免疫蛋白酶體亞基PSMB10在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠房顫中的作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義心房顫動(dòng)（AtrialFibrillation，AF），簡稱房顫，是臨床上最為常見的持續(xù)性心律失常之一。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加速，房顫的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在普通人群中，房顫的發(fā)病率約為1%-2%，而在75歲以上的老年人群中，這一比例可高達(dá)10%左右。房顫的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致心房收縮功能受損，心臟泵血效率降低，進(jìn)而顯著增加心臟病的發(fā)病率及死亡率。更為嚴(yán)重的是，房顫還極易引發(fā)血栓形成及栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，其中以腦卒中最為常見且危害巨大。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，由房顫造成的栓塞事件在所有栓塞病例中占比高達(dá)15％，房顫患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的5-7倍。腦卒中不僅會(huì)給患者帶來嚴(yán)重的身體殘疾，如偏癱、失語等，還會(huì)極大地降低患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和護(hù)理壓力。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-AngiotensinSystem，RAS）在心血管系統(tǒng)的生理調(diào)節(jié)以及多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）作為RAS的主要效應(yīng)激素，在房顫的病理生理過程中扮演著重要角色。研究表明，AngⅡ能夠通過激活其1型受體（AT1受體），進(jìn)而激活核因子-κB（NF-κB）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化方面發(fā)揮著重要作用，這些病理改變正是房顫發(fā)生發(fā)展的重要基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致心房組織的損傷和電生理特性的改變，增加房顫的易感性；氧化應(yīng)激會(huì)損傷心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響心臟的正常節(jié)律；而纖維化則會(huì)破壞心房的正常組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致心房電傳導(dǎo)異常，促進(jìn)房顫的發(fā)生和維持。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-ProteasomeSystem，UPS）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的關(guān)鍵機(jī)制之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。26S蛋白水解復(fù)合物作為UPS的核心組成部分，由20S蛋白酶體和19S調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成。在正常生理狀態(tài)下，20S核心的β-環(huán)內(nèi)部包含三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)催化亞基，分別為β1（PSMB6）、β2（PSMB7）和β5（PSMB5），它們?cè)诰S持細(xì)胞正常生理功能方面發(fā)揮著基礎(chǔ)作用。然而，當(dāng)細(xì)胞受到干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)β1i（PSMB9或LMP2）、β2i（PSMB10、MECL-1或LMP10）和β5i（PSMB8或LMP7）這三種替代亞基取代標(biāo)準(zhǔn)亞基，從而形成新的20S免疫蛋白酶體。免疫蛋白酶體相較于標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體，在控制免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激以及維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)等方面具有更為重要的作用。越來越多的研究表明，免疫蛋白酶體能夠更有效地調(diào)節(jié)特定的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，例如NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，這對(duì)于細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的生存和功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。近期的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，包括AngⅡ、高鹽、異丙腎上腺素或壓力超負(fù)荷在內(nèi)的多種高血壓刺激，均可顯著增加心臟中標(biāo)準(zhǔn)和免疫蛋白酶體亞基的表達(dá)水平，同時(shí)相應(yīng)的蛋白水解活性也會(huì)增強(qiáng)。這表明在高血壓等病理狀態(tài)下，蛋白酶體系統(tǒng)參與了心臟的適應(yīng)性調(diào)節(jié)或病理改變過程。有研究指出，敲除PSMB10基因可以降低DOCA/鹽處理的小鼠血壓和心臟纖維化程度，這提示PSMB10在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而，目前關(guān)于免疫蛋白酶體亞基PSMB10在調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的房顫中的具體作用及分子機(jī)制，尚不完全清楚。