Brd3蛋白在病毒與LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景天然免疫系統(tǒng)作為機(jī)體識(shí)別“非我”、抵御病原體入侵的第一道防線，在維護(hù)機(jī)體健康中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)細(xì)菌、病毒等病原體入侵機(jī)體時(shí)，天然免疫系統(tǒng)能夠迅速感知并做出反應(yīng)，通過(guò)模式識(shí)別受體（Patternrecognitionreceptors，PRRs）識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），進(jìn)而啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。這些免疫分子的釋放，有助于激活免疫細(xì)胞、增強(qiáng)免疫防御能力，從而有效地識(shí)別和清除病原體，保護(hù)機(jī)體免受感染。Ⅰ型干擾素是一類具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，包括IFN-α、IFN-β等多個(gè)亞型。其中，IFN-β由Ifnb基因編碼產(chǎn)生，在抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí)，IFN-β能夠迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生，并通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes，ISGs）的表達(dá)，從而發(fā)揮廣譜的抗病毒作用。此外，IFN-β還參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生受到細(xì)胞內(nèi)多種分子的共同調(diào)控，形成了一個(gè)復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些調(diào)控分子包括干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferonregulatoryfactors，IRFs）、共活化因子（co-activator）、組蛋白修飾酶等。IRFs是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并結(jié)合到Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，從而啟動(dòng)IFN-β的轉(zhuǎn)錄。共活化因子則通過(guò)與IRFs相互作用，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白修飾酶則通過(guò)對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾，影響基因的轉(zhuǎn)錄效率。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)協(xié)同作用，共同實(shí)現(xiàn)對(duì)Ifnb基因轉(zhuǎn)錄的精密調(diào)控。盡管目前對(duì)Ⅰ型干擾素的調(diào)控機(jī)制有了一定的了解，但仍存在許多未知之處。尤其是在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，尤其是表觀修飾相關(guān)的調(diào)控機(jī)制方面，還知之甚少。表觀修飾是指在不改變DNA序列的情況下，對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行的修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。這些修飾能夠影響基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)的研究表明，表觀修飾在Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生中也起著重要的調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。深入研究Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于我們更好地理解天然免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，還為開發(fā)新型的抗病毒藥物和免疫治療策略提供理論基礎(chǔ)。1.2Brd3蛋白與天然免疫應(yīng)答研究現(xiàn)狀Brd3，即含溴域蛋白3（Bromodomaincontainingprotein3），是BET（Bromodomainandextraterminalmotifproteins）蛋白質(zhì)家族的重要成員。BET蛋白作為一類關(guān)鍵的表觀調(diào)控分子，在多種細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。它們能夠作為骨架蛋白，招募不同的蛋白質(zhì)至轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程；參與細(xì)胞周期的調(diào)控，確保細(xì)胞增殖和分化的正常進(jìn)行；還能結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄分子，精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。近年來(lái)，隨著對(duì)BET蛋白研究的不斷深入，一些研究發(fā)現(xiàn)BET家族成員Brd4能夠與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合，并對(duì)NF-κB目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控。NF-κB是天然免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的激活能夠誘導(dǎo)一系列促炎細(xì)胞因子和免疫相關(guān)基因的表達(dá)，在機(jī)體抵御病原體入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Brd4與NF-κB的相互作用，提示BET蛋白可能在天然免疫反應(yīng)中扮演著重要角色，這為深入研究天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制提供了新的方向和思路。我們前期利用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在VSV（水泡性口炎病毒）刺激的巨噬細(xì)胞中，Brd3的表達(dá)水平下降了近2倍。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，能夠識(shí)別和吞噬病原體，并分泌多種細(xì)胞因子和免疫分子，在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Brd3在VSV刺激的巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平的顯著變化，強(qiáng)烈提示Brd3可能參與了病毒觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答。然而，目前關(guān)于Brd3參與病毒及LPS（脂多糖，一種細(xì)菌內(nèi)毒素，常被用于觸發(fā)炎癥反應(yīng)和模擬細(xì)菌感染）觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答的研究還相對(duì)較少，其具體的調(diào)控作用和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。深入研究Brd3在天然免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，不僅有助于我們更好地理解天然免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可能為開發(fā)新型的抗病毒和抗感染治療策略提供理論依據(jù)。1.3研究目的和意義本研究旨在深入探討B(tài)rd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用及分子機(jī)制。