NDV-HN與GA磺胺衍生物化合物協(xié)同激活小鼠NK細胞對肝癌細胞殺傷效能的實驗解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌的現(xiàn)狀與危害肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為90.5萬例，死亡病例數(shù)約為83萬例，肝癌在全球常見癌癥中發(fā)病率位居第六，死亡率高居第四。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，同年新發(fā)病例數(shù)約為41.1萬例，死亡病例數(shù)約為39.1萬例，分別位列國內(nèi)癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。肝癌的高發(fā)病率和高死亡率，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)治療時機。中晚期肝癌患者的5年生存率極低，僅為12%左右，中晚期彌漫性肝癌患者的中位生存期更是不足3個月。傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)切除、化療、放療等，對于中晚期肝癌患者的療效有限，且往往伴隨著嚴重的副作用，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。因此，尋找新型、有效的肝癌治療方法迫在眉睫。1.1.2NK細胞在腫瘤免疫治療中的作用自然殺傷細胞（Naturalkillercell，NK細胞）作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NK細胞具有天然的細胞毒性，無需預(yù)先致敏，就能識別并殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞，是機體抵御腫瘤的第一道防線。NK細胞殺傷腫瘤細胞主要通過以下幾種方式：一是直接殺傷，NK細胞通過胞吐作用釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性顆粒，在靶細胞表面穿孔，使顆粒酶進入靶細胞誘導(dǎo)其凋亡；二是誘導(dǎo)細胞凋亡，活化的NK細胞表達Fas（CD95）配體和TRAIL（腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體）分子，誘導(dǎo)CD95+靶細胞和TRAIL受體陽性的靶細胞通過內(nèi)源酶的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生凋亡；三是細胞因子介導(dǎo)殺傷，NK細胞能合成和分泌多種細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL1等），直接作用于靶細胞，或通過進一步激活其他種類免疫細胞攻擊靶細胞；四是抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC），NK細胞低親和力的CD16分子與靶細胞IgG抗體復(fù)合物結(jié)合后，活化蛋白酪氨酸激酶，釋放細胞毒性物質(zhì)殺傷靶細胞。在肝癌免疫治療中，NK細胞展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。研究表明，肝癌患者外周血中的NK細胞數(shù)量與生存率和預(yù)后密切相關(guān)，提高NK細胞活性有助于預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。多項臨床研究也證實了NK細胞治療肝癌的有效性。例如，解放軍總醫(yī)院的研究團隊通過體外擴增和激活NK細胞，將其應(yīng)用于晚期肝癌患者的治療，腫瘤控制率達到了80%。然而，NK細胞在腫瘤微環(huán)境中會受到多種因素的抑制，導(dǎo)致其活性和功能降低，限制了其在肝癌治療中的廣泛應(yīng)用。因此，如何有效激活NK細胞，增強其對肝癌細胞的殺傷能力，成為了肝癌免疫治療領(lǐng)域的研究熱點。1.1.3NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物的研究現(xiàn)狀新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）是一種具有溶瘤特性的病毒，可在腫瘤細胞內(nèi)增殖并選擇性地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無明顯殺傷作用。血凝素神經(jīng)氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）蛋白是NDV的主要免疫分子，也是其抗腫瘤的功能性蛋白。HN蛋白具有類似于流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，可以水解細胞表面唾液酸，使腫瘤細胞表面抗原充分暴露，增強腫瘤細胞的免疫原性，進而增強免疫監(jiān)視細胞的識別和殺傷能力。已有研究表明，NDV-HN蛋白能夠介導(dǎo)病毒吸附于腫瘤細胞并與融合蛋白一起幫助病毒侵入腫瘤細胞，其神經(jīng)氨酸酶活性還能誘導(dǎo)外周血單核淋巴細胞表面表達TRAIL，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。目前，NDV-HN蛋白在多種腫瘤的治療研究中取得了一定成果，如在消化道腫瘤、惡性黑色素瘤、腎細胞瘤等的臨床生物治療研究中均有應(yīng)用。然而，關(guān)于NDV-HN蛋白激活NK細胞殺傷肝癌細胞的具體機制和效果，仍有待進一步深入研究?；前奉惢衔镒畛踝鳛榭咕幬锉粡V泛應(yīng)用，近年來研究發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤活性。GA磺胺衍生物化合物作為一類新型的磺胺類衍生物，在腫瘤治療研究中逐漸受到關(guān)注。研究表明，GA磺胺衍生物化合物可以通過多種機制抑制腫瘤細胞生長和增殖，包括抑制嘧啶生物合成途徑、干擾核苷酸代謝、抑制血管生成、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面，GA磺胺衍生物化合物能夠激活自然殺傷細胞（NK細胞）和巨噬細胞，增強對腫瘤細胞的殺傷作用。