本研究旨在通過構(gòu)建AngⅡ灌注小鼠房顫模型，深入檢測小鼠心房在纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激以及離子通道等方面的改變，系統(tǒng)地探索免疫蛋白酶體亞基PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機(jī)制。同時(shí)，研究IKK抑制劑IMD0354對(duì)房顫的影響及其分子機(jī)制。這不僅有助于進(jìn)一步揭示房顫的發(fā)病機(jī)制，為房顫的防治提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型的房顫治療藥物和策略提供潛在的靶點(diǎn)和方向，對(duì)于改善房顫患者的預(yù)后和生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1心房顫動(dòng)機(jī)制的研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)房顫機(jī)制展開了多方面的研究，主要聚焦于電生理、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和神經(jīng)調(diào)節(jié)等領(lǐng)域。在電生理方面，大量研究表明離子通道功能異常在房顫發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。如L型鈣通道（Cav1.2）的電流密度改變可影響心肌細(xì)胞的去極化和復(fù)極化過程，進(jìn)而改變心房的電生理特性，增加房顫的易感性。瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）的增強(qiáng)會(huì)縮短動(dòng)作電位時(shí)程，導(dǎo)致心房肌細(xì)胞的不應(yīng)期縮短，使得折返激動(dòng)更容易形成，促進(jìn)房顫的發(fā)生。國內(nèi)學(xué)者通過對(duì)房顫患者心肌組織的研究，發(fā)現(xiàn)Ito電流密度較正常人顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面，心房纖維化是房顫發(fā)生和維持的重要病理基礎(chǔ)。細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的過度沉積會(huì)破壞心肌細(xì)胞之間的正常連接，導(dǎo)致電傳導(dǎo)的不均一性，從而形成折返環(huán)路。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在心房纖維化過程中發(fā)揮核心作用，它可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加膠原蛋白的合成和分泌。國外有研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β信號(hào)通路能夠顯著減輕心房纖維化程度，降低房顫的發(fā)生率。神經(jīng)調(diào)節(jié)在房顫中的作用也受到廣泛關(guān)注。心臟受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的雙重支配，自主神經(jīng)張力的改變可影響心房的電生理特性。交感神經(jīng)興奮時(shí)，釋放去甲腎上腺素，激活β-腎上腺素能受體，通過cAMP-PKA信號(hào)通路，增加L型鈣電流和If電流，使心房肌細(xì)胞的自律性增強(qiáng)，容易誘發(fā)異位節(jié)律，進(jìn)而引發(fā)房顫。迷走神經(jīng)興奮時(shí)，釋放乙酰膽堿，激活M2型膽堿能受體，通過G蛋白-AC-cAMP信號(hào)通路，抑制L型鈣電流和If電流，縮短動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，增加心房的易損性，也促進(jìn)房顫的發(fā)生。臨床上，一些患者在運(yùn)動(dòng)（交感神經(jīng)興奮）或睡眠（迷走神經(jīng)興奮）時(shí)更容易發(fā)生房顫，這與神經(jīng)調(diào)節(jié)對(duì)房顫的影響密切相關(guān)。1.2.2血管緊張素Ⅱ在心血管疾病中作用的研究現(xiàn)狀血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的關(guān)鍵效應(yīng)肽，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，國內(nèi)外對(duì)此進(jìn)行了大量深入研究。在高血壓方面，AngⅡ可通過與血管平滑肌細(xì)胞上的1型受體（AT1R）結(jié)合，激活多種信號(hào)通路，如磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）通路，導(dǎo)致血管平滑肌收縮，外周血管阻力增加，從而升高血壓。同時(shí)，AngⅡ還能刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶合成和釋放醛固酮，促進(jìn)水鈉潴留，進(jìn)一步加重高血壓。國內(nèi)的一項(xiàng)臨床研究對(duì)高血壓患者進(jìn)行RAS阻斷劑治療，發(fā)現(xiàn)治療后患者血壓明顯下降，證實(shí)了AngⅡ在高血壓發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。在心肌肥厚方面，AngⅡ通過激活A(yù)T1R，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞體積增大，導(dǎo)致心肌肥厚。研究表明，在心肌肥厚動(dòng)物模型中，抑制AngⅡ的生成或阻斷AT1R，可有效減輕心肌肥厚程度。在動(dòng)脈粥樣硬化方面，AngⅡ可促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。