通過(guò)對(duì)這一領(lǐng)域的研究，有望揭示Brd3在天然免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，為深入理解天然免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的視角。Brd3作為BET蛋白家族的重要成員，在多種細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。然而，其在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的具體作用和機(jī)制尚未完全明確。本研究將通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地研究Brd3在天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用，包括對(duì)促炎細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的影響，以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。在病毒感染方面，隨著全球范圍內(nèi)病毒感染性疾病的頻繁爆發(fā)，如流感病毒、新冠病毒等，對(duì)病毒感染機(jī)制和防治策略的研究顯得尤為重要。深入了解Brd3在病毒觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，有助于我們揭示病毒感染與宿主免疫之間的相互作用關(guān)系，為開發(fā)新型的抗病毒藥物和治療策略提供理論依據(jù)。例如，如果能夠明確Brd3在病毒感染過(guò)程中對(duì)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制，就有可能通過(guò)調(diào)節(jié)Brd3的功能來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療病毒感染性疾病的目的。在細(xì)菌感染方面，LPS作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠觸發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。研究Brd3在LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的作用，對(duì)于深入理解細(xì)菌感染的發(fā)病機(jī)制和治療策略具有重要意義。例如，通過(guò)研究Brd3對(duì)LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控作用，我們可以更好地了解炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)治療細(xì)菌感染相關(guān)炎癥性疾病的藥物提供新的靶點(diǎn)。本研究對(duì)于豐富天然免疫應(yīng)答的理論體系具有重要意義。通過(guò)揭示Brd3在天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用及分子機(jī)制，我們可以進(jìn)一步完善對(duì)天然免疫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為深入研究其他免疫相關(guān)分子的功能提供參考。本研究還可能為開發(fā)新型的免疫治療策略提供理論基礎(chǔ)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、Brd3對(duì)病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控作用研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的6-8周齡C57BL/6小鼠，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。2.1.2細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)選用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]。RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。傳代時(shí)，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后按1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中。2.1.3病毒與LPS水泡性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus，VSV）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，來(lái)自大腸桿菌O111:B4）購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]。VSV在使用前用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，LPS則用無(wú)菌PBS（PhosphateBufferedSaline）配制成1mg/mL的儲(chǔ)存液，分裝后于-20℃保存，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求稀釋至相應(yīng)濃度。2.1.4主要試劑與抗體DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自[品牌名稱1]；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix購(gòu)自[品牌名稱2]；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒購(gòu)自[品牌名稱3]；PVDF膜購(gòu)自[品牌名稱4]；一抗Brd3抗體、β-actin抗體、IRF3抗體、p65抗體、p-IRF3抗體、p-p65抗體購(gòu)自[品牌名稱5]，二抗山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自[品牌名稱6]；CRISPR-CAS9敲除試劑盒購(gòu)自[品牌名稱7]。所有試劑均按照說(shuō)明書進(jìn)行儲(chǔ)存和使用。2.1.5Q-PCR實(shí)驗(yàn)首先，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞或組織中的總RNA。按照試劑說(shuō)明書操作，將細(xì)胞或組織樣品加入TRIzol試劑中，充分裂解后，加入氯仿進(jìn)行分層，離心后取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗滌后晾干，用適量的DEPC水溶解RNA。然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板，在特定的溫度條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。接著，以cDNA為模板進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物和cDNA模板。引物序列根據(jù)目的基因（Brd3、TNF-α、IL-6、IFN-β等）設(shè)計(jì)，由[引物合成公司名稱]合成。Q-PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。最后，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。2.1.6Westernblot實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞或組織樣品，加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解30min，期間不斷振蕩。然后，12000rpm離心15min，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳分離。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，通常使用10%-12%的分離膠。