Cre-loxP基因編輯系統(tǒng)基因敲除、基因重組的新方案刪除倒轉(zhuǎn)易位互換一、Cre/loxP系統(tǒng)是來(lái)源于P1噬菌體的高效重組系統(tǒng)。由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼的特異性酶，能夠特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)，并發(fā)揮重組酶活性或限制酶活性從而重組或刪除loxP片段間的基因。Cre重組酶LoxP基因位點(diǎn)34個(gè)堿基的一段DNA序列，具有方向性，有多種類(lèi)型突變。中間8bp序列可變，能決定方向性和突變類(lèi)型；兩端具有13個(gè)反向重復(fù)序列，是Cre酶特異性識(shí)別的位點(diǎn)。13bp13bp8bp二、Cre/loxP系統(tǒng)的作用方式刪除loxP位點(diǎn)在一條染色體上且同向，兩個(gè)loxP位點(diǎn)環(huán)化，導(dǎo)致中間位點(diǎn)缺失。loxPloxPgenegeneloxPloxPCre酶loxPgeneloxP+二、Cre/loxP系統(tǒng)的作用方式倒轉(zhuǎn)兩個(gè)loxP位點(diǎn)在同一個(gè)染色體上方向相反，中間基因倒轉(zhuǎn)?？梢苑磸?fù)倒轉(zhuǎn)。loxPloxPgeneloxPloxPgeneCre酶二、Cre/loxP系統(tǒng)的作用方式易位loxP位點(diǎn)在兩條染色體上，且方向相同，可以導(dǎo)致染色體部分易位。loxPCre酶loxPloxPloxP二、Cre/loxP系統(tǒng)的作用方式互換四個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩個(gè)DNA或染色體上，Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列互換。loxPCre酶loxPloxPloxPloxPloxPloxPloxP三、Cre/loxP系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值控制Cre基因在特定時(shí)空表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)特定時(shí)空下的基因刪除或重組。①讓轉(zhuǎn)基因小鼠在成長(zhǎng)到特定時(shí)間后進(jìn)行目標(biāo)基因的敲除，避免了轉(zhuǎn)基因小鼠的過(guò)早的死亡。②可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在特定的組織中被敲除或重組。③在轉(zhuǎn)基因植物中的特定組織中將轉(zhuǎn)入的基因刪除，避免了轉(zhuǎn)基因帶來(lái)的安全性問(wèn)題。④可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在特定的組織中表達(dá)。條件性基因敲除條件性基因表達(dá)1.條件性基因敲除geneCregenegenegenegeneCregeneCre小鼠純合子loxP小鼠含Cre的雜合子loxP小鼠PF1geneCre含Cre的純合子loxP小鼠1.條件性基因敲除geneCregene含Cre的雜合子loxP小鼠雌雄互交geneCreCre酶目的基因敲除的小鼠F1F2F22.條件性基因表達(dá)CreCre小鼠Pgenestop含stop序列的loxP小鼠F1含Cre和stop的loxP小鼠genestop目標(biāo)基因正常表達(dá)Cre酶CregeneCreGFPstop2.條件性基因表達(dá)RFPCreCre酶不發(fā)揮作用時(shí)發(fā)紅色熒光GFPCreCre酶發(fā)揮作用時(shí)發(fā)綠色熒光Cre酶四、Cre的時(shí)空調(diào)控表達(dá)CreCre酶Cre酶在Cre酶連接雌激素受體Cre酶無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核Hsp90某一時(shí)刻加雌激素Hsp90Cre酶Cre酶Cre酶進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用1.控制Cre酶在特定時(shí)間起作用(如：雌激素誘導(dǎo))Cre酶標(biāo)記基因目的基因Cre酶基因LoxP啟動(dòng)子P1P2P3P1為組織特異性啟動(dòng)子P1P2P3Cre酶局部放大①將標(biāo)記基因在某種組織中刪除。2.控制Cre酶在特定組織中起作用(如：組織特異性啟動(dòng)子)標(biāo)記基因目的基因Cre酶基因LoxP啟動(dòng)子P1P2P3P1為組織特異性啟動(dòng)子P1P2P3Cre酶局部放大②將標(biāo)記基因和Cre酶基因在某種組織中刪除。標(biāo)記基因目的基因Cre酶基因LoxP啟動(dòng)子P1P2P3P1為組織特異性啟動(dòng)子P2P3P1P2為組織特異性啟動(dòng)子Cre酶局部放大③將標(biāo)記基因、Cre酶基因和目的基因在某種組織中刪除。1.Cre-loxP系統(tǒng)由Cre酶和loxP序列兩部分組成，Cre酶作用能實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)，圖中箭頭表示Cre酶的作用位點(diǎn)。利用基因工程技術(shù)培育抗蟲(chóng)抗除草劑水稻可減少因蟲(chóng)害(啃食葉片)和草害造成的稻米產(chǎn)量損失，為了增強(qiáng)食品安全性，科研人員利用Cre-loxP系統(tǒng)和組織特異性啟動(dòng)子P3驅(qū)動(dòng)Cre酶基因在胚乳中特異性表達(dá)，從而培育出了能夠特異性刪除種子胚乳中外源基因的轉(zhuǎn)基因水稻品系。獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織過(guò)程如圖2?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）圖2中，過(guò)程①使用的限制酶是

