miRNA在病毒傳染性疾病中的調(diào)控與診斷價值研究一、引言1.1研究背景病毒傳染性疾病一直是威脅人類健康的重要因素，其具有傳播速度快、范圍廣、危害大等特點，給全球公共衛(wèi)生帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。例如，自2020年初爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情，迅速在全球范圍內(nèi)蔓延，對人類的生命健康、社會經(jīng)濟和生活秩序造成了巨大沖擊。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，截至2024年，全球累計確診病例已達數(shù)億人，死亡人數(shù)也達到了數(shù)百萬之多。此外，流感病毒每年也會在全球范圍內(nèi)引發(fā)季節(jié)性流感，導(dǎo)致大量的門診和住院病例，給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了沉重負擔(dān)。除了這些近期的疫情，像艾滋病、乙肝、丙肝等慢性病毒感染性疾病，長期以來也嚴重威脅著人類健康，影響著患者的生活質(zhì)量和壽命。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長度約為22個核苷酸，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，隨著對miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在病毒感染過程中扮演著重要角色。miRNA可以通過與病毒基因組或宿主基因的互補配對，調(diào)控病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，影響病毒感染的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。例如，在HIV-1感染中，宿主細胞內(nèi)的某些miRNA可以直接靶向HIV-1的基因組，抑制其復(fù)制；而HIV-1也可以編碼一些miRNA，反過來調(diào)控宿主細胞的功能，為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。在乙肝病毒（HBV）感染中，miRNA參與了病毒與宿主細胞之間的相互作用，影響著病毒的感染效率、肝細胞的損傷以及肝癌的發(fā)生發(fā)展。研究病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能，有助于深入理解病毒感染的分子機制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。miRNA在病毒傳染性疾病的診斷方面也展現(xiàn)出了巨大的潛力。由于miRNA在血清、血漿、唾液等生物體液中具有良好的穩(wěn)定性，且其表達水平在病毒感染后會發(fā)生顯著變化，因此可以作為潛在的生物標志物用于疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估。例如，在丙肝病毒（HCV）感染中，血清中的某些miRNA表達水平與HCV的載量、肝臟炎癥程度以及疾病的進展密切相關(guān)，通過檢測這些miRNA的表達水平，可以輔助臨床醫(yī)生進行疾病的診斷和治療決策。研究miRNA在病毒傳染性疾病中的診斷效能，對于提高疾病的早期診斷率、改善患者的治療效果具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能及診斷效能，具體研究目的如下：揭示miRNA在病毒感染過程中的調(diào)控機制：通過對不同病毒傳染性疾病模型的研究，分析miRNA與病毒基因及宿主基因之間的相互作用，明確miRNA在病毒吸附、入侵、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等各個階段的調(diào)控作用，為深入理解病毒感染的分子機制提供理論依據(jù)。篩選和鑒定與病毒傳染性疾病相關(guān)的特異性miRNA標志物：利用高通量測序、芯片技術(shù)等手段，對病毒感染患者和健康人群的生物體液（如血清、血漿、唾液等）及組織樣本中的miRNA表達譜進行分析，篩選出在病毒感染后表達發(fā)生顯著變化且具有特異性的miRNA，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估提供潛在的生物標志物。評估m(xù)iRNA作為診斷標志物的效能：通過對篩選出的特異性miRNA進行大樣本的臨床驗證，結(jié)合受試者工作特征曲線（ROC曲線）、靈敏度、特異性等指標，評估其在病毒傳染性疾病診斷中的準確性、可靠性和實用性，為開發(fā)基于miRNA的新型診斷方法提供科學(xué)依據(jù)。探索基于miRNA的治療策略：根據(jù)miRNA的調(diào)控功能和作用機制，設(shè)計和開發(fā)針對病毒傳染性疾病的miRNA干預(yù)策略，如miRNA模擬物、抑制劑、納米載體等，通過體外細胞實驗和動物模型驗證其治療效果，為病毒傳染性疾病的治療提供新的思路和方法。本研究具有重要的理論意義和實踐意義：理論意義：深入研究病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能，有助于揭示病毒與宿主之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，豐富和完善病毒感染的分子生物學(xué)理論，為進一步理解病毒致病機制和宿主免疫防御機制提供新的視角和理論基礎(chǔ)。實踐意義：篩選和鑒定出的特異性miRNA標志物，可用于開發(fā)新型的病毒傳染性疾病診斷方法，提高疾病的早期診斷率和準確性，為臨床治療爭取寶貴的時間?；趍iRNA的治療策略的探索，有望為病毒傳染性疾病的治療提供新的手段和方法，改善患者的治療效果和預(yù)后，降低疾病的發(fā)病率和死亡率，減輕社會和家庭的負擔(dān)。此外，本研究成果還可為公共衛(wèi)生防控提供科學(xué)依據(jù)，有助于制定更加有效的防控策略，保障人類健康和社會穩(wěn)定。二、miRNA的基礎(chǔ)理論2.1miRNA的概述微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約為22個核苷酸（少數(shù)情況下，長度范圍可在19-25個核苷酸之間波動）的非編碼單鏈小RNA分子。