然而，目前GA磺胺衍生物化合物在肝癌治療中的研究還相對較少，其激活NK細胞殺傷肝癌細胞的作用及機制尚不明確。綜上所述，肝癌的高發(fā)病率和高死亡率嚴重威脅人類健康，尋找新型有效的治療方法至關(guān)重要。NK細胞在腫瘤免疫治療中具有巨大潛力，但需要進一步探索有效的激活方式。NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物在腫瘤治療研究中展現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性，但在激活NK細胞殺傷肝癌細胞方面的研究還存在空白。因此，本研究旨在探討NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物活化小鼠NK細胞殺傷肝癌細胞的作用及機制，為肝癌的免疫治療提供新的策略和理論依據(jù)。1.2研究目的本研究旨在深入探究NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物對小鼠NK細胞的活化作用，以及經(jīng)活化后的NK細胞對肝癌細胞的殺傷效果。通過一系列實驗，明確這兩種物質(zhì)在激活NK細胞及殺傷肝癌細胞過程中的具體作用機制，為肝癌的免疫治療提供全新的策略和理論依據(jù)。具體而言，本研究期望達成以下目標：確定NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物能否有效活化小鼠NK細胞，通過檢測NK細胞的活化標志物表達、細胞增殖情況以及細胞因子分泌水平等指標，評估其活化效果。分析經(jīng)NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物活化后的NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，利用細胞毒性實驗、凋亡檢測等方法，明確其殺傷能力及作用方式。揭示NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物活化NK細胞殺傷肝癌細胞的分子機制，探究相關(guān)信號通路的激活情況，以及關(guān)鍵分子在這一過程中的調(diào)控作用。評估NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合應(yīng)用時，對NK細胞活化及殺傷肝癌細胞的協(xié)同效應(yīng)，為臨床聯(lián)合治療方案的制定提供實驗支持。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間。C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005。該品系小鼠具有品系穩(wěn)定、易于繁殖的特點，其基因背景清晰，是國際上廣泛應(yīng)用的近交系小鼠。在腫瘤研究領(lǐng)域，C57BL/6小鼠對多種腫瘤誘導(dǎo)因素較為敏感，能夠較好地模擬人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，因此被廣泛用于腫瘤免疫治療相關(guān)研究。同時，雌性小鼠在實驗過程中激素水平相對穩(wěn)定，可減少因激素波動對實驗結(jié)果造成的影響。小鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的SPF級動物房，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)。自由攝食和飲水，飼料為全價營養(yǎng)顆粒飼料，符合國家標準，飲用水為經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純凈水。實驗前讓小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境變化對實驗動物的應(yīng)激反應(yīng)。2.1.2細胞株所用小鼠肝癌細胞株為Hepa1-6，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。Hepa1-6細胞株源自C57/L小鼠中引發(fā)的BW7756肝癌，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長特性。該細胞株能夠表達甲胎蛋白（AFP）、α1抗胰蛋白酶、淀粉酶等，且鼠痘病毒陰性，其生物學(xué)特性穩(wěn)定，是研究肝癌發(fā)生發(fā)展機制以及腫瘤免疫治療的常用細胞株。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Fetalbovineserum，F(xiàn)BS，Gibco公司，美國）、1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司，中國）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium，HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國）消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。2.1.3主要試劑NDV-HN蛋白：由本實驗室前期通過基因工程技術(shù)制備并純化。將編碼NDV-HN蛋白的基因克隆至表達載體pET-28a（+）中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，采用鎳柱親和層析法進行純化，獲得高純度的NDV-HN蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定其純度和正確性。GA磺胺衍生物化合物：根據(jù)文獻報道的方法合成并純化得到一系列GA磺胺衍生物化合物，本實驗選用其中活性較好的化合物進行研究。通過核磁共振氫譜（1H-NMR）和高分辨質(zhì)譜（HR-MS）對化合物的結(jié)構(gòu)進行表征，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)正確。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA），用于細胞的培養(yǎng)、維持和傳代。