電泳條件為：濃縮膠80V，分離膠120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以阻斷非特異性結(jié)合。然后，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST（TrisBufferedSalinewithTween-20）洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。2.1.7CRISPR-CAS9技術(shù)構(gòu)建Brd3敲除細(xì)胞系根據(jù)Brd3基因序列，使用在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)針對(duì)Brd3基因的sgRNA序列。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列克隆到CRISPR-CAS9載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選7-10天，獲得穩(wěn)定敲除Brd3基因的細(xì)胞克隆。通過(guò)基因組PCR和測(cè)序驗(yàn)證Brd3基因的敲除情況。提取細(xì)胞基因組DNA，使用針對(duì)Brd3基因敲除位點(diǎn)兩側(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與野生型Brd3基因序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)Brd3基因是否成功敲除。篩選出Brd3基因敲除效率高的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Q-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠組織器官和免疫細(xì)胞中Brd3分子的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Brd3分子廣泛表達(dá)于小鼠的脾臟、胸腺、肝臟、肺臟等免疫器官，以及巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中（圖1A）。這表明Brd3在小鼠的免疫系統(tǒng)中具有廣泛的分布，暗示其可能在免疫相關(guān)的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨后，采用Q-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)，研究病毒及LPS刺激對(duì)Brd3表達(dá)的影響。將RAW264.7細(xì)胞分別用VSV和LPS進(jìn)行刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、2h、4h、6h、8h）收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)。Q-PCR結(jié)果顯示，在VSV刺激后2h，Brd3的mRNA表達(dá)水平開始下降，4h時(shí)顯著降低，至8h仍維持在較低水平（圖1B）。Westernblot結(jié)果也表明，Brd3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平在VSV刺激后同樣呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)（圖1C）。在LPS刺激下，Brd3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平也在刺激后2h開始下降，4h時(shí)下降顯著，8h時(shí)表達(dá)量仍處于較低狀態(tài)（圖1D、E）。這些結(jié)果表明，病毒及LPS刺激能夠顯著下調(diào)Brd3的表達(dá)，且這種下調(diào)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有體現(xiàn)。利用CRISPR-CAS9技術(shù)成功構(gòu)建了Brd3敲除的RAW264.7細(xì)胞系。通過(guò)基因組PCR和測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)Brd3基因在該細(xì)胞系中成功敲除（圖1F）。將Brd3敲除的RAW264.7細(xì)胞系和正常表達(dá)Brd3的對(duì)照細(xì)胞，分別用VSV和LPS刺激，在刺激后6h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和Ⅰ型干擾素IFN-β的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Brd3敲除的細(xì)胞中，病毒及LPS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生相比于對(duì)照細(xì)胞顯著減少（圖1G），IL-6的表達(dá)水平有輕微降低（圖1H），而TNF-α的表達(dá)在兩組之間沒(méi)有明顯差異（圖1I）。這表明Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中，對(duì)Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，對(duì)IL-6的產(chǎn)生也有一定影響，但對(duì)TNF-α的表達(dá)影響不大。2.3結(jié)果討論Brd3分子在小鼠的免疫器官和免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，這表明Brd3可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要且基礎(chǔ)的作用。廣泛的表達(dá)模式暗示Brd3可能參與多種免疫相關(guān)的生理過(guò)程，可能在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能維持中扮演重要角色，也可能在不同免疫細(xì)胞之間的相互作用以及免疫應(yīng)答的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在病毒及LPS刺激后，Brd3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降，這一現(xiàn)象暗示Brd3在天然免疫應(yīng)答過(guò)程中可能作為一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)分子發(fā)揮作用。這種下調(diào)可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)病原體入侵的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)病毒或細(xì)菌等病原體入侵時(shí)，機(jī)體通過(guò)降低Brd3的表達(dá)，可能是為了調(diào)整細(xì)胞內(nèi)的分子網(wǎng)絡(luò)，以更好地適應(yīng)免疫應(yīng)答的需求，為啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)創(chuàng)造條件。Brd3表達(dá)的下調(diào)可能是免疫細(xì)胞對(duì)病原體刺激的一種特異性反應(yīng)，通過(guò)改變Brd3的表達(dá)水平，細(xì)胞可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)免疫防御機(jī)制。在Brd3敲除的細(xì)胞中，病毒及LPS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生顯著減少，IL-6的表達(dá)水平有輕微降低，而TNF-α的表達(dá)沒(méi)有差異。這一結(jié)果表明Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中，對(duì)Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生具有重要的促進(jìn)作用。IFN-β在抗病毒感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Brd3對(duì)IFN-β產(chǎn)生的促進(jìn)作用提示，Brd3可能是抗病毒免疫應(yīng)答中的一個(gè)重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)。