強化練54基因工程的基本工具和基本操作程序一、選擇題1．(2024·湖南，5)某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是()A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶2．(2025·云南適應(yīng)性演練)Hv－Lv肽鏈是抗體與抗原識別并結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。為篩選特異性高、結(jié)合能力強的Hv－Lv肽鏈，將編碼Hv－Lv肽鏈的DNA片段與絲狀噬菌體固有外殼蛋白pVⅢ的基因連接并一起表達，最后用固定化抗原篩選(過程如圖)。下列說法錯誤的是()A．Hv－LvDNA片段上游需要設(shè)計并連接啟動子B．Hv－LvDNA片段上不需要連接標(biāo)記基因C．目標(biāo)是獲得能耐受多次沖洗的噬菌體D．實驗過程必須嚴格遵循生物防護措施3．(2022·山東，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)4．(2023·廣東，11)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色5．(2025·黃石模擬)如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結(jié)合，然后導(dǎo)入棉花細胞。下列操作不符合實驗?zāi)康氖?)A．用PCR技術(shù)可檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細胞中B．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞C．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA—ACA融合基因D．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確6．(2024·衡陽調(diào)研)當(dāng)蘋果削好皮或切開后放置一會兒，切口面的顏色就會由淺變深，最后變成深褐色。發(fā)生色變反應(yīng)主要是因為這些植物體內(nèi)存在著酚類化合物。酚類化合物易被氧化成醌類化合物，即發(fā)生變色反應(yīng)變成黃色，隨著反應(yīng)的量的增加顏色就逐漸加深，最后變成深褐色。氧化反應(yīng)的發(fā)生是由于與空氣中的氧接觸和細胞中酚氧化酶的釋放。如圖是培育抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果的過程，下列敘述不正確的是()A．要想獲得抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果，目的基因可選擇抑制酚氧化酶表達的基因B．實施步驟①是需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶的參與C．步驟④階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素和卡那霉素等物質(zhì)D．為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導(dǎo)入含pBI121質(zhì)粒的植株作對照二、非選擇題7．(16分)(2024·重慶，19)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關(guān)研究。(1)基因S啟動子的基本組成單位是____________。(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大豆品種YZ。根據(jù)題圖所示信息(不考慮未標(biāo)明序列)判斷構(gòu)建重組表達載體時，為保證目標(biāo)序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________________________________。(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準參照物外，還應(yīng)有________________________________________________________________________。經(jīng)驗證的重組表達載體需轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，檢測轉(zhuǎn)入是否成功的技術(shù)是______________。(4)用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ－1的種子變大。同時將從TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導(dǎo)入YZ，所得再生植株YZ－2的種子也變大，但小于YZ－1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是___________________________________________________________________________________________________________。8．(20分)(2024·貴州，21)研究者用以蔗糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌A的野生型(含NV基因)、突變體(NV基因突變)和轉(zhuǎn)基因菌株(轉(zhuǎn)入NV基因)，檢測三種菌株NV酶的生成與培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，結(jié)果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示無)。檢測用菌株蔗糖NV酶葡萄糖(培養(yǎng)液中)野生型＋＋＋野生型－－－突變體＋－－轉(zhuǎn)基因菌株＋＋＋回答下列問題：(1)據(jù)表可推測__________誘導(dǎo)了NV基因表達。NV酶的作用是____________________。檢測NV酶活性時，需測定的指標(biāo)是_______________________________________________________________________________________________________________(答出1點即可)。(2)表中突變體由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得。從野生型與突變體中分別提取基因組DNA作為模板，用與__________(填“T－DNA”或“NV基因”)配對的引物進行PCR擴增。若突變體擴增片段長度__________(填“>”“＝”或“<”)野生型擴增片段長度，則表明突變體構(gòu)建成功，從基因序列分析其原因是______________________________________________________________________________________________________。(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉(zhuǎn)基因菌株是將NV基因?qū)隷_________細胞獲得的。在構(gòu)建NV基因表達載體時，需要添加新的標(biāo)記基因，原因是_______________________________________________________________________________________________。9．(18分)(2025·四川適應(yīng)性演練)細菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP將特異性底物A蛋白磷酸化，改變A蛋白的活性從而應(yīng)答外界刺激，調(diào)控細菌的生長。研究者將Y基因(編碼蛋白激酶Y)與GFP基因(編碼綠色熒光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，導(dǎo)入載體，并表達出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，實驗過程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)Y基因含有735個堿基對(bp)，其編碼的肽鏈含有______個氨基酸。通過PCR分別擴增Y基因與GFP基因，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有______(填標(biāo)號)。a．模板b．引物c．DNA聚合酶d．反應(yīng)緩沖液(2)構(gòu)建Y基因與GFP基因的融合基因時，應(yīng)將Y基因中編碼終止密碼子的序列刪除，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)據(jù)圖步驟一分析，為確保Y－GFP基因插入載體后完整表達，在構(gòu)建重組基因表達載體時不能選擇EcoRⅠ限制酶，理由是_______________________________________________________________________________________________________________________。