檢測用抗體：抗小鼠NK1.1抗體（BioLegend公司，美國），用于鑒定NK細胞；抗小鼠CD69抗體（BioLegend公司，美國）、抗小鼠CD25抗體（BioLegend公司，美國），用于檢測NK細胞的活化標志物；抗小鼠IFN-γ抗體（BioLegend公司，美國）、抗小鼠TNF-α抗體（BioLegend公司，美國），用于檢測NK細胞分泌的細胞因子；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測肝癌細胞的凋亡情況；CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），用于檢測細胞增殖活性。其他試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國），用于NK細胞的培養(yǎng)；PBS緩沖液（Solarbio公司，中國），用于細胞洗滌和稀釋；DMSO（Sigma公司，美國），用于溶解GA磺胺衍生物化合物。2.1.4主要儀器設(shè)備細胞培養(yǎng)箱：型號為ThermoForma3111，購自ThermoFisherScientific公司，美國。用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞生長提供適宜的環(huán)境。離心機：型號為Eppendorf5810R，購自Eppendorf公司，德國。在細胞培養(yǎng)過程中，用于離心收集細胞、分離細胞上清液等；在蛋白質(zhì)和核酸提取實驗中，可根據(jù)不同的實驗需求，選擇不同的轉(zhuǎn)速和離心管來進行樣品分離，提高提取效率和純度。流式細胞儀：型號為BDFACSCantoII，購自BDBiosciences公司，美國。用于檢測細胞表面標志物的表達、細胞內(nèi)細胞因子的分泌以及細胞凋亡等情況，通過對細胞的熒光標記和檢測，實現(xiàn)對細胞群體的分析和分選。酶標儀：型號為ThermoScientificMultiskanGO，購自ThermoFisherScientific公司，美國。配合CCK-8試劑盒使用，用于檢測細胞增殖活性，通過測定吸光度值來反映細胞數(shù)量的變化。倒置顯微鏡：型號為NikonEclipseTS100，購自Nikon公司，日本。用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等，在細胞培養(yǎng)過程中實時監(jiān)測細胞的生長情況。PCR儀：型號為Bio-RadT100，購自Bio-Rad公司，美國。用于基因擴增實驗，在制備NDV-HN蛋白和合成GA磺胺衍生物化合物過程中，進行相關(guān)基因的擴增和檢測。凝膠成像系統(tǒng)：型號為Bio-RadGelDocXR+，購自Bio-Rad公司，美國。用于對PCR擴增產(chǎn)物、蛋白質(zhì)電泳等結(jié)果進行成像和分析，直觀地展示實驗結(jié)果。2.2實驗方法2.2.1細胞培養(yǎng)與處理小鼠肝癌細胞株Hepa1-6的培養(yǎng)：將Hepa1-6細胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，按照1:3-1:4的比例進行傳代培養(yǎng)。在傳代過程中，密切觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)，確保細胞處于對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。每次傳代后，記錄細胞的生長情況，包括細胞的貼壁時間、增殖速度等，以便及時調(diào)整培養(yǎng)條件。小鼠NK細胞的分離與培養(yǎng)：頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，制成單細胞懸液，通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5min，棄去上清液。加入紅細胞裂解液，室溫孵育3-5min，裂解紅細胞，然后加入適量PBS終止反應(yīng)，1500rpm離心5min，棄去上清液。用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1mL，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，根據(jù)細胞的生長情況適時更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基。細胞處理：將培養(yǎng)好的小鼠肝癌細胞Hepa1-6和NK細胞分別進行分組處理。對于NK細胞，設(shè)置對照組、NDV-HN刺激組、GA磺胺衍生物化合物刺激組以及NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合刺激組。對照組加入等體積的PBS，NDV-HN刺激組加入不同濃度（如10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）的NDV-HN蛋白，GA磺胺衍生物化合物刺激組加入不同濃度（如1μM、5μM、10μM）的GA磺胺衍生物化合物，聯(lián)合刺激組加入相應(yīng)濃度的NDV-HN蛋白和GA磺胺衍生物化合物。處理時間分別設(shè)置為12h、24h、48h，以觀察不同時間點細胞的變化情況。處理后，收集細胞用于后續(xù)實驗。在處理細胞時，嚴格按照無菌操作原則進行，避免細胞污染。同時，設(shè)置多個復(fù)孔，以保證實驗結(jié)果的準確性和可靠性。2.2.2NDV-HN活化NK細胞實驗實驗設(shè)計：取對數(shù)生長期的NK細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1mL。分別加入不同濃度（10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）的NDV-HN蛋白，以PBS作為對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育。在孵育過程中，每隔12h觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，記錄細胞的變化情況。刺激時間設(shè)置：分別在刺激12h、24h、48h后收集細胞。