ICS11.220CCSB4154西 藏 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB54/T0462—2025羊傳染性膿皰病診斷技術規(guī)范2025-05-10發(fā)布 2025-06-10實施西藏自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB54/T0462DB54/T0462—2025PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1生物安全措施 2臨床診斷 2病毒分離培養(yǎng) 3分子生物學診斷 4綜合判定 5附錄A（資料性） 相關癥狀圖片 6附錄B（資料性） 聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物電泳圖 9附錄C（資料性） 實時熒光定量PCR結果圖 10前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所提出。本文件由西藏農(nóng)業(yè)農(nóng)村標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所、云南農(nóng)業(yè)大學。本文件主要起草人：四朗玉珍、富國文、格桑卓嘎、班旦、樊月圓、拉巴次旦、吳金措姆。DB54/T0462DB54/T0462—2025PAGEPAGE1羊傳染性膿皰病診斷技術規(guī)范范圍求。本文件適用于羊傳染性膿皰病的診斷。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB19489 實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢NY/T3235 羊傳染性膿皰診斷技術術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1羊傳染性膿皰病ft性、嗜上皮性傳染病。3.2聚合酶鏈式反應英文全稱PolymeraseChainReaction，縮寫為PCR，由引物選擇性體外擴增DNA或RNA片段的檢測方法。3.3雙蒸水雙蒸水，是重蒸水的一種，是將經(jīng)過一次蒸餾后的水再次蒸餾所得到的水（二級水）。3.4聚合酶鏈式反應預混液英文名稱PCRMasterMix，PCR試驗時使用的預混物。3.5DNA標記物英文名稱DNAMarker，特定分子量大小的DNA片段混合物，用于估算樣品DNA分子量的大小。3.6熒光定量PCR探針法不發(fā)光；當DNA通過引物合成時，探針被折斷，釋放出發(fā)光基團和淬滅基團，兩個距離較遠，發(fā)光基團產(chǎn)生熒光，被機器收集到信號，從而檢測基因的量。3.7循環(huán)閾值也稱Ct值，在熒光定量PCR中，每個反應管內(nèi)的熒光信號量達到設定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。生物安全措施樣品采集及處理的生物安全措施按GB19489的規(guī)定執(zhí)行。臨床診斷流行病學綿羊和ft1月齡～6該病毒對其他反芻動物和人類也具有感染能力。一年四季均可發(fā)病，常呈群發(fā)性流行。自然放牧條件下，冬春季節(jié)多發(fā)。黏膜損傷處感染其他羊。臨床癥狀唇型最后破潰形成硬痂，癥狀見附錄A.1。蹄型皰、膿皰，破潰后形成潰瘍，癥狀見附錄A.2。外陰型潰瘍，癥狀見附錄A.3；公羊出現(xiàn)陰鞘腫脹、膿皰、潰瘍。乳房型乳房型表現(xiàn)為乳頭和乳房皮膚出現(xiàn)膿皰，后形成痂垢，癥狀見附錄A.4。其他類型為體溫升高大于39.5℃一的圓形或橢圓形膿皰，病理變化見附錄A.5。結果判斷根據(jù)臨床癥狀，可判定為羊傳染性膿皰病疑似病例。病毒分離培養(yǎng)病料采集、處理及運輸痂皮采集發(fā)病羊患處痂塊0.5g～1.031:制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2000IU/mL，置4℃冰箱過夜，3000r/min、離心l0min，取上清，當日不能送到實驗室診斷，則樣品于-20℃保存，再送檢，運輸中保證密封、低溫狀態(tài)。水泡液用無菌注射器抽取丘疹水泡液，置于含2倍體積無菌生理鹽水中的滅菌離心管中，加青霉素、鏈霉素各2000IU/mL，3000r/min離心l0min，取上清，當日不能送到實驗室診斷，則樣品于-20再送檢，運輸中保證密封、低溫狀態(tài)。主要儀器設備高速冷凍離心機、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、透射電子顯微鏡、紫外燈、冰箱、可調(diào)微量移液器20μL～200μL、200μL～1000μL。