1993年，維克托?安布羅斯（VictorAmbros）和加里?魯夫昆（GaryRuvkun）在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA——lin-4，為揭開miRNA神秘的面紗拉開了序幕，也開啟了非編碼RNA研究的新領(lǐng)域。2024年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予這兩位科學(xué)家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)miRNA及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用。miRNA主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）進行堿基互補配對，進而抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達。這種調(diào)控作用主要通過兩種方式實現(xiàn)：一是當miRNA與靶mRNA不完全互補配對時，主要抑制靶mRNA的翻譯過程，使得蛋白質(zhì)合成受阻，這在哺乳動物中是較為普遍的作用方式；二是若miRNA與靶mRNA幾乎完全互補配對，那么則會引起靶mRNA的降解，植物中多以此種方式為主。miRNA在真核生物中廣泛存在，從低等的線蟲、果蠅到高等的哺乳動物，乃至植物，都能找到miRNA的身影，體現(xiàn)了其在生物進化過程中的高度保守性。以人類為例，根據(jù)miRBase的最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，已發(fā)現(xiàn)的人類miRNA前體有1982條，成熟miRNA有2694條。它們參與了生物體內(nèi)眾多關(guān)鍵的生理過程，如胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡、代謝調(diào)節(jié)等。在胚胎發(fā)育過程中，特定的miRNA表達模式能夠調(diào)控細胞的分化方向和組織器官的形成；在細胞增殖與凋亡的平衡維持中，miRNA也發(fā)揮著不可或缺的作用，一旦其調(diào)控失衡，就可能引發(fā)疾病，如癌癥等。這一系列研究成果充分表明了miRNA在生物體內(nèi)的普遍性和重要性，也凸顯了深入研究miRNA的必要性和迫切性。2.2miRNA的生物合成與基因調(diào)控機制miRNA的生物合成是一個復(fù)雜且精細的過程，主要可分為三個階段。第一階段，在細胞核中，RNA聚合酶Ⅱ作用于miRNA轉(zhuǎn)錄基因，轉(zhuǎn)錄生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA長度可達幾千個核苷酸，除了包含成熟miRNA的序列外，還帶有5’帽子結(jié)構(gòu)（5'cap）及3'多聚腺苷酸尾（3'PolyA）。例如，在人類細胞中，許多miRNA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近存在典型的RNA聚合酶Ⅱ啟動子元件，像TATA盒等，這些元件能夠精確地引導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ與miRNA基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄過程，生成pri-miRNA。第二階段，pri-miRNA在細胞核內(nèi)被核糖核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的Microprocessor復(fù)合物識別并切割。Drosha是一種Ⅲ型核糖核酸酶，它能夠精準地對pri-miRNA進行切割，將其加工成長約60-70nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。這一切割過程是高度特異性的，Drosha通過識別pri-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的特定序列和結(jié)構(gòu)特征，在特定位置進行切割，從而保證生成正確長度和結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。研究表明，pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、雙鏈區(qū)長度、單鏈旁側(cè)區(qū)以及單鏈末端環(huán)等特征，都會影響Drosha對pri-miRNA的切割效率和準確性。比如，當pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)長度在一定范圍內(nèi)時，Drosha的切割效率較高；若雙鏈區(qū)長度異常，可能會導(dǎo)致切割效率降低，甚至無法正常切割。第三階段，pre-miRNA在核內(nèi)蛋白載體Exportin-5及其協(xié)同蛋白Ran-GTP的作用下，被運送至細胞質(zhì)中。Exportin-5能夠特異性地識別pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在Ran-GTP提供能量的情況下，將pre-miRNA從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。進入細胞質(zhì)后，pre-miRNA被另一種Ⅲ型核糖核酸酶Dicer識別并進一步切割。Dicer酶可以和兩個相關(guān)的蛋白TRBP（transactivationresponseRNAbindingprotein）和PACT（proteinactivatoroftheinteraction，也有被稱為PRKRA）相互作用。雖然TRBP和PACT對Dicer酶的活性沒有直接影響，但它們會影響miRNA的功能，不過具體的分子機制目前尚不清楚。