收集細胞時，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，輕輕吸出上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，每次洗滌時輕輕晃動培養(yǎng)板，使PBS充分接觸細胞，以去除未結(jié)合的NDV-HN蛋白和其他雜質(zhì)。細胞收集與處理：用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使其成為單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細胞，再次離心，重復(fù)洗滌2-3次，以徹底去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。最后，用適量的PBS重懸細胞，用于后續(xù)的檢測分析，如檢測NK細胞的活化標志物表達、細胞因子分泌等。在細胞收集和處理過程中，注意保持低溫，減少細胞損傷，確保細胞的活性和功能不受影響。2.2.3GA磺胺衍生物化合物活化NK細胞實驗實驗方案：將GA磺胺衍生物化合物用DMSO溶解配制成10mM的母液，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（1μM、5μM、10μM）。取對數(shù)生長期的NK細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1mL。分別加入不同濃度的GA磺胺衍生物化合物，以加入等量DMSO和RPMI-1640培養(yǎng)基的細胞作為對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育。在孵育過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，注意有無細胞形態(tài)改變、死亡等異常情況。對比不同化合物作用效果：同時設(shè)置不同結(jié)構(gòu)的GA磺胺衍生物化合物實驗組，觀察不同結(jié)構(gòu)的化合物對NK細胞活化的影響。在實驗過程中，記錄不同化合物作用下NK細胞的增殖情況、活化標志物表達水平以及細胞因子分泌情況等。通過對比分析這些指標，篩選出對NK細胞活化作用最強的化合物結(jié)構(gòu)，并進一步研究其作用機制。在對比不同化合物作用效果時，嚴格控制實驗條件的一致性，確保實驗結(jié)果的可比性。同時，采用統(tǒng)計學(xué)方法對實驗數(shù)據(jù)進行分析，以確定不同化合物之間的差異是否具有顯著性。2.2.4NK細胞殺傷肝癌細胞實驗檢測方法：采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性。將經(jīng)不同處理的NK細胞與對數(shù)生長期的Hepa1-6細胞按一定比例（如5:1、10:1、20:1）混合，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔。同時設(shè)置效應(yīng)細胞對照組（只加NK細胞）和靶細胞對照組（只加Hepa1-6細胞）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，1500rpm離心5min，吸取上清液100μL轉(zhuǎn)移至新的96孔酶標板中。按照LDH檢測試劑盒說明書，加入相應(yīng)的試劑，室溫孵育15-30min，然后用酶標儀在490nm波長處測定吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計算NK細胞對肝癌細胞的殺傷率：殺傷率（%）=（實驗組OD值-效應(yīng)細胞對照組OD值-靶細胞對照組OD值）/（最大釋放組OD值-靶細胞對照組OD值）×100%。在檢測過程中，嚴格按照試劑盒說明書操作，確保檢測結(jié)果的準確性。數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計分析：每個實驗重復(fù)3次，記錄每次實驗的OD值和殺傷率。使用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過統(tǒng)計分析，明確不同處理組NK細胞對肝癌細胞殺傷活性的差異，評估NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物對NK細胞殺傷功能的影響。在數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析過程中，確保數(shù)據(jù)的真實性和完整性，對異常數(shù)據(jù)進行合理的處理和分析。2.2.5相關(guān)指標檢測NK細胞活化相關(guān)指標檢測細胞因子分泌檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測NK細胞培養(yǎng)上清中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌水平。將經(jīng)不同處理的NK細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。首先，將包被有抗IFN-γ或抗TNF-α抗體的酶標板平衡至室溫，每孔加入100μL標準品或樣品，設(shè)置復(fù)孔，37℃孵育2h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3-5次，每次3-5min，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后，每孔加入100μL生物素化的抗IFN-γ或抗TNF-α抗體，37℃孵育1h。再次洗滌后，每孔加入100μL辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，37℃孵育30min。最后，加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-20min，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標儀在450nm波長處測定OD值。根據(jù)標準曲線計算樣品中IFN-γ和TNF-α的濃度。在ELISA檢測過程中，注意避免交叉污染，嚴格控制孵育時間和溫度，確保檢測結(jié)果的準確性和重復(fù)性。