通過(guò)促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生，Brd3有助于增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力，幫助機(jī)體更好地抵御病毒感染。對(duì)于IL-6表達(dá)水平的輕微降低，說(shuō)明Brd3對(duì)IL-6的產(chǎn)生也有一定的調(diào)控作用，但這種作用相對(duì)較弱。而TNF-α的表達(dá)不受Brd3敲除的影響，表明Brd3在調(diào)控TNF-α表達(dá)方面可能并不起主要作用，TNF-α的表達(dá)可能受到其他更為關(guān)鍵的分子或信號(hào)通路的調(diào)控。三、Brd3促進(jìn)病毒及LPS誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞與培養(yǎng)條件選用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，該細(xì)胞系購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:3-1:5。3.1.2主要試劑與抗體DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自[品牌名稱1]；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒購(gòu)自[品牌名稱2]；PVDF膜購(gòu)自[品牌名稱3]；一抗Brd3抗體、IRF3抗體、p300抗體、β-actin抗體購(gòu)自[品牌名稱4]，二抗山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自[品牌名稱5]；ProteinA/G瓊脂糖微珠購(gòu)自[品牌名稱6]；ChIP試劑盒購(gòu)自[品牌名稱7]。所有試劑均嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行儲(chǔ)存和使用。3.1.3蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot，WB）實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕柔振蕩，使細(xì)胞充分裂解。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將樣品與5×SDS上樣緩沖液按比例混合，100℃煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。制備合適濃度的SDS凝膠，通常根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇10%-12%的分離膠。將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，進(jìn)行電泳分離。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30分鐘左右，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮；分離膠120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)在分離膠中得到有效分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2小時(shí)，確保蛋白質(zhì)充分轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗的稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST（TrisBufferedSalinewithTween-20）洗滌膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。然后將膜放入含有相應(yīng)二抗的稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物對(duì)膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。3.1.4免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。取適量上清液，加入相應(yīng)的抗體（如Brd3抗體、IRF3抗體、p300抗體等），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，使抗體與目標(biāo)蛋白形成免疫復(fù)合物。次日，加入適量ProteinA/G瓊脂糖微珠，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2小時(shí)，使免疫復(fù)合物與微珠結(jié)合。然后在4℃條件下，3000rpm離心2分鐘，棄上清液。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如含1%TritonX-100的PBS）洗滌微珠-免疫復(fù)合物沉淀3-5次，每次洗滌后均在4℃條件下3000rpm離心2分鐘，棄上清液，以去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。最后，向沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)變性并從微珠上洗脫下來(lái)。將洗脫液進(jìn)行SDS凝膠電泳和Westernblot檢測(cè)，分析與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。3.1.5染色質(zhì)免疫沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）實(shí)驗(yàn)采用ChIP試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行刺激處理（如病毒感染或LPS刺激）。刺激結(jié)束后，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入甲醛，使終濃度為1%，室溫孵育10分鐘，進(jìn)行細(xì)胞交聯(lián)，使蛋白質(zhì)與DNA之間形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。然后加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)，甘氨酸終濃度為0.125M，室溫孵育5分鐘。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上孵育10分鐘，裂解細(xì)胞。然后通過(guò)超聲破碎儀將染色質(zhì)片段化，超聲條件需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化，一般為40%功率，0.7秒沖擊，1.3秒間隙，超聲時(shí)間根據(jù)細(xì)胞數(shù)而定，以獲得長(zhǎng)度約為200-1000bp的染色質(zhì)片段。4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，加入相應(yīng)的抗體（如IRF3抗體、p300抗體等），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，使抗體與目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物結(jié)合。次日，加入ProteinA/G瓊脂糖微珠，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2小時(shí)，使抗體-目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物與微珠結(jié)合。用洗滌緩沖液（如低鹽洗滌液、高鹽洗滌液、LiCl洗滌液和TE緩沖液）依次洗滌微珠-免疫復(fù)合物沉淀，每次洗滌后均在4℃條件下3000rpm離心2分鐘，棄上清液，以去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。最后，加入洗脫緩沖液，65℃孵育2小時(shí)，解交聯(lián)，使DNA與蛋白質(zhì)分離。