試劑耗材細胞培養(yǎng)液（含DMEM細胞培養(yǎng)液90%、胎牛血清10%、青霉素100IU/mL和鏈霉素100mg/mL構成）、（含DMEM細胞培養(yǎng)液98%2%100IU/mL和鏈霉素100mg/mL構成25cm2細胞培養(yǎng)瓶、0.22μm濾器、15ml離心管、濾紙、碳支持膜銅網(wǎng)、2%磷鎢酸、無菌移液器槍頭20μL～200μL、200μL～1000μL。細胞制備犢牛睪丸原代細胞、犢牛腎原代細胞或羊皮膚細胞任一種，制備方法參照NY/T3235執(zhí)行。細胞處理方法待6.4中的細胞長成良好的單層后，倒掉細胞培養(yǎng)液。將6.1.1或6.1.2中病料處理液用0.22μm濾器過濾，取1ml接種于細胞表面，37℃吸附1h。吸出病料處理液，加入細胞維持液4mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將出現(xiàn)病變的細胞與培養(yǎng)液一起反復凍融3次，吸出，置于15ml離心管中，3000rpm離心30min，min～5min2%2min～3min后用濾紙吸去多余液體，室溫放置干燥，置于透射電子顯微鏡下觀察。判定每天觀察細胞變化，連續(xù)觀察5d。如6.4中細胞在接種后1d～5d內(nèi)出現(xiàn)變圓、腫脹、間質(zhì)增寬、折光性增強、團聚、脫落等細胞病變，于透射電子顯微鏡下觀察到橢圓形病毒粒子，長250nm～280nm，寬170nm～200nm，判為病毒分離陽性。盲傳3代無細胞病變，則判為病毒分離陰性。分子生物學診斷DNA取6.1.1或6.1.2的痂皮或水泡液處理上清液，使用病毒DNA提取試劑盒提取核酸，操作步驟按照病毒DNA提取試劑盒說明書進行。PCR主要儀器設備生物安全柜、高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、旋渦混合振蕩器、電腦、冰箱、微波爐、微量移液器2μL～20μL、0.5μL～10μL。試劑耗材雙蒸水、PCRMasterMix、電泳緩沖液、DNAMarker、瓊脂糖、PCR反應管、無菌移液器吸頭。引物PCR引物序列如下：——上游引物：5'-GAGGGCGTCGACATCACG-3'；——下游引物：5'-CCGGCACCATCGAGAGCA-3'。使用時配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存。反應體系與反應程序按25μL體系配制。取7.1中樣品DNA1μL、PCRMasterMix12.5μl、7.2.3中上下游引物各1μl、ddH2O9.5μl。反應程序：95℃預變性4min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃伸10min。電泳檢測制備1.5%電泳瓊脂糖凝膠，取5μl~8μl樣品PCR及DNAMarker，于1×TAE電泳緩沖液中進行電泳，凝膠成像儀觀察結果。結果分析與判定陽性對照、樣品PCR擴增產(chǎn)物與預期片段大小一致，在505bp附近有明亮條帶，同時陰性對照無條帶，判定為陽性，參見附錄B。樣品PCR擴增產(chǎn)物測序后Blast比對結果為羊傳染性膿皰病毒B2L基因，判定結果為陽性。PCR（探針法）主要儀器設備超凈工作臺、高速冷凍離心機、熒光定量PCR儀、旋渦混合振蕩器、電腦、冰箱、微量移液器2μL～20μL、0.5μL～10μL。試劑耗材雙蒸水、2×qPCRProbeMasterMix、Eppendorf管、熒光定量PCR反應管、無菌移液器槍頭。引物與探針熒光定量PCR引物及探針序列如下：——上游引物：5'-GGGGCGGCGTATTCTTCT-3'；——下游引物：5'-GCTGTTCTTGGCGTTCTCG-3'；——TaqMan探針（FAM）5'-ATCGTGCGGTAGAAGCCCAG-3'（BHQ1）。使用時配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存。反應體系與反應條件以病毒DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增。按25μl體系配制：ddH2O8.5μl、7.3.3中上下游引物各0.4μl、TaqMan探針0.2μl、7.1中樣品DNA0.5μl、2×qPCRProbeMasterMix10μl。反應程序：37℃污染消化2min；95℃預變性5min，95℃退火10s，60℃延伸30s，45個循環(huán)。結果分析與判定并出現(xiàn)特定的擴增曲線，參見附錄C。如陰性對照和陽性對照條件不滿足以上條件，此試驗視為無效。無CtCt值Ct值綜合判定附 錄 A（資料性）相關癥狀圖片口唇型：口唇處出現(xiàn)大小不等的疣狀增生蹄型：蹄部出現(xiàn)桑葚樣增生外陰型：外陰部出現(xiàn)大