AngⅡ可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子的表達(dá)，吸引單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)斑塊的形成。同時(shí)，AngⅡ還能增強(qiáng)NADPH氧化酶活性，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。1.2.3PSMB10在心血管疾病中作用的研究現(xiàn)狀免疫蛋白酶體亞基PSMB10在心血管疾病中的作用逐漸受到關(guān)注，但目前相關(guān)研究仍相對(duì)較少，國內(nèi)外研究主要集中在其與心臟纖維化和血壓調(diào)節(jié)的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種高血壓刺激下，如血管緊張素Ⅱ、高鹽、異丙腎上腺素或壓力超負(fù)荷，心臟中PSMB10的表達(dá)會(huì)顯著增加，同時(shí)相應(yīng)的蛋白水解活性也增強(qiáng)。在DOCA/鹽處理的小鼠模型中，敲除PSMB10基因可降低小鼠血壓和心臟纖維化程度，提示PSMB10可能參與了高血壓引起的心臟病理改變。在心臟纖維化方面，PSMB10可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來影響纖維化進(jìn)程。研究表明，PSMB10可以影響AKT1/TGF-β信號(hào)通路，AngⅡ灌注可減少小鼠心房中PTEN的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)KT1/TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)膠原蛋白的合成，導(dǎo)致心房纖維化。而敲除PSMB10基因后，PTEN降解減少，AKT1/TGF-β信號(hào)通路的激活被抑制，心房纖維化程度減輕。然而，目前PSMB10在心血管疾病中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是其在房顫發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在通過構(gòu)建血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）灌注小鼠心房顫動(dòng)（房顫）模型，深入探究免疫蛋白酶體亞基PSMB10在調(diào)節(jié)房顫發(fā)生過程中的具體分子機(jī)制。同時(shí)，研究IKK抑制劑IMD0354對(duì)房顫的影響及其潛在的分子機(jī)制，為房顫的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。1.3.2研究內(nèi)容構(gòu)建AngⅡ灌注小鼠房顫模型并檢測PSMB10相關(guān)指標(biāo)：運(yùn)用AngⅡ持續(xù)微量灌注野生型C57BL/6小鼠三周，成功建立小鼠房顫模型。借助小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測血壓變化，利用電生理檢測儀精確測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間。通過蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分別檢測小鼠心房中PSMB10的蛋白及mRNA表達(dá)量，同時(shí)檢測小鼠心房組織和血清以及房顫患者血清中的胰蛋白酶樣活性，以此深入了解PSMB10在房顫模型中的表達(dá)及活性變化情況。PSMB10基因敲除對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響：對(duì)PSMB10基因敲除（PSMB10KO）小鼠進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，建立房顫模型。采用Masson染色清晰檢測心房纖維化程度，通過H&E、Mac-2染色準(zhǔn)確檢測心房炎性細(xì)胞浸潤情況，利用DHE染色有效檢測心房氧化應(yīng)激水平。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4的mRNA表達(dá)量，以此對(duì)應(yīng)評(píng)估心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平。使用蛋白免疫印跡法檢測小鼠心房離子通道、縫隙鏈接蛋白表達(dá)量及纖維化、炎癥信號(hào)通路變化，全面分析PSMB10基因敲除對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響。PSMB10基因過表達(dá)對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響：利用9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染（rAAV9-PSMB10）小鼠，然后進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，建立房顫模型。運(yùn)用與上述相同的檢測方法，即Masson染色、H&E和Mac-2染色、DHE染色、實(shí)時(shí)定量PCR以及蛋白免疫印跡法，檢測房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平以及相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的變化，深入研究PSMB10基因過表達(dá)對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響。IKK抑制劑對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響：在rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠進(jìn)行AngⅡ灌注的基礎(chǔ)上，給予IKK抑制劑IMD0354處理。