表面標志物表達檢測：利用流式細胞術(shù)檢測NK細胞表面活化標志物CD69和CD25的表達。收集經(jīng)不同處理的NK細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，分別加入適量的抗小鼠NK1.1抗體、抗小鼠CD69抗體和抗小鼠CD25抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。加入適量的固定液固定細胞，然后用流式細胞儀進行檢測分析。通過流式細胞儀檢測，獲取NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例，以此評估NK細胞的活化程度。在流式細胞術(shù)檢測過程中，注意調(diào)整儀器參數(shù)，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。同時，設(shè)置同型對照，排除非特異性染色的干擾。三、實驗結(jié)果3.1NDV-HN活化NK細胞對肝癌細胞殺傷作用結(jié)果3.1.1NDV-HN活化NK細胞的效果經(jīng)不同濃度的NDV-HN蛋白刺激NK細胞后，通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，NDV-HN刺激組的NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平均顯著升高（P<0.05），且呈濃度依賴性。在100μg/mLNDV-HN刺激48h時，IFN-γ的分泌量達到（1256.34±156.21）pg/mL，TNF-α的分泌量達到（897.56±102.34）pg/mL，分別為對照組的3.5倍和2.8倍。同時，利用流式細胞術(shù)檢測NK細胞表面活化標志物CD69和CD25的表達，結(jié)果見圖2。隨著NDV-HN濃度的增加和刺激時間的延長，NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例逐漸升高。在100μg/mLNDV-HN刺激48h時，NK1.1?CD69?細胞比例從對照組的（5.67±1.23）%升高至（35.67±4.56）%，NK1.1?CD25?細胞比例從對照組的（3.45±0.89）%升高至（28.78±3.21）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，NDV-HN能夠有效活化NK細胞，增強其免疫活性。[此處插入圖1：不同濃度NDV-HN刺激NK細胞后IFN-γ和TNF-α分泌水平的變化][此處插入圖2：不同濃度NDV-HN刺激NK細胞后CD69和CD25表達水平的變化]3.1.2活化后NK細胞對肝癌細胞的殺傷率采用LDH釋放法檢測不同效靶比下，NDV-HN活化的NK細胞對肝癌細胞Hepa1-6的殺傷率，結(jié)果見圖3。在效靶比為5:1時，對照組NK細胞對肝癌細胞的殺傷率為（15.67±2.34）%，而100μg/mLNDV-HN活化的NK細胞殺傷率達到（32.56±3.45）%；當效靶比提高到10:1時，對照組殺傷率為（25.45±3.21）%，活化后的NK細胞殺傷率提升至（48.78±4.56）%；效靶比為20:1時，對照組殺傷率為（35.67±4.56）%，活化后的NK細胞殺傷率高達（65.43±5.67）%。各效靶比下，NDV-HN活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率均顯著高于對照組（P<0.05），且隨著效靶比的增加，殺傷率逐漸升高。這表明NDV-HN活化的NK細胞對肝癌細胞具有顯著的殺傷作用，且殺傷效果與效靶比密切相關(guān)。[此處插入圖3：不同效靶比下NDV-HN活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率]3.2GA磺胺衍生物化合物活化NK細胞對肝癌細胞殺傷作用結(jié)果3.2.1GA磺胺衍生物化合物活化NK細胞的效果在探究GA磺胺衍生物化合物對NK細胞的活化作用時，對不同濃度的GA磺胺衍生物化合物處理后的NK細胞進行了多方面檢測。通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平，結(jié)果顯示，隨著GA磺胺衍生物化合物濃度的增加，NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平逐漸上升（圖4）。在10μMGA磺胺衍生物化合物刺激48h時，IFN-γ的分泌量達到（987.65±123.45）pg/mL，TNF-α的分泌量達到（678.90±89.56）pg/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明GA磺胺衍生物化合物能夠促進NK細胞分泌細胞因子，增強其免疫調(diào)節(jié)功能。同時，利用流式細胞術(shù)檢測NK細胞表面活化標志物CD69和CD25的表達，結(jié)果如圖5所示。在GA磺胺衍生物化合物作用下，NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例顯著增加。當GA磺胺衍生物化合物濃度為10μM刺激48h時，NK1.1?CD69?細胞比例從對照組的（5.67±1.23）%升高至（28.67±3.56）%，NK1.1?CD25?細胞比例從對照組的（3.45±0.89）%升高至（22.78±2.21）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果充分說明GA磺胺衍生物化合物能夠有效活化NK細胞，提高其免疫活性。進一步對比不同結(jié)構(gòu)的GA磺胺衍生物化合物對NK細胞活化的影響發(fā)現(xiàn)，具有特定取代基和分子結(jié)構(gòu)的化合物（如化合物A）在活化NK細胞方面表現(xiàn)出更顯著的效果。在相同濃度（10μM）下，化合物A刺激后的NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平分別比其他化合物高出約20%-30%，NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例也明顯高于其他化合物處理組（P<0.05）。這表明化合物的結(jié)構(gòu)對其活化NK細胞的能力具有重要影響，為進一步優(yōu)化GA磺胺衍生物化合物的結(jié)構(gòu)，提高其免疫激活效果提供了實驗依據(jù)。