Dicer將pre-miRNA切割為長度約22nt的雙鏈miRNA，隨后雙鏈miRNA與Argonaute（Ago）蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，兩條RNA鏈中的一條鏈保持與Ago蛋白結(jié)合，這條鏈即為成熟的miRNA（有時也被稱為導(dǎo)向鏈，guidestrand），另一條鏈（有時也被稱為過客鏈，passengerstrand或者用miRNA*表示）則被降解，最終產(chǎn)生具有活性的成熟miRNA復(fù)合物，通過識別與之配對的mRNA發(fā)揮對靶基因的調(diào)控功能。成熟miRNA主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）進行堿基互補配對來實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。根據(jù)結(jié)合方式的不同，相應(yīng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)也有所不同。當miRNA與靶mRNA不完全互補配對時，主要抑制靶mRNA的翻譯過程，使得蛋白質(zhì)合成受阻，這在哺乳動物中是較為普遍的作用方式。具體來說，miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，或者干擾翻譯起始后的延長階段，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞增殖過程中，某些miRNA可以通過與相關(guān)靶mRNA的不完全互補配對，抑制細胞增殖相關(guān)蛋白的合成，進而調(diào)控細胞的增殖速率。當miRNA與靶mRNA幾乎完全互補配對時，那么則會引起靶mRNA的降解，這種方式在植物中較為常見。例如，在植物應(yīng)對逆境脅迫時，一些miRNA能夠與逆境相關(guān)的靶mRNA完全互補配對，促使靶mRNA被降解，從而調(diào)節(jié)植物的生理反應(yīng)，增強植物對逆境的適應(yīng)能力。此外，miRNA對基因表達的調(diào)控并非是簡單的一對一關(guān)系，而是呈現(xiàn)出復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式。一個miRNA可以同時調(diào)控多個靶mRNA，而一個靶mRNA也可能受到多個miRNA的調(diào)控。這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠在細胞內(nèi)精細地調(diào)節(jié)基因的表達，參與細胞的分化、增殖、凋亡、代謝調(diào)節(jié)等多種生理過程。三、miRNA在病毒傳染性疾病中的調(diào)控功能3.1miRNA對病毒感染進程的調(diào)控3.1.1以流感病毒H7N9為例的研究H7N9禽流感病毒作為一種能夠感染人類的高致病性病毒，自2013年首次在中國人群中被發(fā)現(xiàn)并導(dǎo)致死亡病例以來，引起了全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。其高變異性和易迅速傳播的特點，使得對其感染機理和免疫應(yīng)答過程的研究顯得尤為重要。HA蛋白作為H7N9禽流感病毒的重要組成部分，在病毒感染進程中扮演著關(guān)鍵角色，它具有決定病毒侵襲細胞的能力，與免疫細胞之間的相互作用及其機理對于免疫應(yīng)答的調(diào)控有著重要的影響。在小鼠機體實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)，當向小鼠體內(nèi)免疫HA蛋白后，小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著增加。胸腺和脾臟作為機體重要的免疫器官，其系數(shù)的增加表明機體的免疫反應(yīng)被激活，HA蛋白能夠促使小鼠機體產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答，這也意味著機體在應(yīng)對病毒感染時，免疫系統(tǒng)做出了積極的反應(yīng)，試圖抵御病毒的入侵。在體外實驗中，直接向原代培養(yǎng)的小鼠淋巴細胞中添加HA蛋白，結(jié)果顯示淋巴細胞增殖顯著增加。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其增殖能力的增強進一步證實了HA蛋白能夠促進機體的免疫反應(yīng)，為后續(xù)研究病毒感染過程中免疫系統(tǒng)的變化提供了重要的實驗依據(jù)。THP-1細胞是一種常用于研究免疫反應(yīng)和炎癥機制的細胞系。當HA蛋白作用于THP-1細胞時，在不同時間點和不同濃度梯度下，均出現(xiàn)了炎癥因子IL-1α和IL-6表達顯著上調(diào)的現(xiàn)象。IL-1α和IL-6作為重要的炎癥因子，它們的上調(diào)表明HA蛋白能夠誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。IL-1α可以激活免疫細胞，促進炎癥介質(zhì)的釋放，在炎癥反應(yīng)的起始階段發(fā)揮重要作用；IL-6則參與了免疫細胞的活化、增殖和分化，同時也與發(fā)熱、急性期反應(yīng)等炎癥相關(guān)過程密切相關(guān)。IL-1β呈微弱上調(diào)趨勢，而TNF-α未見明顯的變化。這說明HA蛋白對不同炎癥因子的調(diào)控作用存在差異，可能通過不同的信號通路來調(diào)節(jié)炎癥因子的表達。為了進一步了解HA的促炎效應(yīng)，研究人員將HA(100ng/ml)與細菌內(nèi)毒素LPS(1ng/ml)協(xié)同刺激THP-1細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HA與LPS在一定程度上具有協(xié)同促進炎癥因子IL-1α、IL-1β和IL-6表達的作用。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是一種強致炎因子，能夠激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)。HA與LPS的協(xié)同作用表明，在病毒感染過程中，當機體同時受到病毒和細菌等病原體的刺激時，炎癥反應(yīng)可能會進一步加劇，這對于理解病毒感染合并細菌感染時的病情加重機制具有重要意義。