同樣運(yùn)用電生理檢測儀測量房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，采用Masson染色檢測心房纖維化程度，通過實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)基因和蛋白表達(dá)以及信號(hào)通路變化，系統(tǒng)研究IKK抑制劑對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用野生型C57BL/6小鼠、PSMB10基因敲除（PSMB10KO）小鼠和9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染（rAAV9-PSMB10）小鼠。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，對(duì)照組給予等量生理鹽水灌注。灌注過程中，使用小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠血壓，以評(píng)估AngⅡ?qū)ρ獕旱挠绊憽ｋ娚頇z測：灌注結(jié)束后，采用電生理檢測儀對(duì)小鼠進(jìn)行心房程序刺激，測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，以此評(píng)估房顫的發(fā)生情況。具體操作是將電極導(dǎo)管經(jīng)頸靜脈插入右心房，記錄心房電活動(dòng)，通過刺激儀給予不同頻率和強(qiáng)度的電刺激，觀察是否誘發(fā)房顫以及房顫的持續(xù)時(shí)間。組織學(xué)檢測：取小鼠心房組織，進(jìn)行Masson染色，以檢測心房纖維化程度，通過觀察膠原纖維的分布和含量來評(píng)估纖維化程度；進(jìn)行H&E染色，觀察炎性細(xì)胞浸潤情況；采用Mac-2染色特異性地標(biāo)記巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步準(zhǔn)確檢測心房炎性細(xì)胞浸潤情況；運(yùn)用DHE染色檢測心房氧化應(yīng)激水平，通過熒光強(qiáng)度來反映氧化應(yīng)激的程度。分子生物學(xué)檢測：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4等基因的mRNA表達(dá)量，以評(píng)估心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平。提取小鼠心房組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過與內(nèi)參基因比較，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。使用蛋白免疫印跡法檢測小鼠心房PSMB10、離子通道、縫隙鏈接蛋白表達(dá)量及纖維化、炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，如檢測AKT1/TGF-β信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平等。通過ELISA檢測房顫患者血清PSMB10濃度，收集房顫患者和健康對(duì)照者的血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中PSMB10的含量。采用特定的熒光底物法檢測小鼠心房組織和血清以及房顫患者血清胰蛋白酶樣活性，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來反映胰蛋白酶樣活性的高低。藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)：在rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠進(jìn)行AngⅡ灌注的基礎(chǔ)上，給予IKK抑制劑IMD0354處理，同樣進(jìn)行電生理檢測、組織學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測，以研究IKK抑制劑對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響。設(shè)置不同的藥物處理組，包括對(duì)照組、AngⅡ灌注組、AngⅡ灌注+IMD0354處理組等，對(duì)比分析不同組之間的差異。1.4.2技術(shù)路線第一階段：獲取野生型C57BL/6小鼠、PSMB10基因敲除小鼠和9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠，將小鼠隨機(jī)分組。對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注，對(duì)照組給予生理鹽水灌注，同時(shí)監(jiān)測小鼠血壓。灌注三周后，進(jìn)行電生理檢測，測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，初步判斷房顫模型的建立情況。第二階段：取小鼠心房組織，一部分用于組織學(xué)檢測，包括Masson染色、H&E染色、Mac-2染色和DHE染色，直觀觀察心房纖維化、炎癥和氧化應(yīng)激的病理改變；另一部分用于分子生物學(xué)檢測，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)及信號(hào)通路變化。同時(shí)收集房顫患者和健康對(duì)照者的血清，進(jìn)行ELISA檢測PSMB10濃度和胰蛋白酶樣活性檢測。第三階段：在rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠進(jìn)行AngⅡ灌注的基礎(chǔ)上，給予IKK抑制劑IMD0354處理，再次進(jìn)行電生理檢測、組織學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。對(duì)比不同處理組之間的差異，分析PSMB10在AngⅡ誘導(dǎo)的房顫中的作用機(jī)制以及IKK抑制劑的干預(yù)效果。最后，綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)PSMB10參與調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的分子機(jī)制以及IKK抑制劑對(duì)房顫的影響機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1心房顫動(dòng)概述心房顫動(dòng)（AtrialFibrillation，AF），簡稱房顫，是一種常見的心律失常疾病。