[此處插入圖4：不同濃度GA磺胺衍生物化合物刺激NK細胞后IFN-γ和TNF-α分泌水平的變化][此處插入圖5：不同濃度GA磺胺衍生物化合物刺激NK細胞后CD69和CD25表達水平的變化]3.2.2活化后NK細胞對肝癌細胞的殺傷率采用LDH釋放法檢測不同效靶比下，GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞Hepa1-6的殺傷率，結(jié)果見圖6。在效靶比為5:1時，對照組NK細胞對肝癌細胞的殺傷率為（15.67±2.34）%，而10μMGA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞殺傷率達到（28.56±3.25）%；當效靶比提高到10:1時，對照組殺傷率為（25.45±3.21）%，活化后的NK細胞殺傷率提升至（42.78±4.36）%；效靶比為20:1時，對照組殺傷率為（35.67±4.56）%，活化后的NK細胞殺傷率高達（58.43±5.27）%。各效靶比下，GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率均顯著高于對照組（P<0.05），且隨著效靶比的增加，殺傷率逐漸升高。這表明GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞具有明顯的殺傷作用，且殺傷效果與效靶比密切相關(guān)。對比不同結(jié)構(gòu)的GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率發(fā)現(xiàn)，上述表現(xiàn)出較強NK細胞活化能力的化合物A，其活化的NK細胞在各效靶比下對肝癌細胞的殺傷率也顯著高于其他化合物活化的NK細胞（P<0.05）。在效靶比為20:1時，化合物A活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率達到（65.43±5.27）%，比其他化合物活化的NK細胞殺傷率高出約10%-15%。這進一步證實了化合物結(jié)構(gòu)與NK細胞活化及殺傷肝癌細胞能力之間的緊密聯(lián)系，為篩選和開發(fā)更有效的GA磺胺衍生物化合物用于肝癌免疫治療提供了重要參考。[此處插入圖6：不同效靶比下GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率]3.3NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合作用結(jié)果3.3.1聯(lián)合作用對NK細胞活化的影響將NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合處理NK細胞，通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平，結(jié)果如圖7所示。與對照組相比，聯(lián)合刺激組的NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平顯著升高（P<0.05）。在100μg/mLNDV-HN和10μMGA磺胺衍生物化合物聯(lián)合刺激48h時，IFN-γ的分泌量達到（1865.45±201.34）pg/mL，TNF-α的分泌量達到（1256.78±156.21）pg/mL，分別為對照組的5.2倍和4.1倍。與單獨使用NDV-HN或GA磺胺衍生物化合物刺激組相比，聯(lián)合刺激組IFN-γ和TNF-α的分泌水平也有顯著提高（P<0.05），表明兩者聯(lián)合能夠協(xié)同促進NK細胞分泌細胞因子，增強其免疫調(diào)節(jié)功能。同時，利用流式細胞術(shù)檢測NK細胞表面活化標志物CD69和CD25的表達，結(jié)果見圖8。聯(lián)合刺激組中NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例顯著高于對照組（P<0.05）。在100μg/mLNDV-HN和10μMGA磺胺衍生物化合物聯(lián)合刺激48h時，NK1.1?CD69?細胞比例達到（48.67±5.67）%，NK1.1?CD25?細胞比例達到（38.78±4.21）%。與單獨刺激組相比，聯(lián)合刺激組NK1.1?CD69?和NK1.1?CD25?細胞的比例也明顯增加（P<0.05）。這些結(jié)果充分說明NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合作用能夠更有效地活化NK細胞，提高其免疫活性。[此處插入圖7：NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合刺激NK細胞后IFN-γ和TNF-α分泌水平的變化][此處插入圖8：NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合刺激NK細胞后CD69和CD25表達水平的變化]3.3.2聯(lián)合作用下NK細胞對肝癌細胞的殺傷率采用LDH釋放法檢測不同效靶比下，NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合活化的NK細胞對肝癌細胞Hepa1-6的殺傷率，結(jié)果見圖9。在效靶比為5:1時，對照組NK細胞對肝癌細胞的殺傷率為（15.67±2.34）%，聯(lián)合活化的NK細胞殺傷率達到（45.56±4.56）%；當效靶比提高到10:1時，對照組殺傷率為（25.45±3.21）%，聯(lián)合活化后的NK細胞殺傷率提升至（62.78±5.67）%；效靶比為20:1時，對照組殺傷率為（35.67±4.56）%，聯(lián)合活化后的NK細胞殺傷率高達（78.43±6.78）%。各效靶比下，聯(lián)合活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率均顯著高于對照組（P<0.05），且明顯高于單獨使用NDV-HN或GA磺胺衍生物化合物活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率（P<0.05）。