在對HA所致炎癥過程的作用機理研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，Let-7e在THP-1細胞內(nèi)的表達顯著上升，而上清中的豐度顯著下降。Let-7e作為一種miRNA，在細胞內(nèi)和上清中的表達變化暗示其可能參與了HA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)控。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默TLR4的表達后，與NC對照組相比，炎癥因子IL-1α、IL-6和TNF-α的表達下調(diào)，而細胞內(nèi)外Let-7e的表達逆轉(zhuǎn)，炎癥反應(yīng)得到一定的緩解。TLR4是Toll樣受體家族的重要成員，是一種模式識別受體，能夠識別病原體相關(guān)分子模式，激活下游信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)。這一實驗結(jié)果表明，在HA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，HA可能通過TLR4途徑促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而Let-7e可能作為抑炎因子，在HA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達來抑制炎癥反應(yīng)的過度激活，維持機體的免疫平衡。3.1.2登革病毒及寨卡病毒感染中的miRNA作用登革病毒和寨卡病毒均屬于黃病毒屬，主要通過伊蚊叮咬傳播，給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大挑戰(zhàn)。據(jù)統(tǒng)計，有100余種人類病原體可由蚊蟲等吸血節(jié)肢動物攜帶并傳播，其引發(fā)的疾病約占人類傳染病總數(shù)的五分之一。伊蚊作為這兩種病毒的主要傳播媒介，可通過吸血從感染宿主體內(nèi)獲取病毒。蚊蟲吸血后，感染者的血液被快速消化，與此同時，被攝入的病毒感染蚊蟲腸道上皮細胞，擴散進入蚊蟲體腔并使蚊蟲具備傳播病毒的能力。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院程功教授團隊的研究為我們揭示了人血來源miRNA在蚊蟲感染傳播登革病毒及寨卡病毒過程中的重要調(diào)控機制。通過smallnon-codingRNA深度測序技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)吸血后有多個人源miRNA可在蚊蟲體內(nèi)穩(wěn)定存在。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究人源miRNA對蚊蟲感染病毒的影響奠定了基礎(chǔ)，表明人源miRNA可能在蚊蟲與病毒的相互作用中發(fā)揮著某種作用。經(jīng)過進一步篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)一種血源高豐度miRNA——hsa-miR-150-5p，其能夠顯著促進病毒感染蚊蟲。為了探究其作用機制，研究人員深入研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-150-5p可進入蚊蟲細胞，并通過跨物種基因調(diào)控方式抑制蚊蟲抗病毒基因表達。在正常情況下，蚊蟲體內(nèi)的抗病毒基因能夠發(fā)揮作用，抵御病毒的入侵和感染。然而，當hsa-miR-150-5p進入蚊蟲細胞后，它能夠與蚊蟲抗病毒基因的mRNA結(jié)合，通過RNA干擾機制，抑制抗病毒基因的翻譯過程，使得抗病毒蛋白無法正常合成，從而降低了蚊蟲自身的抗病毒能力，為病毒在蚊蟲體內(nèi)的感染和傳播創(chuàng)造了有利條件，促進了蚊蟲在吸血過程中感染病毒。生物信息學(xué)分析顯示，hsa-miR-150-5p在哺乳動物中高度保守。這意味著hsa-miR-150-5p在不同哺乳動物物種中具有相似的序列和功能，暗示其在進化過程中可能承擔(dān)著重要的生物學(xué)作用。吸血節(jié)肢動物中普遍存在可被miR-150-5p靶向調(diào)控的抗病毒基因。這一發(fā)現(xiàn)提示miR-150-5p介導(dǎo)的跨物種調(diào)控機制可能是一種節(jié)肢動物吸血并感染病毒的廣譜機制。也就是說，不僅在登革病毒和寨卡病毒感染蚊蟲的過程中，在其他吸血節(jié)肢動物感染病毒的過程中，hsa-miR-150-5p可能也通過類似的機制發(fā)揮作用，這為我們深入理解病毒在自然界中的傳播機制提供了新的視角，也為開發(fā)針對蚊媒病毒傳播的防控策略提供了重要的理論依據(jù)。3.2miRNA對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控3.2.1激活免疫細胞相關(guān)信號通路在病毒感染過程中，miRNA能夠通過多種機制激活免疫細胞相關(guān)信號通路，從而增強免疫細胞的活性，對病毒清除和免疫反應(yīng)產(chǎn)生重要影響。以Toll樣受體（TLR）信號通路為例，TLR是一類重要的模式識別受體，能夠識別病毒等病原體相關(guān)分子模式，激活下游信號傳導(dǎo)，啟動免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在TLR信號通路的激活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當機體受到病毒感染時，TLR被激活，進而誘導(dǎo)miR-155的表達上調(diào)。miR-155通過靶向抑制SHIP1（Srchomology2domain-containinginositol5-phosphatase1）的表達，SHIP1是一種負調(diào)控因子，它的表達被抑制后，會解除對PI3K（phosphatidylinositol3-kinase）/AKT信號通路的抑制，從而激活該信號通路。PI3K/AKT信號通路的激活能夠促進免疫細胞的增殖、分化和存活，增強免疫細胞的活性，使其更好地發(fā)揮抗病毒免疫作用。