第十四章藥品生物檢定技術目錄概述藥品生物檢定的一般程序無菌檢查微生物限度及螨類檢查熱原及細菌內毒素檢查第一節(jié)概述一、關于藥品污染藥品污染是指在生產(chǎn)、取樣、包裝或重新包裝、貯存或運輸?shù)炔僮鬟^程中，原輔料、中間產(chǎn)品、待包裝產(chǎn)品、成品受到具有化學或微生物特性的雜質或異物的不利影響。化學特性物質污染微生物污染異物（物理特性）污染二、藥品污染的微生物類型細菌性污染病毒污染真菌及其毒素污染大腸埃希菌、沙門菌、假單胞菌、變形桿菌等衣原體、支原體以及噬菌體等酵母菌、青霉、曲霉、毛霉等第二節(jié)藥品生物檢定的一般程序一、檢驗前準備1.對無菌室、超凈工作臺等檢驗環(huán)境進行滅菌，提前1h滅菌30~60min，必要時進行無菌室的空氣檢驗。2.按照技術要求將各種玻璃儀器進行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。3.準備好所用的各種試劑、藥品，做好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇培養(yǎng)基。4.準備好所需的各種儀器，如恒溫水浴箱、滅菌鍋、顯微鏡、冰箱等，并分別進行滅菌消毒。5.檢驗人員的工作衣、口罩、鞋、帽等滅菌后備用。6.檢驗人員必須將手清洗消毒，穿戴好無菌工作衣、帽和鞋，才能進入無菌室，且在試驗沒有完成之前不得隨便出入無菌室。二、樣品的采集原則要求隨機、客觀、均勻、合理代表性、真實性、有效性三、樣品的處理采集的樣品要注意保持完整性和有效性。采集的樣品送入無菌室前，應用適宜的消毒溶液對其外表進行消毒處理，在物流中（傳遞窗）經(jīng)紫外線照射30分鐘后方可進入無菌室，檢驗中注意及時將樣品的唯一性編號轉移至最小包裝及傳遞到每一步驟的容器上，保證實驗結果的唯一性和正確性。四、樣品的檢驗檢驗人員接到樣品和送檢單后，應立即登記，填寫序號，按照要求將樣品保存，并積極準備條件進行檢驗。按照《中國藥典》（2020年版）、國家藥品標準或根據(jù)不同的藥品、不同的檢驗目的來選擇適當?shù)臋z驗方法，進行藥品的生物檢定。五、結果與記錄樣品檢驗完畢后，檢驗人員應及時填寫檢驗記錄，并出具檢驗報告書。檢驗記錄必須真實、完整、清晰，不得隨意涂改。如果需要涂改，須用斜線將涂改部分劃掉，并簽上涂改者的名字或蓋印章，不得使用涂黑方式，以保證錯誤部分清晰可見。藥品生物檢定的記錄中應有實驗環(huán)境檢測情況，第三節(jié)無菌檢查無菌檢查法是指用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查的項目通常包括需氧菌、厭氧菌及真菌檢查。一、無菌檢查的概念與意義（二）意義（一）概念保證藥品的衛(wèi)生質量，保證藥品在臨床上使用的安全1.無菌檢查應在潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行。2.單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。3.檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，且防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。二、常規(guī)技術要求4.無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術的培訓。5.培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液、實驗器具等滅菌時，除另有規(guī)定外均采用驗證合格的滅菌程序滅菌。6.日常檢驗時需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類：8種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中和或滅活用培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）

（一）培養(yǎng)基的種類三、培養(yǎng)基證明：培養(yǎng)基無菌，且能保證細菌生長良好無菌性檢查每批培養(yǎng)基一般隨機取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長（二）培養(yǎng)基的適用性檢查1.無菌性檢查靈敏度檢查方法：用已知的標準菌種來檢定培養(yǎng)基的敏感度，以證明在進行無菌檢查時，所加的菌種能夠在培養(yǎng)基中生長良好。培養(yǎng)基靈敏度檢查的菌種有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。2.靈敏度檢查四、方法適用性試驗進行產(chǎn)品的無菌檢查時，應進行方法適用性試驗確認所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查排除供試品是否具有抑細菌和抑真菌作用避免假陰性結果方法：薄膜過濾法、直接接種法

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕的菌液制備同金黃色葡萄球菌。（一）菌種及菌液制備

按供試品的無菌檢查要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗菌，過濾。加培養(yǎng)基至濾筒內，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。（二）薄膜過濾法

取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供試品的無菌檢查要求，接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

（三）直接接種法1.如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。。2.如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。（四）結果判斷五、供試品的無菌檢查《中國藥典》（2020年版）通則1101批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數(shù)量表上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量表供試品的最少檢驗量表（一）檢驗數(shù)量及檢驗量圖片截取自智慧職教《無菌檢查的實驗操作》視頻（二）對照試驗

根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌無抑菌作用和抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品，以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌；陽性對照管培養(yǎng)不超過5天，應生長良好。1.陽性對照不得長菌，用以檢查試驗過程中使用的溶劑、稀釋液、沖洗液等對微生物生長及存活無影響。（二）對照試驗2.陰性對照

薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。濾膜直徑約為50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應對稀釋液和沖洗液體積進行調整，并重新驗證。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。（三）供試品處理及接種培養(yǎng)基1.薄膜過濾法2.直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相等；生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)為2:1。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。1.若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；2.若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。3.試驗若經(jīng)評估確認無效后，應重試。（四）結果判斷第四節(jié)

微生物限度及螨類檢查一、需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查《中國藥典》（2020年版）通則1107規(guī)定：非無菌藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）”檢查。平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法計數(shù)方法傾注法和涂布法截取自智慧職教《微生物限度檢查實驗操作》視頻二、控制菌檢查《中國藥典》（2020年版）通則1106規(guī)定的控制菌檢查項目包括耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌。

供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。三、活螨檢查直檢法：取供試品先用肉眼觀察，有無疑似活螨的白點或其他顏色的點狀物，再用5～10倍放大鏡或實體顯微鏡檢視。有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨放在滴有一滴甘油溶液的載玻片上，置顯微鏡下觀察。（一）活螨的一般檢查法3.分離法：也稱烤螨法。取供試品放在附有孔徑大小適宜的篩網(wǎng)的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕熱的習性，在漏斗的廣口上面放一個60～100W的燈泡，距離藥品約6cm處，照射1～2h?；铗裳又┒穬鹊牡撞考殢絻缺谙蛳屡?，用小燒杯裝半杯甘油溶液，放在漏斗的下口處，收集爬出的活螨。2.漂浮法：取供試品放在盛有飽和食鹽水的扁形稱量瓶或適宜的容器內，加飽和食鹽水至容器的三分之二處，攪拌均勻，置10倍放大鏡或實體顯微鏡下檢查，或繼續(xù)加飽和食鹽水至瓶口處（為防止鹽水和樣品溢出污染桌面，宜將上述容器放在裝有適量甘油溶液的培養(yǎng)皿中），用潔凈的載玻片蓋在瓶口，使玻片與液面接觸，沾取液面上的漂浮物，迅即反轉玻片，置顯微鏡下檢查。（一）各種劑型的活螨檢查方法1.大蜜丸：將藥丸外殼（蠟殼或紙蠟殼等）置酒精燈小火焰上轉動，適當燒灼（殺滅外殼可能污染的活螨）后，小心打開。（1）表面完好的藥丸，可用消毒的或在火焰上燒灼后放冷的解剖針刺入藥丸，取樣后手持解剖針，在放大鏡或實體顯微鏡下檢查。同時注意檢查丸殼的內壁或包丸的襯紙有無活螨。（2）有蟲粉現(xiàn)象的藥丸，可用放大鏡或實體顯微鏡直接檢查，也可用漂浮法檢查。2.小蜜丸、水丸（1）表面完好的藥丸，可將其放在預先襯有潔凈黑紙片的培養(yǎng)皿或小搪瓷盤中，用直檢法檢查，未檢出螨時，如必要，可再用漂浮法或烤螨法檢查。（2）有蟲粉現(xiàn)象的丸、片，可用直檢法或漂浮法檢查。同時注意檢查藥瓶口內壁與內蓋有無活螨。3.散劑、沖劑和膠囊劑等直接檢查藥瓶口壁、內蓋及塑料薄膜袋的內側有無活螨。然后將藥品放在襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或搪瓷盤里，使成薄層，直接檢查。必要時可再用漂浮法檢查。4.塊狀沖劑直接檢查供試品的包裝蠟紙、玻璃紙或塑料薄膜及藥塊表面有無活螨。有蟲粉現(xiàn)象者，除用直檢法檢查外，可再用漂浮法檢查。5.液體制劑及半固體制劑先用75%乙醇將藥瓶的外蓋螺口周圍消毒后，小心旋開外蓋，用直檢法，檢查藥瓶外蓋的內側及瓶口內外的周圍與內蓋有無活螨。第五節(jié)

熱原及細菌內毒素檢查一、熱原的檢查是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規(guī)定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。熱原檢查法家兔試驗法仍是目前各國藥典規(guī)定的熱原檢查的法定方法。供試用家兔1、供試用的家兔應健康合格，體重1.7kg以上，雌兔應無孕。2、預測體溫前7日即應用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間內，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異?，F(xiàn)象。3、挑選試驗的條件與檢查供試品時相同，僅不注射藥液，每隔30分鐘測量體溫1次，共測8次，8次體溫均在38.0～39.6℃的范圍內，且最高與最低體溫相差不超過0.4℃的家兔。檢查法家兔3只：30分鐘測一次，共6次結果判斷在初試的3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超過1只，并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5℃或低于3.5℃，均判定供試品的熱原檢查符合規(guī)定。截取自智慧職教《熱原檢查法》視頻二、細菌內毒素的檢查細菌內毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。凝膠法光度測定法細菌內毒素檢查濁度法和顯色基質法凝膠限度試驗和凝膠半定量試驗（一）凝膠限度試驗按表14