，選擇P2作為抗蟲(chóng)基因特異性啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是

。PstⅠ和SacⅠ保證EPSPS(抗草甘膦)基因只能在水稻葉肉細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)而起到較少蟲(chóng)害的作用1.Cre-loxP系統(tǒng)由Cre酶和loxP序列兩部分組成，Cre酶作用能實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)，圖中箭頭表示Cre酶的作用位點(diǎn)。利用基因工程技術(shù)培育抗蟲(chóng)抗除草劑水稻可減少因蟲(chóng)害(啃食葉片)和草害造成的稻米產(chǎn)量損失，為了增強(qiáng)食品安全性，科研人員利用Cre-loxP系統(tǒng)和組織特異性啟動(dòng)子P3驅(qū)動(dòng)Cre酶基因在胚乳中特異性表達(dá)，從而培育出了能夠特異性刪除種子胚乳中外源基因的轉(zhuǎn)基因水稻品系。獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織過(guò)程如圖2。回答下列問(wèn)題。(2)圖2中，過(guò)程③為植物組織培養(yǎng)中的

過(guò)程。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胗鷤M織后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有

的培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織，經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因水稻。脫分化草甘膦利用RT-PCR方法驗(yàn)證胚乳中外源基因的特異性敲除：提取轉(zhuǎn)基因植物葉肉細(xì)胞和胚乳細(xì)胞的總RNA、野生型植物的葉肉細(xì)胞和胚乳細(xì)胞的總RNA，分別以GAPDH基因（內(nèi)參基因）、EPSPS基因和cry1C基因的序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增后電泳，結(jié)果如圖3（條帶1和2分別為野生型葉肉細(xì)胞和胚乳細(xì)胞對(duì)應(yīng)的電泳結(jié)果）。根據(jù)圖3判斷，

號(hào)條帶為轉(zhuǎn)基因葉肉細(xì)胞對(duì)應(yīng)的電泳結(jié)果。轉(zhuǎn)基因水稻

細(xì)胞中無(wú)EPSPS基因和cry1C基因，其機(jī)理是__________________

。3、4、5、6、7胚乳轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中含有的目的基因中帶有P3啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在胚乳細(xì)胞中會(huì)驅(qū)動(dòng)Cre酶基因的表達(dá)，因而在胚乳細(xì)胞中合成了Cre酶，該酶會(huì)識(shí)別loxP區(qū)段，進(jìn)而將位于該區(qū)段之間的目的基因切除2.Cre-loxP系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因的敲除，其技術(shù)過(guò)程如圖1所示?？茖W(xué)家把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識(shí)別并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，構(gòu)建如圖2所示的表達(dá)載體T，在Cre酶的作用下，一部分熒光蛋白基因會(huì)被隨機(jī)地“剪掉”，而剩下的部分得以表達(dá)，這樣就可以隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。這種利用熒光蛋白“點(diǎn)亮”神經(jīng)元的大腦成像技術(shù)被稱(chēng)為“腦彩虹”，能幫助科學(xué)家了解大腦。loxPloxP待敲除基因Cre酶圖1(1)用

法將表達(dá)載體T導(dǎo)入小鼠的

細(xì)胞中，經(jīng)篩選后獲得細(xì)胞中含一個(gè)表達(dá)載體T的轉(zhuǎn)基因小鼠a（不含Cre酶）。小鼠a的腦組織細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的色彩分別是_______和

。片段1片段2紅色

顯微注射受精卵無(wú)色DNA2.Cre-loxP系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因的敲除，其技術(shù)過(guò)程如圖1所示?？茖W(xué)家把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識(shí)別并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，構(gòu)建如圖2所示的表達(dá)載體T，在Cre酶的作用下，一部分熒光蛋白基因會(huì)被隨機(jī)地“剪掉”，而剩下的部分得以表達(dá)，這樣就可以隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。這種利用熒光蛋白“點(diǎn)亮”神經(jīng)元的大腦成像技術(shù)被稱(chēng)為“腦彩虹”，能幫助科學(xué)家了解大腦。loxPloxP待敲除基因Cre酶圖1片段1片段2(2)已知兩個(gè)loxP1之間或兩個(gè)loxP2之間的基因，最多會(huì)被Cre酶敲除一次。研究者將Cre酶基因與病毒基因重組構(gòu)建Cre病毒，然后將Cre病毒注入細(xì)胞中含一個(gè)表達(dá)載體T的轉(zhuǎn)基因小鼠A體內(nèi)，出現(xiàn)“腦彩虹”現(xiàn)象，小鼠A的一個(gè)腦細(xì)胞的色彩為