此外，miR-155還可以通過靶向其他分子，如SOCS1（suppressorofcytokinesignaling1）等，進一步調(diào)節(jié)TLR信號通路，促進免疫細胞的活化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在天然免疫細胞中，如巨噬細胞和樹突狀細胞，miRNA對免疫細胞信號通路的激活也起著重要作用。巨噬細胞是機體抵御病毒感染的重要防線之一，當巨噬細胞受到病毒感染時，細胞內(nèi)的miRNA表達譜會發(fā)生顯著變化。例如，miR-21可以通過靶向抑制PTEN（phosphataseandtensinhomolog）的表達，激活PI3K/AKT信號通路，促進巨噬細胞的吞噬作用和炎癥因子的分泌。PTEN是一種腫瘤抑制基因，同時也是PI3K/AKT信號通路的負調(diào)控因子，miR-21對PTEN的抑制作用能夠增強PI3K/AKT信號通路的活性，從而增強巨噬細胞的免疫功能。樹突狀細胞是一種重要的抗原呈遞細胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。研究表明，miR-146a在樹突狀細胞中參與了對TLR信號通路的負反饋調(diào)節(jié)。當樹突狀細胞受到病毒感染時，TLR信號通路被激活，誘導(dǎo)miR-146a的表達上調(diào)。miR-146a通過靶向抑制IRAK1（interleukin-1receptor-associatedkinase1）和TRAF6（TNFreceptor-associatedfactor6）等分子的表達，抑制TLR信號通路的過度激活，避免免疫反應(yīng)的過度損傷。然而，在某些情況下，病毒也可以利用miRNA來逃避宿主的免疫監(jiān)視。例如，乙肝病毒（HBV）可以編碼一種miRNA，即miR-H1，它能夠靶向抑制TRAF3（TNFreceptor-associatedfactor3）的表達，阻斷TBK1（TANK-bindingkinase1）-IRF3（interferonregulatoryfactor3）信號通路的激活，從而抑制干擾素的產(chǎn)生，降低宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。這表明miRNA在病毒感染過程中對免疫細胞信號通路的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，既可以促進免疫反應(yīng)，也可能被病毒利用來逃避免疫監(jiān)視。3.2.2調(diào)節(jié)免疫因子的表達免疫因子在病毒感染進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們參與了免疫細胞的活化、增殖、分化以及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等過程。miRNA能夠通過對免疫因子表達的精細調(diào)節(jié)，深刻影響病毒感染的進程。以流感病毒感染為例，研究表明，在流感病毒感染宿主細胞后，宿主細胞內(nèi)的miR-29家族成員的表達會發(fā)生顯著變化。miR-29a、miR-29b和miR-29c等通過靶向作用于Ⅰ型干擾素（IFN）信號通路中的關(guān)鍵分子，如IFN-α、IFN-β及其受體IFNAR1等，對IFN的表達進行調(diào)控。當miR-29家族成員表達上調(diào)時，它們能夠與IFN-α、IFN-β及其受體IFNAR1的mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對，抑制這些分子的翻譯過程，從而降低IFN的表達水平。IFN作為一種重要的免疫因子，具有強大的抗病毒作用，它能夠誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白，抑制病毒的復(fù)制和傳播。miR-29對IFN表達的抑制作用，會削弱宿主細胞的抗病毒能力，使得流感病毒在宿主細胞內(nèi)更容易復(fù)制和擴散，進而加重病毒感染的病情。相反，當miR-29家族成員表達下調(diào)時，IFN的表達水平會相應(yīng)升高，增強宿主細胞的抗病毒能力，有利于宿主對流感病毒的清除。在乙肝病毒（HBV）感染中，miRNA對免疫因子的調(diào)節(jié)也十分關(guān)鍵。HBV感染會導(dǎo)致宿主肝臟組織中miR-122的表達發(fā)生改變。miR-122是一種在肝臟中高表達的miRNA，它與HBV的復(fù)制和感染密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122可以通過與HBV基因組的特定區(qū)域結(jié)合，促進HBV的復(fù)制。同時，miR-122還能夠調(diào)節(jié)免疫因子的表達，影響肝臟的免疫微環(huán)境。具體來說，miR-122可以靶向抑制某些免疫調(diào)節(jié)因子的表達，如TGF-β（transforminggrowthfactor-β）等。TGF-β是一種具有免疫抑制作用的細胞因子，它能夠抑制免疫細胞的活化和增殖，降低機體的免疫反應(yīng)。miR-122對TGF-β表達的抑制作用，會減弱TGF-β的免疫抑制效應(yīng)，增強肝臟局部的免疫反應(yīng)，有利于機體對HBV的免疫清除。然而，過度的免疫反應(yīng)也可能導(dǎo)致肝臟組織的損傷，引發(fā)炎癥和纖維化等病理變化。這表明miRNA對免疫因子的調(diào)節(jié)在病毒感染過程中是一把雙刃劍，既可以促進免疫反應(yīng)，有利于病毒的清除，也可能導(dǎo)致免疫病理損傷。四、miRNA在病毒傳染性疾病中的診斷效能研究4.1miRNA作為診斷標志物的優(yōu)勢在病毒傳染性疾病的診斷領(lǐng)域，尋找高效、準確的診斷標志物一直是研究的重點。miRNA作為一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，憑借其獨特的生物學(xué)特性，在病毒傳染性疾病診斷中展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估提供了新的思路和方法。miRNA具有出色的穩(wěn)定性，這是其作為診斷標志物的重要優(yōu)勢之一。在血清、血漿、唾液等多種生物體液中，miRNA能夠在不同的環(huán)境條件下保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。研究表明，即使在反復(fù)凍融、pH值改變以及存在DNA和RNA裂解酶的情況下，miRNA仍不易降解。