其定義為規(guī)則有序的心房電活動(dòng)喪失，代之以快速無序的顫動(dòng)波，使得心房失去有效的收縮和舒張功能，心房泵血功能惡化和喪失。房顫在臨床上較為常見，可發(fā)生于正常人，也常見于患有器質(zhì)性心臟病的患者。正常人在情緒激動(dòng)、手術(shù)后、運(yùn)動(dòng)或大量飲酒等情況下，也可能出現(xiàn)房顫。而在器質(zhì)性心臟病患者中，如冠心病、高血壓性心臟病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣狹窄、心肌病以及甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病患者，房顫的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。肺部疾病，如急性缺氧、慢阻肺、肺心病等，也與房顫的發(fā)生密切相關(guān)。此外，隨著年齡的增長，房顫的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，在65歲以上的人群中，發(fā)病率可達(dá)5％以上。在普通人群中，房顫的發(fā)病率約為1%-2%。根據(jù)房顫的發(fā)作特點(diǎn)和持續(xù)時(shí)間，可將其分為初發(fā)房顫、陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫、長程持續(xù)性房顫和永久性房顫。初發(fā)房顫是指首次發(fā)現(xiàn)的房顫，無論其有無癥狀和能否自行復(fù)律；陣發(fā)性房顫是指發(fā)作持續(xù)時(shí)間小于7天，?？勺孕薪K止的房顫；持續(xù)性房顫是指發(fā)作持續(xù)時(shí)間大于7天，需要藥物或電復(fù)律才能轉(zhuǎn)復(fù)的房顫；長程持續(xù)性房顫是指持續(xù)時(shí)間超過1年的房顫；永久性房顫則是指患者和醫(yī)生共同決定放棄恢復(fù)竇性心律的房顫。不同類型的房顫在治療策略和預(yù)后方面存在差異。房顫的危害極大，會(huì)顯著增加心臟病的發(fā)病率及死亡率。房顫患者心房內(nèi)快速不規(guī)則的電活動(dòng)導(dǎo)致心房收縮受損，心臟泵血功能下降，容易引發(fā)心力衰竭等嚴(yán)重心臟疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，房顫患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是無房顫患者的3倍。房顫還極易引發(fā)血栓形成及栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，其中以腦卒中最為常見且危害巨大。由于房顫時(shí)心房失去有效收縮，血液在心房內(nèi)瘀滯，容易形成血栓，一旦血栓脫落進(jìn)入血液循環(huán)，可隨血流到達(dá)全身各處，導(dǎo)致肺栓塞、腦栓塞等嚴(yán)重后果。房顫患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的5-7倍，由房顫造成的栓塞事件在所有栓塞病例中占比高達(dá)15％。腦卒中不僅會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)偏癱、失語、認(rèn)知障礙等嚴(yán)重殘疾，還會(huì)顯著降低患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和護(hù)理壓力。有研究表明，房顫相關(guān)腦卒中患者的住院費(fèi)用是其他類型腦卒中患者的1.5倍，且長期的康復(fù)治療和護(hù)理費(fèi)用更是難以估量。房顫的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為與電生理異常、結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及神經(jīng)調(diào)節(jié)等因素密切相關(guān)。在電生理方面，離子通道功能異常被認(rèn)為是房顫發(fā)生的重要基礎(chǔ)。如L型鈣通道（Cav1.2）的電流密度改變可影響心肌細(xì)胞的去極化和復(fù)極化過程，進(jìn)而改變心房的電生理特性，增加房顫的易感性。瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）的增強(qiáng)會(huì)縮短動(dòng)作電位時(shí)程，導(dǎo)致心房肌細(xì)胞的不應(yīng)期縮短，使得折返激動(dòng)更容易形成，促進(jìn)房顫的發(fā)生。在結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面，心房纖維化是房顫發(fā)生和維持的重要病理基礎(chǔ)。細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的過度沉積會(huì)破壞心肌細(xì)胞之間的正常連接，導(dǎo)致電傳導(dǎo)的不均一性，從而形成折返環(huán)路。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在心房纖維化過程中發(fā)揮核心作用，它可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加膠原蛋白的合成和分泌。神經(jīng)調(diào)節(jié)在房顫中的作用也不容忽視，心臟受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的雙重支配，自主神經(jīng)張力的改變可影響心房的電生理特性。交感神經(jīng)興奮時(shí)，釋放去甲腎上腺素，激活β-腎上腺素能受體，通過cAMP-PKA信號(hào)通路，增加L型鈣電流和If電流，使心房肌細(xì)胞的自律性增強(qiáng)，容易誘發(fā)異位節(jié)律，進(jìn)而引發(fā)房顫。迷走神經(jīng)興奮時(shí)，釋放乙酰膽堿，激活M2型膽堿能受體，通過G蛋白-AC-cAMP信號(hào)通路，抑制L型鈣電流和If電流，縮短動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，增加心房的易損性，也促進(jìn)房顫的發(fā)生。