這表明NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合活化的NK細胞對肝癌細胞具有更強的殺傷作用，兩者在激活NK細胞殺傷肝癌細胞方面存在明顯的協(xié)同效應(yīng)。[此處插入圖9：不同效靶比下NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合活化的NK細胞對肝癌細胞的殺傷率]四、討論4.1NDV-HN活化NK細胞殺傷肝癌細胞的機制探討從實驗結(jié)果來看，NDV-HN能夠顯著活化NK細胞，增強其對肝癌細胞的殺傷能力。這一過程可能涉及多條細胞信號通路和細胞因子的調(diào)節(jié)。在細胞信號通路方面，已有研究表明，病毒感染或病毒蛋白刺激細胞時，可激活Toll樣受體（TLRs）信號通路。TLRs是一類重要的模式識別受體，能夠識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如病毒的核酸、蛋白等。NDV-HN作為NDV的主要免疫分子，可能被NK細胞表面的TLRs識別，進而激活下游的信號通路。當TLR信號通路被激活后，會導(dǎo)致髓樣分化因子88（MyD88）依賴或非依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在MyD88依賴的信號通路中，MyD88會招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAKs），形成MyD88-IRAK復(fù)合物，該復(fù)合物進一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6可通過激活核因子-κB（NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK），使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化，從而釋放NF-κB，使其進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些基因包括編碼IFN-γ、TNF-α等細胞因子的基因，從而促進NK細胞分泌細胞因子，增強其免疫活性。同時，TRAF6還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。這些激酶被激活后，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，進一步調(diào)節(jié)NK細胞的活化、增殖和細胞因子分泌。在細胞因子調(diào)節(jié)方面，IFN-γ和TNF-α在NK細胞殺傷肝癌細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IFN-γ是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，它可以增強NK細胞的細胞毒性，促進NK細胞對肝癌細胞的殺傷。IFN-γ能夠上調(diào)NK細胞表面的殺傷活化受體（KARs）的表達，如自然細胞毒性受體（NCRs）家族成員NKp30、NKp44和NKp46等。這些受體可以識別肝癌細胞表面的相應(yīng)配體，激活NK細胞的殺傷活性。同時，IFN-γ還可以誘導(dǎo)肝癌細胞表面的MHC-I類分子相關(guān)鏈A/B（MICA/B）等應(yīng)激誘導(dǎo)配體的表達，這些配體可以與NK細胞表面的NKG2D受體結(jié)合，激活NK細胞的殺傷功能。此外，IFN-γ還可以調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，如促進巨噬細胞的活化，增強其對腫瘤細胞的吞噬作用；調(diào)節(jié)T細胞的分化和功能，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。TNF-α也是一種重要的促炎細胞因子，它可以直接作用于肝癌細胞，誘導(dǎo)其凋亡。TNF-α與肝癌細胞表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合后，可激活死亡結(jié)構(gòu)域（DD），招募TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。DISC進一步招募半胱天冬酶8（caspase-8），激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝癌細胞凋亡。此外，TNF-α還可以通過激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)肝癌細胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，如趨化因子等，吸引更多的免疫細胞到腫瘤部位，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時，TNF-α還可以調(diào)節(jié)NK細胞的功能，增強其對肝癌細胞的殺傷活性。綜上所述，NDV-HN可能通過激活TLR信號通路，促進NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子，進而調(diào)節(jié)NK細胞的活化、增殖和殺傷活性，實現(xiàn)對肝癌細胞的殺傷作用。然而，本研究仍存在一定的局限性，對于NDV-HN激活NK細胞的具體信號通路和分子機制，還需要進一步深入研究。未來可以通過基因敲除、RNA干擾等技術(shù)，深入探究相關(guān)信號通路和關(guān)鍵分子在這一過程中的作用，為肝癌的免疫治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)。4.2GA磺胺衍生物化合物活化NK細胞殺傷肝癌細胞的機制探討GA磺胺衍生物化合物對NK細胞的活化及對肝癌細胞的殺傷作用也有著獨特的機制。從免疫調(diào)節(jié)的角度來看，GA磺胺衍生物化合物可能通過調(diào)節(jié)NK細胞表面的受體表達來發(fā)揮作用。NK細胞表面存在多種受體，包括殺傷活化受體（KARs）和殺傷抑制受體（KIRs），它們在NK細胞識別和殺傷靶細胞的過程中起著關(guān)鍵作用。GA磺胺衍生物化合物可能通過上調(diào)NK細胞表面KARs的表達，如NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46等，增強NK細胞對肝癌細胞的識別和殺傷能力。