在對流感病毒感染患者的血清樣本進行多次凍融處理后，通過定量RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，血清中與流感病毒感染相關(guān)的miRNA表達水平并未發(fā)生明顯變化，依然能夠準確反映病毒感染的情況。這一特性使得miRNA在樣本采集、運輸和儲存過程中，能夠有效地保持其完整性和生物學(xué)活性，為后續(xù)的檢測和分析提供了可靠的保障。miRNA在病毒傳染性疾病中表現(xiàn)出高度的特異性。不同病毒感染會引發(fā)宿主細胞內(nèi)特定的miRNA表達譜變化，這些變化具有明顯的病毒特異性。以乙肝病毒（HBV）感染為例，研究發(fā)現(xiàn)HBV感染患者血清中miR-122、miR-192等miRNA的表達水平與健康人群相比存在顯著差異。通過對大量HBV感染患者和健康對照人群的樣本分析，發(fā)現(xiàn)miR-122在HBV感染患者血清中的表達上調(diào)，而在健康人群中表達水平較低，這種特異性的表達變化使得miR-122成為HBV感染診斷的潛在特異性標志物。在丙肝病毒（HCV）感染中，血清中的miR-122、miR-196a等miRNA也呈現(xiàn)出與HCV感染相關(guān)的特異性表達模式。這種特異性的miRNA表達譜變化，為病毒傳染性疾病的精準診斷提供了有力的依據(jù)，能夠幫助臨床醫(yī)生準確地區(qū)分不同病毒感染，避免誤診和漏診。miRNA對病毒傳染性疾病的檢測具有較高的靈敏度。由于miRNA在病毒感染后會迅速發(fā)生表達變化，且在生物體液中的含量能夠隨著病毒感染的進程而動態(tài)變化，因此可以作為早期診斷和病情監(jiān)測的敏感指標。在流感病毒感染的早期階段，通過檢測血清中特定miRNA的表達水平，能夠在患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀之前，就發(fā)現(xiàn)病毒感染的跡象。研究表明，在流感病毒感染后的24小時內(nèi)，血清中某些miRNA的表達水平就會發(fā)生顯著變化。通過對這些miRNA的檢測，可以實現(xiàn)對流感病毒感染的早期診斷，為及時采取治療措施提供寶貴的時間。在疾病的病情監(jiān)測方面，miRNA的表達水平與病毒載量、疾病的嚴重程度等密切相關(guān)。以艾滋病病毒（HIV）感染為例，隨著HIV載量的增加，患者血清中某些miRNA的表達水平也會相應(yīng)升高。通過動態(tài)監(jiān)測這些miRNA的表達水平，能夠?qū)崟r了解疾病的進展情況，為臨床治療方案的調(diào)整提供科學(xué)依據(jù)。miRNA在生物體液中的廣泛存在也是其作為診斷標志物的一大優(yōu)勢。血清、血漿、唾液、尿液等生物體液中都能檢測到miRNA的存在，這使得樣本采集更加方便、無創(chuàng)。對于一些需要頻繁進行疾病監(jiān)測的患者來說，采集唾液或尿液樣本進行miRNA檢測，不僅操作簡便，而且患者的接受度高。在流感病毒感染的診斷中，通過采集患者的唾液樣本，檢測其中與流感病毒感染相關(guān)的miRNA表達水平，就能夠初步判斷患者是否感染了流感病毒。這種無創(chuàng)、便捷的樣本采集方式，有利于大規(guī)模的疾病篩查和早期診斷，能夠提高疾病的防控效率。miRNA作為病毒傳染性疾病的診斷標志物，具有穩(wěn)定性好、特異性高、靈敏度高以及樣本采集方便等諸多優(yōu)勢。這些優(yōu)勢使得miRNA在病毒傳染性疾病的診斷領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，有望成為新一代的病毒傳染性疾病診斷標志物，為臨床診斷和治療提供更加準確、高效的支持。4.2實驗研究：HCV患者血清中miRNA異常表達譜及診斷潛能4.2.1研究方法與過程本研究旨在全面探究HCV患者血清中miRNA的異常表達譜及其診斷潛能，通過嚴謹且科學(xué)的研究方法，確保研究結(jié)果的準確性和可靠性。樣本收集是研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，具有重要意義。我們精心收集了2013年1月至2013年9月期間珠江醫(yī)院未經(jīng)治療的HCV患者血清樣本，并將其妥善保存于-70℃環(huán)境中，以最大程度地保持樣本的生物學(xué)特性。為了保證樣本的代表性，我們嚴格篩選樣本，最終挑選出高豐度HCV-RNA（HCV-RNA≥105IU/ml）的血清樣本集合池，用于后續(xù)的miRNAPCR芯片篩查。同時，我們還選取了68例血清樣本，其中包括39例HCV-RNA陽性（HCV-RNA≥5×102IU/ml）樣本和29例正常對照樣本，用于對特定miRNA表達豐度的驗證以及診斷潛能的分析。miRNA芯片篩查是發(fā)現(xiàn)潛在miRNA標志物的關(guān)鍵步驟。我們采用miRNAPCR芯片技術(shù)，對高豐度HCV-RNA血清樣本集合池中768個miRNA的表達進行了全面篩查。通過這種高通量的檢測方法，我們能夠快速、準確地獲取大量miRNA的表達信息，從而初步篩選出在HCV患者血清中表達異常的miRNA。在篩查過程中，我們嚴格按照芯片操作說明書進行實驗，確保實驗條件的一致性和穩(wěn)定性，以減少實驗誤差。為了進一步驗證芯片篩查結(jié)果的準確性，我們采用了miRNAPCR技術(shù)。針對芯片篩查中發(fā)現(xiàn)的hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p這4種miRNA，在68例血清樣本中進行了相對表達豐度的驗證。在實驗過程中，我們首先提取血清樣本中的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將miRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄過程中，我們根據(jù)所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，準確配置反應(yīng)體系，包括適量的RNA模板、反轉(zhuǎn)錄酶、引物及反應(yīng)緩沖液。設(shè)置合適的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度和時間，通常為37℃反應(yīng)1小時，以確保cDNA的高效合成。