然后用蛋白酶K處理樣品，消化蛋白質(zhì)，最后通過(guò)酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法提取DNA。提取的DNA可用于后續(xù)的PCR分析或高通量測(cè)序分析。PCR分析時(shí)，根據(jù)Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行半定量PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR，檢測(cè)目標(biāo)DNA片段的富集情況，以確定IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集情況；高通量測(cè)序分析時(shí)，將DNA樣品進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析確定與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)對(duì)調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路進(jìn)行篩選，以確定Brd3是否影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)位入核。將RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組用VSV刺激4h，對(duì)照組不做處理。提取兩組細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白，進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在Brd3正常表達(dá)和Brd3敲除的細(xì)胞中，IRF3和p65在細(xì)胞核中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異（圖2A、B）。這表明Brd3不影響轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65轉(zhuǎn)位入核，其對(duì)IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控作用可能并非通過(guò)影響這些轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了探究Brd3是否與轉(zhuǎn)錄因子IRF3以及共活化分子p300存在相互作用，采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。將RAW264.7細(xì)胞裂解后，取細(xì)胞裂解液，分別加入Brd3抗體、IRF3抗體、p300抗體進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉淀復(fù)合物中的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Brd3能夠與IRF3結(jié)合（圖2C），也能夠與p300結(jié)合（圖2D）。這表明Brd3與轉(zhuǎn)錄因子IRF3、共活化分子p300之間存在直接的相互作用，它們可能在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)復(fù)合物，共同參與對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。為了進(jìn)一步研究Brd3對(duì)IRF3與p300相互作用的影響，在RAW264.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Brd3，然后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染Brd3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，用VSV刺激細(xì)胞4h，然后裂解細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，使用IRF3抗體進(jìn)行沉淀，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉淀復(fù)合物中p300的表達(dá)。結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)Brd3的細(xì)胞中，IRF3與p300的結(jié)合明顯增強(qiáng)（圖2E）。這說(shuō)明Brd3能夠促進(jìn)IRF3與p300的相互作用，提示它們?nèi)呖赡茏鳛橐粋€(gè)復(fù)合物共同調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。利用過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究Brd3對(duì)p300介導(dǎo)的IRF3乙?；揎椀挠绊憽AW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組、p300過(guò)表達(dá)組、Brd3過(guò)表達(dá)組以及Brd3和p300共過(guò)表達(dá)組。分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，用VSV刺激細(xì)胞4h，然后裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，使用乙?；疘RF3抗體檢測(cè)IRF3的乙?；?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在p300過(guò)表達(dá)組中，IRF3的乙酰化水平有所增加；而在Brd3和p300共過(guò)表達(dá)組中，IRF3的乙?；斤@著提高（圖2F）。這表明Brd3能促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3的乙酰化修飾，進(jìn)一步說(shuō)明Brd3在調(diào)節(jié)IRF3相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Brd3對(duì)IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)募集的影響。將RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組和Brd3敲除組，用VSV刺激兩組細(xì)胞4h，然后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。分別使用IRF3抗體和p300抗體進(jìn)行免疫沉淀，提取沉淀的DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的片段，進(jìn)行半定量PCR分析。結(jié)果顯示，在Brd3敲除的細(xì)胞中，IRF3和p300向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集相比于對(duì)照細(xì)胞顯著降低（圖2G、H）。這表明Brd3對(duì)于IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集是必需的，Brd3的缺失會(huì)影響這兩個(gè)關(guān)鍵分子在基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集，進(jìn)而影響Ifnb基因的轉(zhuǎn)錄激活。利用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3和H4的乙?；癄顟B(tài)。將RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組和Brd3敲除組，用VSV刺激4h后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，使用乙?；M蛋白H3抗體和乙酰化組蛋白H4抗體進(jìn)行免疫沉淀，提取沉淀的DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的片段，進(jìn)行半定量PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Brd3敲除的細(xì)胞中，組蛋白H3和H4的乙酰化水平明顯下降（圖2I、J）。這表明Brd3能夠影響Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白乙?