臨床上，一些患者在運(yùn)動(dòng)（交感神經(jīng)興奮）或睡眠（迷走神經(jīng)興奮）時(shí)更容易發(fā)生房顫，這與神經(jīng)調(diào)節(jié)對(duì)房顫的影響密切相關(guān)。2.2血管緊張素Ⅱ與房顫血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-AngiotensinSystem，RAS）的主要活性肽。RAS是由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）以及血管緊張素受體等組成的復(fù)雜系統(tǒng)。在RAS中，腎素由腎小球旁器的球旁細(xì)胞分泌，它能將肝臟合成并釋放到血液循環(huán)中的血管緊張素原水解，生成十肽的血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）。血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的作用下，進(jìn)一步水解生成八肽的血管緊張素Ⅱ。此外，組織局部也存在RAS，如心臟、血管等組織中，它們可以通過自分泌、旁分泌的方式產(chǎn)生AngⅡ，在局部組織的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。AngⅡ在心血管系統(tǒng)中具有廣泛而重要的生理作用。它主要通過與血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）和血管緊張素Ⅱ2型受體（AT2R）結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中與AT1R的結(jié)合是其發(fā)揮大多數(shù)生理和病理作用的基礎(chǔ)。與AT1R結(jié)合后，AngⅡ可激活多種信號(hào)通路，如磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）通路，導(dǎo)致血管平滑肌收縮，外周血管阻力增加，從而升高血壓。在心臟方面，AngⅡ可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、增殖，誘導(dǎo)心肌纖維化，影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。它能刺激心肌細(xì)胞內(nèi)的原癌基因c-fos、c-myc等表達(dá)增加，促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積增大。同時(shí)，AngⅡ還可通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，導(dǎo)致心肌纖維化。在房顫的發(fā)生發(fā)展過程中，AngⅡ起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，房顫患者心房組織中AngⅡ水平明顯升高，且與房顫的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度相關(guān)。AngⅡ通過激活RAS及相關(guān)信號(hào)通路，參與了房顫的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程。在電重構(gòu)方面，AngⅡ可通過增加L-鈣通道α1C亞單位表達(dá)，促進(jìn)鈣內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心房電重構(gòu)的離子基礎(chǔ)，可使心房肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程縮短，有效不應(yīng)期縮短，從而增加心房的電不穩(wěn)定性，促進(jìn)房顫的發(fā)生。有研究通過對(duì)快速心房起搏犬給予AngⅡ處理，發(fā)現(xiàn)AngⅡ使心房有效不應(yīng)期（AERP）顯著縮短，停止起搏后，AERP恢復(fù)時(shí)間顯著延長，提示AngⅡ可促進(jìn)心房的電重構(gòu)。在結(jié)構(gòu)重構(gòu)方面，AngⅡ可導(dǎo)致心房纖維化，這是房顫發(fā)生和維持的重要病理基礎(chǔ)。當(dāng)心臟存在基礎(chǔ)疾病，如高血壓、冠心病等，導(dǎo)致心臟壓力和容量負(fù)荷改變時(shí)，心房擴(kuò)大及心肌牽張力增加，可促進(jìn)局部AngⅡ水平升高。升高的AngⅡ可刺激成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)膠原聚集，導(dǎo)致心肌纖維化。心肌纖維化可將彼此聯(lián)系的心房肌細(xì)胞隔離，導(dǎo)致細(xì)胞間傳導(dǎo)的不均一性，有利于房顫的產(chǎn)生與維持。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)心房纖維化的進(jìn)展與心房AngⅡ水平升高密切相關(guān)，同時(shí)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ERK-1）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（ERK-2）的表達(dá)及活化增加。在永久性房顫患者中，心房纖維組織顯著增加，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化的同時(shí)，伴有ACE、ERK-1和ERK-2表達(dá)的增加，且ERK-1和ERK-2表達(dá)的增加來源于成纖維細(xì)胞。此外，AngⅡ還可通過激活核因子-κB（NF-κB）等炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可損傷心房組織，進(jìn)一步加重心房的結(jié)構(gòu)和電生理改變，促進(jìn)房顫的發(fā)生和發(fā)展。AngⅡ可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)增加，吸引炎癥細(xì)胞浸潤到心房組織，導(dǎo)致炎癥損傷。同時(shí)，炎癥因子還可進(jìn)一步激活RAS，形成惡性循環(huán)，加重房顫的病理過程。AngⅡ還能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平影響房顫的發(fā)生。