合成的cDNA保存于-20℃，避免反復(fù)凍融，以保證其質(zhì)量和穩(wěn)定性。接著，我們以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。引物設(shè)計至關(guān)重要，我們通過在線工具進行引物設(shè)計，確保引物的特異性和擴增效率。在PCR反應(yīng)體系中，我們加入適量的cDNA模板、qPCRMasterMix、特異性引物及熒光染料（如SYBRGreen）。通過梯度PCR確定最佳的退火溫度和擴增循環(huán)數(shù)，以優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，提高擴增的特異性和靈敏度。在PCR擴增過程中，我們嚴格遵循操作規(guī)程，實時監(jiān)測熒光信號的變化，確保實驗結(jié)果的可靠性。為了評估篩選出的miRNA在HCV診斷中的價值，我們利用受試者工作特征曲線（ROC曲線）對其診斷潛能進行了深入分析。通過計算miRNA的靈敏度、特異性、曲線下面積（AUC）等指標，我們能夠客觀地評價miRNA對HCV感染的診斷效能。在繪制ROC曲線時，我們以miRNA的表達水平為變量，以HCV感染狀態(tài)為分類標準，利用統(tǒng)計軟件繪制曲線，并計算相關(guān)指標。通過對不同miRNA的ROC曲線分析，我們可以比較它們在診斷HCV感染中的優(yōu)劣，從而篩選出具有較高診斷價值的miRNA。通過樣本收集、miRNA芯片篩查、PCR驗證及ROC曲線分析等一系列嚴謹?shù)难芯糠椒?，我們能夠系統(tǒng)地探究HCV患者血清中miRNA的異常表達譜及其診斷潛能，為HCV的早期診斷和治療提供有力的理論依據(jù)和技術(shù)支持。4.2.2研究結(jié)果與分析通過上述研究方法，我們獲得了一系列關(guān)于HCV患者血清中miRNA異常表達譜及診斷潛能的重要結(jié)果。在miRNAPCR芯片篩查HCV患者血清中miRNA的異常表達譜時，我們發(fā)現(xiàn)符合條件的miRNA共有106條，其中表達上調(diào)的有51條，下調(diào)的有55條。這一結(jié)果表明，HCV感染會導(dǎo)致患者血清中miRNA表達譜發(fā)生顯著變化，這些異常表達的miRNA可能在HCV感染的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。這些異常表達的miRNA可能參與了HCV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，或者通過調(diào)控宿主細胞的基因表達，影響宿主的免疫反應(yīng)和肝臟功能。例如，某些上調(diào)的miRNA可能促進HCV的復(fù)制，而下調(diào)的miRNA可能減弱宿主的免疫防御機制，從而有利于病毒的生存和繁殖。在單個PCR驗證結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p在HCV感染血清中的表達均上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。這進一步證實了芯片篩查結(jié)果的可靠性，同時也表明這4種miRNA與HCV感染密切相關(guān)。hsa-miR-122在肝臟中高表達，且與HCV的復(fù)制和感染密切相關(guān)，它可能通過與HCV基因組的特定區(qū)域結(jié)合，促進HCV的復(fù)制；hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p可能通過調(diào)控宿主細胞的信號通路，影響HCV的感染進程和宿主的免疫反應(yīng)。在對這4種miRNA進行ROC曲線分析時，我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-122具有較好的區(qū)分效能，其曲線下面積（AUC）為0.950，95％CI為0.905～0.994。這意味著hsa-miR-122在區(qū)分HCV感染患者和正常對照方面具有較高的準確性，能夠為HCV的診斷提供重要的參考依據(jù)。hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p具有中等的區(qū)分效能，相應(yīng)的AUC分別為0.803（95％CI：0.698～0.909）、0.840（95％CI：0.748～0.932）。雖然它們的診斷效能不如hsa-miR-122，但在HCV診斷中也具有一定的價值，可以作為輔助診斷指標。hsa-miR-629-5p的區(qū)分效能較差，AUC為0.704，95％CI為0.580～0.829。這可能是由于其在HCV感染中的作用機制較為復(fù)雜，或者受到其他因素的影響，導(dǎo)致其診斷效能相對較低。通過對HCV患者血清中miRNA異常表達譜及診斷潛能的研究，我們發(fā)現(xiàn)了一些與HCV感染密切相關(guān)的miRNA，其中hsa-miR-122具有較高的診斷價值，有望成為HCV診斷的潛在生物標志物。這一研究結(jié)果為HCV的早期診斷和治療提供了新的思路和方法，具有重要的臨床意義。未來的研究可以進一步探討這些miRNA的作用機制，以及如何將其應(yīng)用于臨床診斷和治療實踐中，為提高HCV的診療水平提供更多的支持。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究圍繞病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能及診斷效能展開，通過多方面的研究取得了一系列具有重要意義的成果。在miRNA對病毒感染進程的調(diào)控研究中，以流感病毒H7N9和登革病毒、寨卡病毒為例，揭示了miRNA在病毒感染過程中的關(guān)鍵作用。在流感病毒H7N9感染研究中，發(fā)現(xiàn)HA蛋白能夠引起小鼠機體明顯的病理反應(yīng)，促進免疫反應(yīng)的發(fā)生。HA蛋白作用于THP-1細胞時，可導(dǎo)致炎癥因子IL-1α和IL-6表達顯著上調(diào)，且與細菌內(nèi)毒素LPS具有協(xié)同促進炎癥因子表達的作用。深入研究其作用機理發(fā)現(xiàn)，Let-7e在HA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，HA通過TLR4途徑促進炎癥反應(yīng)，而Let-7e可能作為抑炎因子，在HA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)中維持機體的免疫平衡。