；癄顟B(tài)，Brd3的缺失會(huì)導(dǎo)致組蛋白乙?；浇档?，從而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄活性。3.3結(jié)果討論Brd3不影響轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65轉(zhuǎn)位入核，這表明Brd3對(duì)IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控作用并非通過(guò)經(jīng)典的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位途徑實(shí)現(xiàn)。通常，轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位是基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵步驟，許多調(diào)控分子通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。但在本研究中，Brd3的缺失或存在不影響IRF3和p65進(jìn)入細(xì)胞核，這提示Brd3可能通過(guò)其他更為精細(xì)的機(jī)制來(lái)調(diào)控IFN-β的轉(zhuǎn)錄。這也表明在IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，存在多條并行且相互協(xié)調(diào)的調(diào)控途徑，Brd3所參與的調(diào)控途徑獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位這一環(huán)節(jié)。Brd3能夠與轉(zhuǎn)錄因子IRF3、共活化分子p300結(jié)合，并且促進(jìn)IRF3與p300相互作用，這一結(jié)果揭示了Brd3在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要作用機(jī)制。Brd3可能作為一個(gè)關(guān)鍵的橋梁分子，將轉(zhuǎn)錄因子IRF3和共活化分子p300招募到一起，形成一個(gè)具有特定功能的復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成可能改變了IRF3和p300的空間構(gòu)象，或者影響了它們與其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)分子的相互作用，從而增強(qiáng)了它們對(duì)Ifnb基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能力。IRF3作為調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并結(jié)合到Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列；p300作為共活化分子，具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠通過(guò)對(duì)組蛋白的乙酰化修飾來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。Brd3的存在促進(jìn)了IRF3與p300的相互作用，可能使得它們?cè)贗fnb基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合更加穩(wěn)定，從而增強(qiáng)了Ifnb基因的轉(zhuǎn)錄激活。Brd3能促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3的乙?；揎棧@進(jìn)一步說(shuō)明了Brd3在調(diào)節(jié)IRF3相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。乙酰化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠影響蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用。在IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控過(guò)程中，IRF3的乙?；揎椏赡茉鰪?qiáng)了其轉(zhuǎn)錄激活能力。Brd3通過(guò)促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3乙?；揎?，可能是通過(guò)增強(qiáng)p300與IRF3的相互作用，或者改變p300的酶活性，使得更多的IRF3被乙?；揎棧瑥亩岣吡薎RF3對(duì)Ifnb基因轉(zhuǎn)錄的激活能力。這種修飾作用可能是Brd3調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一，通過(guò)對(duì)IRF3的修飾，Brd3在轉(zhuǎn)錄水平上精細(xì)地調(diào)節(jié)了IFN-β的表達(dá)。Brd3對(duì)于IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集是必需的。在Brd3敲除的細(xì)胞中，IRF3和p300向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集顯著降低，這表明Brd3在招募這些關(guān)鍵分子到基因啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)程中起著不可或缺的作用。Brd3可能通過(guò)與IRF3和p300形成復(fù)合物，引導(dǎo)它們準(zhǔn)確地定位到Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。Brd3可能通過(guò)其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與染色質(zhì)上的特定區(qū)域結(jié)合，為IRF3和p300的募集提供了一個(gè)平臺(tái)，使得它們能夠有效地結(jié)合到Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)IFN-β的轉(zhuǎn)錄。Brd3的缺失導(dǎo)致IRF3和p300無(wú)法有效地募集到Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)，從而影響了Ifnb基因的轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致IFN-β的產(chǎn)生減少。Brd3能夠影響Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白乙酰化狀態(tài)，Brd3的缺失會(huì)導(dǎo)致組蛋白H3和H4的乙?；浇档汀＝M蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳修飾，能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因的可及性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。Brd3通過(guò)促進(jìn)IRF3與p300的相互作用以及它們?cè)贗fnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集，可能間接影響了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在該區(qū)域的活性，從而導(dǎo)致組蛋白H3和H4的乙酰化水平升高，促進(jìn)了Ifnb基因的轉(zhuǎn)錄。Brd3的缺失使得p300無(wú)法有效地發(fā)揮其組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致組蛋白乙酰化水平降低，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，Ifnb基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，最終導(dǎo)致IFN-β的產(chǎn)生減少。四、研究結(jié)論與展望4.