。紅色或黃色或藍(lán)色2.Cre-loxP系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因的敲除，其技術(shù)過(guò)程如圖1所示。科學(xué)家把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識(shí)別并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，構(gòu)建如圖2所示的表達(dá)載體T，在Cre酶的作用下，一部分熒光蛋白基因會(huì)被隨機(jī)地“剪掉”，而剩下的部分得以表達(dá)，這樣就可以隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。這種利用熒光蛋白“點(diǎn)亮”神經(jīng)元的大腦成像技術(shù)被稱(chēng)為“腦彩虹”，能幫助科學(xué)家了解大腦。loxPloxP待敲除基因Cre酶圖1片段1片段2（3）利用上述技術(shù)可以培育能夠在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)出現(xiàn)兩種顏色的“腦彩虹”小鼠，請(qǐng)依據(jù)題目信息，簡(jiǎn)要寫(xiě)出設(shè)計(jì)思路:_____________________________________________________________________。

設(shè)法使小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)相同表達(dá)載體T，Cre酶對(duì)每個(gè)DNA片段隨機(jī)剪切，因而細(xì)胞的顏色由細(xì)胞內(nèi)兩種熒光蛋白的顏色隨機(jī)出現(xiàn)決定。3.為構(gòu)建肝特異性CD36基因敲除小鼠模型。研究人員利用Cre-1oxP系統(tǒng)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。Cre可識(shí)別DNA分子中特定的loxP序列，并將兩個(gè)loxP序列之間的DNA序列剪除，切口連接形成的環(huán)化產(chǎn)物被降解，從而達(dá)到敲除特定基因的目的，如圖所示。如圖顯示兩類(lèi)工具鼠，其中A鼠成對(duì)的CD36基因兩側(cè)分別引入一個(gè)同向loxP序列（基因型表示為L(zhǎng)+L-，野生型為L(zhǎng)-L-），B鼠中含一個(gè)外源導(dǎo)入的Cre編碼序列（基因型表示為C+C+，野生型為C-C-），Alb表示肝臟組織特異性啟動(dòng)子。利用A、B兩類(lèi)工具鼠作為親本，選用合適的雜交策略，即可獲得肝特異性CD36基因敲除目標(biāo)小鼠如圖顯示兩類(lèi)工具鼠，其中A鼠成對(duì)的CD36基因兩側(cè)分別引入一個(gè)同向loxP序列（基因型表示為L(zhǎng)+L-，野生型為L(zhǎng)-L-），B鼠中含一個(gè)外源導(dǎo)入的Cre編碼序列（基因型表示為C+C+，野生型為C-C-），Alb表示肝臟組織特異性啟動(dòng)子。利用A、B兩類(lèi)工具鼠作為親本，選用合適的雜交策略，即可獲得肝特異性CD36基因敲除目標(biāo)小鼠(1)目標(biāo)小鼠的基因型應(yīng)為

。A．L+L+C+C-

B．L+L+C-C-C．L-L-C+C+

D．L+L-C+C-A如圖顯示兩類(lèi)工具鼠，其中A鼠成對(duì)的CD36基因兩側(cè)分別引入一個(gè)同向loxP序列（基因型表示為L(zhǎng)+L-，野生型為L(zhǎng)-L-），B鼠中含一個(gè)外源導(dǎo)入的Cre編碼序列（基因型表示為C+C+，野生型為C-C-），Alb表示肝臟組織特異性啟動(dòng)子。利用A、B兩類(lèi)工具鼠作為親本，選用合適的雜交策略，即可獲得肝特異性CD36基因敲除目標(biāo)小鼠(2)選擇合適的雜交策略，目標(biāo)小鼠最早可出現(xiàn)在子

代。二如圖顯示兩類(lèi)工具鼠，其中A鼠成對(duì)的CD36基因兩側(cè)分別引入一個(gè)同向loxP序列（基因型表示為L(zhǎng)+L-，野生型為L(zhǎng)-L-），B鼠中含一個(gè)外源導(dǎo)入的Cre編碼序列（基因型表示為C+C+，野生型為C-C-），Alb表示肝臟組織特異性啟動(dòng)子。利用A、B兩類(lèi)工具鼠作為親本，選用合適的雜交策略，即可獲得肝特異