這表明miRNA在病毒感染引起的炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要意義，為理解流感病毒感染的發(fā)病機制提供了新的視角。對于登革病毒和寨卡病毒感染，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院程功教授團隊的研究發(fā)現(xiàn)，人血來源的miRNA在蚊蟲感染傳播這兩種病毒的過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。通過smallnon-codingRNA深度測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)吸血后有多個人源miRNA可在蚊蟲體內(nèi)穩(wěn)定存在，其中hsa-miR-150-5p能夠顯著促進病毒感染蚊蟲。機制研究表明，hsa-miR-150-5p可進入蚊蟲細胞，通過跨物種基因調(diào)控方式抑制蚊蟲抗病毒基因表達，從而促進蚊蟲在吸血過程中感染病毒。生物信息學(xué)分析顯示，hsa-miR-150-5p在哺乳動物中高度保守，且吸血節(jié)肢動物中普遍存在可被其靶向調(diào)控的抗病毒基因，提示這種跨物種調(diào)控機制可能是節(jié)肢動物吸血并感染病毒的廣譜機制。這一研究成果為深入理解蚊媒病毒的傳播機制提供了新的理論依據(jù)，也為開發(fā)針對蚊媒病毒傳播的防控策略提供了重要的靶點。在miRNA對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控方面，通過激活免疫細胞相關(guān)信號通路和調(diào)節(jié)免疫因子的表達，miRNA在病毒感染過程中發(fā)揮著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用。在激活免疫細胞相關(guān)信號通路方面，以Toll樣受體（TLR）信號通路為例，miR-155在TLR信號通路的激活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當機體受到病毒感染時，TLR被激活，誘導(dǎo)miR-155表達上調(diào)，miR-155通過靶向抑制SHIP1和SOCS1等負調(diào)控因子的表達，激活PI3K/AKT信號通路，促進免疫細胞的增殖、分化和存活，增強免疫細胞的活性，從而更好地發(fā)揮抗病毒免疫作用。然而，病毒也可以利用miRNA來逃避宿主的免疫監(jiān)視，如乙肝病毒（HBV）編碼的miR-H1能夠靶向抑制TRAF3的表達，阻斷TBK1-IRF3信號通路的激活，抑制干擾素的產(chǎn)生，降低宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。這表明miRNA在病毒感染過程中對免疫細胞信號通路的調(diào)控是一個復(fù)雜的動態(tài)平衡過程，既可以促進免疫反應(yīng)，也可能被病毒利用來逃避免疫監(jiān)視。在調(diào)節(jié)免疫因子的表達方面，以流感病毒和乙肝病毒感染為例，miRNA對免疫因子的表達具有精細的調(diào)節(jié)作用，從而影響病毒感染的進程。在流感病毒感染中，miR-29家族成員通過靶向作用于Ⅰ型干擾素（IFN）信號通路中的關(guān)鍵分子，如IFN-α、IFN-β及其受體IFNAR1等，對IFN的表達進行調(diào)控。當miR-29家族成員表達上調(diào)時，抑制IFN的表達，削弱宿主細胞的抗病毒能力，使流感病毒更容易復(fù)制和擴散；當miR-29家族成員表達下調(diào)時，IFN的表達水平升高，增強宿主細胞的抗病毒能力。在乙肝病毒感染中，miR-122與HBV的復(fù)制和感染密切相關(guān)，它不僅可以促進HBV的復(fù)制，還能夠調(diào)節(jié)免疫因子的表達，影響肝臟的免疫微環(huán)境。miR-122可以靶向抑制TGF-β等免疫調(diào)節(jié)因子的表達，減弱TGF-β的免疫抑制效應(yīng)，增強肝臟局部的免疫反應(yīng)，有利于機體對HBV的免疫清除，但過度的免疫反應(yīng)也可能導(dǎo)致肝臟組織的損傷。這表明miRNA對免疫因子的調(diào)節(jié)在病毒感染過程中是一把雙刃劍，既可以促進免疫反應(yīng)，有利于病毒的清除，也可能導(dǎo)致免疫病理損傷。在miRNA在病毒傳染性疾病中的診斷效能研究方面，miRNA作為診斷標志物具有諸多優(yōu)勢。miRNA具有出色的穩(wěn)定性，在血清、血漿、唾液等多種生物體液中能夠在不同環(huán)境條件下保持相對穩(wěn)定，不易降解，為樣本采集、運輸和儲存提供了便利，保證了后續(xù)檢測和分析的可靠性。miRNA在病毒傳染性疾病中表現(xiàn)出高度的特異性，不同病毒感染會引發(fā)宿主細胞內(nèi)特定的miRNA表達譜變化，這種特異性的表達變化為病毒傳染性疾病的精準診斷提供了有力依據(jù)，能夠幫助臨床醫(yī)生準確地區(qū)分不同病毒感染，避免誤診和漏診。miRNA對病毒傳染性疾病的檢測具有較高的靈敏度，在病毒感染后會迅速發(fā)生表達變化，且在生物體液中的含量能夠隨著病毒感染的進程而動態(tài)變化，可作為早期診斷和病情監(jiān)測的敏感指標。miRNA在生物體液中的廣泛存在使得樣本采集更加方便、無創(chuàng)，有利于大規(guī)模的疾病篩查和早期診斷。通過對HCV患者血清中miRNA異常表達譜及診斷潛能的研究，進一步驗證了miRNA在病毒傳染性疾病診斷中的價值。利用miRNAPCR芯片篩查HCV患者血清中miRNA的異常表達譜，發(fā)現(xiàn)符合條件的miRNA共有106條，其中表達上調(diào)的有51條，下調(diào)的有55條。這表明HCV感染會導(dǎo)致患者血清中miRNA表達譜發(fā)生顯著變化，這些異常表達的miRNA可能在HCV感染的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。通過單個PCR驗證，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629