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用及機(jī)制展開，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，取得了以下重要研究成果。在Brd3對(duì)病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控作用研究中，發(fā)現(xiàn)Brd3分子廣泛表達(dá)于小鼠的免疫器官和免疫細(xì)胞，提示其在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的功能基礎(chǔ)。病毒及LPS刺激能夠顯著下調(diào)Brd3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，這種下調(diào)可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)病原體入侵的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制。利用CRISPR-CAS9技術(shù)構(gòu)建Brd3敲除的RAW264.7細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)Brd3敲除的細(xì)胞中，病毒及LPS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生顯著減少，IL-6的表達(dá)水平有輕微降低，而TNF-α的表達(dá)沒(méi)有差異。這表明Brd3參與了病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答，且能促進(jìn)Ⅰ型干擾素IFN-β的產(chǎn)生，對(duì)IL-6的產(chǎn)生也有一定影響。在Brd3促進(jìn)病毒及LPS誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)Brd3不影響轉(zhuǎn)錄因子IRF3、p65轉(zhuǎn)位入核，其對(duì)IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控作用并非通過(guò)經(jīng)典的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位途徑實(shí)現(xiàn)。Brd3能夠與轉(zhuǎn)錄因子IRF3、共活化分子p300結(jié)合，并且促進(jìn)IRF3與p300相互作用，它們?nèi)呖赡茏鳛橐粋€(gè)復(fù)合物共同調(diào)控對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄。Brd3能促進(jìn)p300介導(dǎo)的IRF3的乙?；揎棧@進(jìn)一步增強(qiáng)了IRF3的轉(zhuǎn)錄激活能力。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，Brd3對(duì)于IRF3和p300在Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集是必需的，Brd3的缺失會(huì)導(dǎo)致IRF3和p300向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)的募集顯著降低，同時(shí)Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3和H4的乙?；矫黠@下降，從而影響IFN-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究揭示了Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的重要調(diào)控作用及其分子機(jī)制。Brd3通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IRF3與共活化分子p300相互作用，并招募IRF3/p300復(fù)合物向Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)IFN-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。4.2研究的局限性與未來(lái)研究方向盡管本研究取得了上述重要成果，但仍存在一定的局限性。在機(jī)制研究深度方面，雖然揭示了Brd3通過(guò)促進(jìn)IRF3與p300相互作用及募集復(fù)合物至Ifnb基因啟動(dòng)子區(qū)來(lái)促進(jìn)IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制，但對(duì)于Brd3自身的修飾以及這些修飾如何影響其與IRF3和p300的相互作用，尚未進(jìn)行深入探究。Brd3是否存在其他翻譯后修飾，如磷酸化、甲基化等，這些修飾是否會(huì)改變Brd3的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響其在天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用，都有待進(jìn)一步研究。對(duì)于Brd3在復(fù)合物中的具體作用機(jī)制，例如Brd3如何精確地促進(jìn)IRF3與p300的相互作用，以及這種相互作用如何被其他細(xì)胞內(nèi)信號(hào)所調(diào)節(jié)，目前的研究還不夠深入，需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。從研究對(duì)象廣度來(lái)看，本研究主要集中在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中，對(duì)于Brd3在其他免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等中的作用，尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。不同免疫細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不同的功能，Brd3在這些細(xì)胞中的作用機(jī)制可能存在差異。在T淋巴細(xì)胞中，Brd3可能通過(guò)不同的信號(hào)通路和分子機(jī)制來(lái)調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的活化，這些都需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。本研究?jī)H探討了Brd3在病毒及LPS觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中的作用，對(duì)于其他病原體，如真菌、寄生蟲等觸發(fā)的免疫應(yīng)答，Brd3是否參與以及如何參與其中，目前尚不清楚。未來(lái)的研究可以從以下幾個(gè)方向展開。深入研究Brd3在不同細(xì)胞類型中的作用，包括各種免疫細(xì)胞以及非免疫細(xì)胞，全面了解Brd3在免疫系統(tǒng)中的功能?？梢岳没蚓庉嫾夹g(shù)，構(gòu)建不同細(xì)胞類型中Brd3敲除或過(guò)表達(dá)的動(dòng)物模型，研究Brd3對(duì)不同細(xì)胞功能和免疫應(yīng)答的影響。進(jìn)一步探索Brd3與其他信號(hào)通路的交互作用，例如與NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等的相互關(guān)系，以揭示Brd3在復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的地位和作用。可以通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，全面分析Brd3調(diào)控的基因和信號(hào)通路，深入了解其在天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制。還可以研究Brd3在其他病原體感染模型中的作用，拓展對(duì)Brd3在天然免疫應(yīng)答中作用的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)新型的抗感染治療策略提供更多的理論依據(jù)。五、參考文獻(xiàn)[1]ZengL,ZhouMM.Bromodomain:anacetyl-lysinebindingdomain[J].FEBSL