它可激活NADPH氧化酶，增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。ROS可損傷心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響離子通道的活性，改變心房的電生理特性，促進(jìn)房顫的發(fā)生。研究表明，在AngⅡ灌注的動(dòng)物模型中，心房組織中ROS水平明顯升高，抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)如丙二醛（MDA）含量增加，而超氧化物歧化酶（SOD）活性降低。2.3免疫蛋白酶體與PSMB10免疫蛋白酶體是蛋白酶體的一種特殊亞型，在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。它的組成與標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體有所不同，其核心結(jié)構(gòu)20S免疫蛋白酶體由4個(gè)七聚體環(huán)組成，包括2個(gè)外環(huán)和2個(gè)內(nèi)環(huán)。2個(gè)外環(huán)各由7個(gè)α亞單位構(gòu)成，分別處于圓柱體的頂部和底部，主要負(fù)責(zé)控制蛋白進(jìn)入蛋白酶體體腔內(nèi)，并對(duì)蛋白酶體的催化過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，但α亞單位本身并無催化活性。2個(gè)內(nèi)環(huán)各由7個(gè)β亞單位構(gòu)成，位于圓柱體腰部，β亞單位具有催化活性，其催化部位位于N端，突出在圓柱體空腔內(nèi)，是20S的酶促反應(yīng)中心，能夠?qū)⒎核鼗鞍踪|(zhì)降解成3-22個(gè)氨基酸殘基的短肽。在正常生理狀態(tài)下，20S核心的β-環(huán)內(nèi)部包含三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)催化亞基，分別為β1（PSMB6）、β2（PSMB7）和β5（PSMB5）。然而，當(dāng)細(xì)胞受到干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)β1i（PSMB9或LMP2）、β2i（PSMB10、MECL-1或LMP10）和β5i（PSMB8或LMP7）這三種替代亞基取代標(biāo)準(zhǔn)亞基，從而形成新的20S免疫蛋白酶體。免疫蛋白酶體具有多種重要功能。在免疫應(yīng)答方面，它能夠更有效地將蛋白質(zhì)水解成與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子（MHC-Ⅰ）復(fù)合物相容的肽段，在殺傷性T細(xì)胞反應(yīng)中的抗原處理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，免疫蛋白酶體參與了病毒感染細(xì)胞的抗原呈遞過程，將病毒蛋白降解為特定的肽段，然后與MHC-Ⅰ分子結(jié)合，呈遞給T細(xì)胞，從而激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，清除被病毒感染的細(xì)胞。在維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面，免疫蛋白酶體和普通蛋白酶體一樣，通過降解有缺陷的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)時(shí)，免疫蛋白酶體能夠及時(shí)識(shí)別并將其降解，防止這些異常蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積累，從而保證細(xì)胞的正常功能。免疫蛋白酶體在T細(xì)胞的擴(kuò)增和分化中也發(fā)揮著重要作用，影響著免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能。PSMB10作為免疫蛋白酶體的重要亞基之一，在免疫蛋白酶體中具有獨(dú)特的作用。它是免疫蛋白酶體中β2i亞基的編碼基因，其表達(dá)產(chǎn)物在免疫蛋白酶體的組裝和功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。PSMB10可以取代標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體中的β2亞基（PSMB7），參與免疫蛋白酶體的形成。在免疫應(yīng)答過程中，PSMB10有助于免疫蛋白酶體更高效地降解抗原蛋白，產(chǎn)生適合與MHC-Ⅰ分子結(jié)合的肽段，從而增強(qiáng)抗原呈遞效率，激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)。PSMB10還可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，PSMB10可以影響AKT1/TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和纖維化等過程。在心血管疾病方面，PSMB10的研究逐漸受到關(guān)注。近期的多項(xiàng)研究表明，包括AngⅡ、高鹽、異丙腎上腺素或壓力超負(fù)荷在內(nèi)的多種高血壓刺激，均可顯著增加心臟中PSMB10的表達(dá)水平，同時(shí)相應(yīng)的蛋白水解活性也會(huì)增強(qiáng)。在DOCA/鹽處理的小鼠模型中，敲除PSMB10基因可以降低小鼠血壓和心臟纖維化程度。這提示PSMB10可能參與了高血壓引起的心臟病理改變過程，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在心臟纖維化方面，PSMB10可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來影響纖維化進(jìn)程。有研究表明，AngⅡ灌注可減少小鼠心房中PTEN的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)KT1/TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)膠原蛋白的合成，導(dǎo)致心房纖維化。