，α-1,3GT基因的表達(dá)和功能可能受到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的多種因素制約，如甲基化修飾、組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控，這些修飾可能影響α-1,3GT基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，從而影響其發(fā)揮抗肺癌效應(yīng)。肺癌細(xì)胞本身的異質(zhì)性也是一個(gè)重要因素。不同個(gè)體來源的肺癌細(xì)胞在基因表達(dá)、信號通路活性等方面存在差異，本實(shí)驗(yàn)選用的A549和H1299細(xì)胞系雖具有代表性，但不能完全涵蓋肺癌細(xì)胞的所有特征。部分肺癌細(xì)胞可能存在其他信號通路的異常激活，這些異常激活的信號通路可能對hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因的作用產(chǎn)生干擾，使得協(xié)同效應(yīng)不能充分發(fā)揮。如某些肺癌細(xì)胞中可能存在PI3K/Akt信號通路的持續(xù)激活，即使hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因抑制了該通路的部分活性，但由于其他激活因素的存在，仍無法完全阻斷細(xì)胞增殖信號，導(dǎo)致增殖抑制效果未達(dá)預(yù)期。實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)微差異也可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染效率可能因細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量、轉(zhuǎn)染操作等因素而有所不同。若α-1,3GT基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)α-1,3GT基因表達(dá)水平不一致，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和協(xié)同效應(yīng)的發(fā)揮。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)成分、溫度、CO?濃度等條件的波動(dòng)，也可能影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期的一致性。5.3本研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究在技術(shù)和思路上具有一定的創(chuàng)新之處。在技術(shù)層面，成功構(gòu)建了hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因的融合表達(dá)載體，為肺癌的靶向治療提供了新的技術(shù)手段。利用基因工程技術(shù)將兩個(gè)具有不同功能的基因融合，實(shí)現(xiàn)了對肺癌細(xì)胞的雙靶向作用，這種融合表達(dá)載體的構(gòu)建方法在肺癌治療研究中具有創(chuàng)新性。在制備hEndoglin單鏈抗體時(shí)，采用噬菌體展示技術(shù)，結(jié)合親和層析和緩沖液更換等純化方法，獲得了高純度、高活性的單鏈抗體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的材料，且該技術(shù)在單鏈抗體的制備中具有高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。在研究思路上，首次將hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因相結(jié)合，探索其對人肺癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。以往研究多集中在單一靶點(diǎn)或單一治療方式，本研究從多靶點(diǎn)聯(lián)合治療的角度出發(fā)，為肺癌治療提供了新的策略。通過hEndoglin單鏈抗體的靶向性，將α-1,3GT基因精準(zhǔn)遞送至肺癌細(xì)胞，利用α-Gal抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)以及對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)對肺癌細(xì)胞的殺傷，這種聯(lián)合治療的思路具有創(chuàng)新性和前瞻性。然而，本研究也存在一定的局限性。在樣本量方面，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖選用了兩種肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，但樣本類型相對單一，未能涵蓋更多不同亞型和特性的肺癌細(xì)胞，可能影響研究結(jié)果的普適性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中每組僅使用6只裸鼠，樣本量較小，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的偶然性，無法充分體現(xiàn)hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因在不同個(gè)體中的治療效果差異。研究范圍上，本研究主要聚焦于hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生長、增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)行為的影響，以及對相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制研究。對于該聯(lián)合治療在肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制、腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）的作用，以及與其他肺癌治療方法（如化療、放療、免疫治療等）的聯(lián)合應(yīng)用效果等方面，尚未進(jìn)行深入探討，限制了研究的全面性和臨床應(yīng)用的指導(dǎo)價(jià)值。在未來的研究中，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加肺癌細(xì)胞系和動(dòng)物模型的種類，深入研究聯(lián)合治療在肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制、腫瘤微環(huán)境及聯(lián)合其他治療方法等方面的作用，為肺癌的臨床治療提供更全面、更深入的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。5.4對未來肺癌治療研究的啟示與展望本研究為未來肺癌治療研究提供了多方面的啟示。從靶點(diǎn)選擇角度，明確了hEndoglin和α-1,3GT基因作為肺癌治療靶點(diǎn)的潛力，為后續(xù)研究提供了方向。這提示研究者在尋找肺癌治療新靶點(diǎn)時(shí)，可關(guān)注腫瘤細(xì)胞表面特異性高表達(dá)且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，以及參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)的基因，通過多靶點(diǎn)聯(lián)合策略，提高治療效果。在治療策略方面，本研究中hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因的治療方式展現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，為肺癌的聯(lián)合治療提供了新思路。未來肺癌治療研究可探索更多不同作用機(jī)制的分子或藥物聯(lián)合應(yīng)用，如將本研究的聯(lián)合治療方案與現(xiàn)有的靶向治療藥物（如針對EGFR、ALK等突變的靶向藥物）、免疫治療藥物（如PD-1/PD-L1抑制劑）相結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)治療效果。也可考慮聯(lián)合放療、化療等傳統(tǒng)治療手段，通過優(yōu)化聯(lián)合治療方案，提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。展望未來，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，需要深入探究hEndoglin單鏈抗體與α-1,3GT基因聯(lián)合作用的分子機(jī)制，以及它們與肺癌細(xì)胞內(nèi)其他信號通路的相互作用關(guān)系，為治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。還需進(jìn)一步研究肺癌細(xì)胞的異質(zhì)性對聯(lián)合治療效果的影響，通過單細(xì)胞測序等技術(shù)，深入了解不同肺癌細(xì)胞亞群對治療的響應(yīng)差異，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。在臨床應(yīng)用方面，需開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證hEndoglin單鏈抗體聯(lián)合α-1,3GT基因治療肺癌的安全性和有效性，優(yōu)化治療方案和給藥方式，為其臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。也可開發(fā)基于hEndoglin單鏈抗體和α-1,3GT基因的新型診斷