ICS11.220CCSB411310IDB1310/T272—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出。本文件起草單位：三河市金源禽業(yè)有限公司、三河市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局。本文件主要起草人：劉佳、張海燕、張凌鳳、陳雪梅、李玉瑩、張軍英、馬振剛、司文輝、王萃、于明輝。DB1310/T272—20221蛋禽H7亞型禽流感免疫抗體卵黃檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了蛋禽H7亞型禽流感免疫抗體卵黃檢測技術(shù)中的術(shù)語和定義、樣本抽取、實驗準(zhǔn)備、實驗方法、結(jié)果判定和免疫抗體合格判定等內(nèi)容。本文件適用于廊坊市轄區(qū)內(nèi)采用卵黃進行蛋禽（雞、鴨、鵝）H7亞型禽流感滅活疫苗免疫抗體檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18936高致病性禽流感診斷技術(shù)GB/T30642食品抽樣檢驗通用導(dǎo)則DB13/T946-2008蛋禽H5亞型禽流感免疫抗體卵黃檢測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義DB13/T946—2008界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4樣本抽取4.1人員要求抽樣人員不少于2人，并經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，掌握抽樣程序和技術(shù)要求。抽樣時需穿工作服、一次性鞋套、口罩、手套，做好人員防護。4.2樣本要求抽取的禽蛋要具有代表性，以一棟禽舍或同一批次禽群為抽樣單元，隨機抽取蛋禽免疫接種H5+H7亞型禽流感滅活疫苗21d后所產(chǎn)的新鮮禽蛋。4.3抽樣方式4.3.1籠養(yǎng)蛋禽禽舍的首端、中端、尾端，雞籠的每一層多點抽樣。4.3.2非籠養(yǎng)蛋禽和蛋庫抽樣按照GB/T30642規(guī)定的程序和方法執(zhí)行，確保抽樣的公正性、真實性。DB1310/T272—202224.4樣品的標(biāo)記、保存和運輸4.4.1樣品的標(biāo)記抽樣后填寫采樣單，抽樣樣品分為檢測樣品和復(fù)檢備份樣品，并在抽樣過程中單獨分裝、封樣。抽取的樣品應(yīng)標(biāo)明樣品名稱、日期、批號、數(shù)量、抽樣人等信息，標(biāo)記應(yīng)牢固。4.4.2樣品的保存和運輸將抽取的樣品放置蛋托內(nèi)避免樣品破損，應(yīng)貯藏在陰涼、干燥、通風(fēng)、良好的場所。不得與有毒、有害、有異味、易揮發(fā)、易腐蝕的物品同處貯藏。抽取的樣品應(yīng)立即送檢，避免抽樣、運輸及裝卸過程中對樣品的污染。5實驗準(zhǔn)備5.1材料準(zhǔn)備5.1.1儀器設(shè)備96孔90°V型微量反應(yīng)板、100-1000ul單道微量移液器、5-50ul多道微量移液器、300ul滴頭、1000ul滴頭、微量振蕩器、低速離心機、液體快速混合器、1.5ml離心管、30ml容量瓶、60ml容量瓶。5.1.2試劑0.9%生理鹽水、SPF雞紅細(xì)胞混懸劑（1%）、禽流感病毒H7亞型HI抗原、禽流感病毒H7亞型陽性血清和陰性血清。5.2檢樣制備5.2.1卵黃直接稀釋在樣品管中加入0.5ml生理鹽水（0.9%），再吸取0.5ml卵黃做1:1稀釋，混勻制成卵黃檢樣備用。5.2.2卵黃氯仿萃取取5.2.1制備好的卵黃檢樣0.4ml加入等量氯仿,迅速用液體快速混合器充分振蕩混勻，室溫靜置30min，3000r/min離心5min，取上清液備用。6實驗方法6.1抗原血凝效價測定(HA試驗，微量法)操作方法按GB/T18936執(zhí)行。6.2血凝抑制(HI)試驗(微量法)6.2.1卵黃直接稀釋測定法操作方法按GB/T18936執(zhí)行。用5.2.1中制備的卵黃檢樣代替血清進行檢測。檢測時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清對照。DB1310/T272—202236.2.2卵黃氯仿萃取測定法6.2.2.1適用范圍在卵黃直接稀釋測定法檢測出現(xiàn)跳管或測不出抗體時，采用卵黃氯仿萃取法檢測。6.2.2.2方法操作方法按GB/T18936執(zhí)行。用5.2.2中制備的檢樣代替血清進行檢測。檢測時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清對照。7結(jié)果判定7.1試驗結(jié)果成立條件只有陰性對照孔血清滴度不大于22,陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。7.2HI滴度的計算方法以完全抑制4個HAU抗原的樣本最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。樣本制備過程中卵黃的稀釋倍數(shù)和加入氯仿量都計入該樣本的稀釋倍數(shù)。7.3判定方法7.3.1卵黃直接稀釋測定法結(jié)果判定將“檢樣制備”過程中樣本的稀釋倍數(shù)計入終點滴度判定，即:微最反應(yīng)板上血凝抑制的終點滴度加一個滴度為該樣本的HI抗體效價，終點滴度為零時則不再加。舉例：微量反應(yīng)板上血凝抑制的終點滴度是27，則該樣本HI抗體效價為28。7.3.2卵黃氯仿萃取測定法結(jié)果判定將“檢樣制備”過程中樣本的稀釋倍數(shù)計入終點滴度判定，即:微量反應(yīng)板上血凝抑制的終點滴度加兩個滴度為該樣本的HI抗體效價，終點滴度為零時則不再加。舉例:微量反