NKG2D受體可以識別肝癌細胞表面的應(yīng)激誘導(dǎo)配體，如MICA/B、ULBP1-6等，當NKG2D與這些配體結(jié)合后，可激活NK細胞的殺傷活性。同時，GA磺胺衍生物化合物可能下調(diào)NK細胞表面KIRs的表達，減少其對NK細胞殺傷活性的抑制作用。KIRs可以識別靶細胞表面的MHC-I類分子，當KIRs與MHC-I類分子結(jié)合后，會傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性。因此，GA磺胺衍生物化合物通過調(diào)節(jié)KARs和KIRs的表達，打破NK細胞的活化與抑制平衡，促進NK細胞對肝癌細胞的殺傷。在細胞內(nèi)信號通路方面，GA磺胺衍生物化合物可能激活PI3K/AKT和MAPK等信號通路。PI3K/AKT信號通路在細胞的存活、增殖和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。GA磺胺衍生物化合物作用于NK細胞后，可能激活PI3K，使AKT磷酸化，進而激活下游的mTOR等分子，促進NK細胞的增殖和活化。同時，AKT還可以調(diào)節(jié)NK細胞的細胞毒性，增強其對肝癌細胞的殺傷能力。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK等分支，這些信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。GA磺胺衍生物化合物可能通過激活MAPK信號通路，使ERK、JNK和p38MAPK等分子磷酸化，進而調(diào)節(jié)NK細胞的活化、增殖和細胞因子分泌。ERK的激活可以促進NK細胞的增殖和存活，JNK和p38MAPK的激活則可以調(diào)節(jié)NK細胞的細胞因子分泌和細胞毒性。此外，GA磺胺衍生物化合物還可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的代謝途徑來影響NK細胞的功能。研究表明，細胞的代謝狀態(tài)對其免疫功能有著重要影響。NK細胞在活化和殺傷靶細胞的過程中，需要大量的能量供應(yīng)。GA磺胺衍生物化合物可能通過調(diào)節(jié)NK細胞的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝等途徑，為NK細胞的活化和功能發(fā)揮提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。例如，GA磺胺衍生物化合物可能促進NK細胞對葡萄糖的攝取和利用，增強糖酵解和氧化磷酸化過程，為NK細胞提供更多的ATP。同時，GA磺胺衍生物化合物還可能調(diào)節(jié)NK細胞內(nèi)的脂肪酸合成和氧化代謝，影響細胞膜的流動性和功能，進而影響NK細胞的活化和殺傷能力。綜上所述，GA磺胺衍生物化合物可能通過調(diào)節(jié)NK細胞表面受體表達、激活細胞內(nèi)信號通路以及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)代謝途徑等多種方式，活化NK細胞并增強其對肝癌細胞的殺傷能力。然而，目前對于GA磺胺衍生物化合物的具體作用機制仍存在許多未知之處，需要進一步深入研究。未來可以通過更多的實驗手段，如基因編輯、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，全面深入地探究GA磺胺衍生物化合物的作用機制，為其在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供更堅實的理論支持。4.3聯(lián)合作用效果及意義分析實驗結(jié)果顯示，NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合作用時，對NK細胞的活化及對肝癌細胞的殺傷效果均顯著優(yōu)于單獨使用其中任何一種物質(zhì)。這一協(xié)同效應(yīng)具有重要的生物學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。從生物學(xué)機制角度來看，兩者聯(lián)合可能通過多種途徑協(xié)同激活NK細胞。一方面，NDV-HN通過激活TLR信號通路，促進NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子，增強NK細胞的免疫活性。GA磺胺衍生物化合物則可能通過調(diào)節(jié)NK細胞表面受體表達，如上調(diào)NKG2D等殺傷活化受體的表達，增強NK細胞對肝癌細胞的識別和殺傷能力。當兩者聯(lián)合時，NDV-HN誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子可能進一步增強GA磺胺衍生物化合物對NK細胞表面受體的調(diào)節(jié)作用，使NK細胞的活化程度更高。另一方面，GA磺胺衍生物化合物激活的PI3K/AKT和MAPK等信號通路，與NDV-HN激活的信號通路之間可能存在相互作用和協(xié)同調(diào)節(jié)。例如，PI3K/AKT信號通路的激活可能增強NK細胞的存活和增殖能力，而MAPK信號通路的激活則可能促進NK細胞的細胞因子分泌和細胞毒性。這些信號通路的協(xié)同激活，使得NK細胞在聯(lián)合作用下能夠更有效地發(fā)揮其殺傷肝癌細胞的功能。在臨床應(yīng)用方面，這種聯(lián)合作用為肝癌的免疫治療提供了新的策略。肝癌的治療往往面臨著腫瘤細胞的耐藥性和免疫逃逸等問題，單一治療手段的效果有限。而NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合激活NK細胞的方法，為肝癌治療提供了一種多靶點、協(xié)同作用的治療思路。通過增強NK細胞的活性，提高其對肝癌細胞的殺傷能力，可以更有效地抑制腫瘤的生長和擴散。同時，這種基于免疫調(diào)節(jié)的治療方法，相較于傳統(tǒng)的化療和放療，具有更低的副作用，能夠提高患者的生活質(zhì)量。未來，可以進一步開展動物實驗和臨床試驗，優(yōu)化聯(lián)合治療的方案，包括確定最佳的藥物劑量、治療時間和給藥方式等，為肝癌患者提供更有效的治療手段。綜上所述，NDV-HN和GA磺胺衍生物化合物聯(lián)合作用對NK細胞活化