(4)為檢測Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP蛋白、A蛋白和ATP組合實驗，四組實驗的條件及電泳結(jié)果如圖步驟二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗體特異性識別。若Y－GFP蛋白有激酶活性，則后續(xù)實驗用磷酸化抗體檢測，能從電泳條帶檢測到信號的是________泳道(從泳道①～④中選填序號)，從Y－GFP蛋白功能角度分析，理由是_____________，利用表達的具有綠色熒光的Y－GFP蛋白還可開展的實驗有____________________(答出1個即可)。答案精析1．B[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，A正確；在酶切條件不合適時，可能會出現(xiàn)DNA完全沒有被酶切的情況，需要調(diào)整反應(yīng)條件如溫度、pH等，但調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；質(zhì)粒DNA突變可能會導(dǎo)致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應(yīng)更換為正常質(zhì)粒DNA，C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]2．C[啟動子位于基因的上游，是RNA聚合酶識別與結(jié)合的部位，可用于驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄，故Hv－LvDNA片段上游需要設(shè)計并連接啟動子，A正確；Hv－Lv肽鏈是抗體與抗原識別并結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，而Hv－LvDNA可表達出Hv－Lv肽鏈，該技術(shù)中Hv－LvDNA屬于目的基因，不需要連接標(biāo)記基因，B正確；結(jié)合題意可知，該過程目的是篩選特異性高、結(jié)合能力強的Hv－Lv肽鏈，C錯誤；實驗過程必須嚴格遵循生物防護措施，盡可能避免可能會帶來的安全問題，D正確。]3．B[離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確。]4．D[裂解是使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)，針對不同的實驗材料，可選擇不同的方法破壞細胞，如植物細胞可選擇研磨的方法，而動物細胞可選擇吸水漲破的方法，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的純度，C正確；將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘，待冷卻后，溶液能呈現(xiàn)藍色，D錯誤。]5．B[根據(jù)GNA－ACA融合基因的兩端序列設(shè)計合適的引物，可以利用PCR技術(shù)檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細胞的染色體DNA上，A正確；由于重組質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞，B錯誤；GNA和ACA基因均有BsaBⅠ酶切位點，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA－ACA融合基因，C正確；圖中質(zhì)粒與GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確，D正確。]6．B[褐變是細胞中的酚氧化酶催化酚類化合物變成黃色所致，故要想獲得抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果，可選擇抑制酚氧化酶表達的基因作為目的基因，A正確；步驟①是目的基因表達載體的構(gòu)建，該過程中需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的參與，B錯誤；步驟④是脫分化階段，該階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素(影響細胞的發(fā)育方向)和卡那霉素(將含有目的基因的細胞篩選出來)，C正確；為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導(dǎo)入不含目的基因質(zhì)粒的植株作對照，本實驗設(shè)計的目的是排除質(zhì)粒本身對實驗結(jié)果的影響，同時也能檢測導(dǎo)入目的基因的效果，D正確。]7．(1)脫氧核糖核苷酸(脫氧核苷酸)(2)EcoRⅠ酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環(huán)化；不能保證目標(biāo)片段與載體定向鏈接(反向鏈接)(3)酶切后的空載體片段，啟動子D＋基因S片段PCR(4)品種DN的基因S上游啟動子效應(yīng)比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大解析(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，用于驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄，是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，其基本組成單位是四種脫氧核糖核苷酸。(2)根據(jù)圖示信息可知，“啟動子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的識別序列，若使用限制酶EcoRⅠ，會使目的基因序列被破壞；根據(jù)圖中限制酶的識別序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端相同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA片段在構(gòu)建基因表達載體時，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，以及無法保證目的基因片段與載體片段單向連接，影響目的基因在受體細胞中的表達。(3)DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達載體酶切后的產(chǎn)物不僅有“啟動子D＋基因S”片段，還有酶切后的空載體片段，因此電泳時，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準參照物外，還應(yīng)有酶切后的空載體片段和“啟動子D＋基因S”片段；在分子水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入成功可通過PCR等技術(shù)檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(4)根據(jù)(4)題目信息可知，再生植株YZ－1導(dǎo)入的目的基因為取自品種DN的“啟動子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2導(dǎo)入的目的基因為取自品種TL的“啟動子T＋基因S”序列，結(jié)合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上游的啟動子D的效應(yīng)強于品種TL的啟動子T，啟動子D使基因S表達量更高，因而種子更大。8．(1)蔗糖參與蔗糖分解代謝，將蔗糖分解成葡萄糖單位時間內(nèi)葡萄糖的生成量(或蔗糖的減少量等)(2)NV基因＞突變體NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中堿基對增加而發(fā)生突變(3)突變體便于篩選出成功導(dǎo)入NV基因的細胞解析(1)根據(jù)表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培養(yǎng)基中會合成NV酶，不加蔗糖不會合成NV酶，推測蔗糖誘導(dǎo)了NV基因表達。分析表格可知，有NV酶時，菌株就能將蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能參與蔗糖的分解代謝過程。檢測NV酶活性時，需測定單位時間內(nèi)葡萄糖的生成量或蔗糖的減少量等。(2)從題目中可知，突變體是由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得的。在進行PCR擴增時，使用的引物需要與特定的DNA序列互補配對，才能啟動DNA的擴增。野生型菌株的基因組DNA中沒有T－DNA的插入，所以只有用與NV基因配對的引物進行擴增時，才可以擴增出兩種菌株的基因片段。突變體中的NV基因中插入了T－DNA序列，導(dǎo)致其堿基對增加，因此若突變體擴