而敲除PSMB10基因后，PTEN降解減少，AKT1/TGF-β信號(hào)通路的激活被抑制，心房纖維化程度減輕。然而，目前PSMB10在心血管疾病中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是其在房顫發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)選用8周齡雄性野生型C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2020-0001。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PSMB10基因敲除（PSMB10KO）小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，其構(gòu)建方法為通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除PSMB10基因的關(guān)鍵外顯子，經(jīng)基因測序驗(yàn)證敲除成功。將PSMB10KO小鼠與野生型C57BL/6小鼠回交至少10代，以保證遺傳背景一致。實(shí)驗(yàn)前同樣對(duì)PSMB10KO小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染（rAAV9-PSMB10）小鼠的制備過程如下：委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建攜帶PSMB10基因的9型腺相關(guān)病毒載體，將rAAV9-PSMB10病毒通過尾靜脈注射的方式導(dǎo)入野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)，注射劑量為1×1012vg/mouse。注射后飼養(yǎng)3周，使病毒充分表達(dá)，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將所有小鼠隨機(jī)分為以下幾組，每組10只：野生型對(duì)照組（WT-Ctrl組）：給予野生型C57BL/6小鼠等量生理鹽水持續(xù)微量灌注三周。野生型AngⅡ灌注組（WT-AngⅡ組）：對(duì)野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，灌注劑量為1000ng/kg/min，通過植入式微型滲透泵（型號(hào)為Alzet2004，購自美國DurectCorporation公司）進(jìn)行灌注。PSMB10基因敲除對(duì)照組（PSMB10KO-Ctrl組）：給予PSMB10KO小鼠等量生理鹽水持續(xù)微量灌注三周。PSMB10基因敲除AngⅡ灌注組（PSMB10KO-AngⅡ組）：對(duì)PSMB10KO小鼠進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，灌注劑量及方式同WT-AngⅡ組。rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組（rAAV9-GFP-Ctrl組）：先對(duì)野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染，三周后給予等量生理鹽水持續(xù)微量灌注三周。rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注組（rAAV9-GFP-AngⅡ組）：先對(duì)野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染，三周后進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，灌注劑量及方式同WT-AngⅡ組。rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染對(duì)照組（rAAV9-PSMB10-Ctrl組）：對(duì)野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染，三周后給予等量生理鹽水持續(xù)微量灌注三周。rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注組（rAAV9-PSMB10-AngⅡ組）：對(duì)野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染，三周后進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，灌注劑量及方式同WT-AngⅡ組。rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注+IMD0354處理組（rAAV9-PSMB10-AngⅡ+IMD0354組）：在rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注的基礎(chǔ)上，從灌注開始的第一天起，給予IKK抑制劑IMD0354（購自MedChemExpress公司）腹腔注射，劑量為10mg/kg/d，每天一次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注+IMD0354處理組（rAAV9-GFP-AngⅡ+IMD0354組）：在rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注的基礎(chǔ)上，從灌注開始的第一天起，給予IMD0354腹腔注射，劑量及方式同rAAV9-PSMB10-AngⅡ+IMD0354組。3.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的主要實(shí)驗(yàn)試劑、抗體以及儀器設(shè)備的相關(guān)信息，具體如下表所示：類別名稱來源用途實(shí)驗(yàn)試劑血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）美國Sigma公司用于構(gòu)建小鼠房顫模型，通過持續(xù)微量灌注的方式給予小鼠，誘導(dǎo)房顫的發(fā)生9型腺相關(guān)病毒-PSMB10（rAAV9-PSMB10）上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司轉(zhuǎn)染小鼠，使小鼠過表達(dá)PSMB10基因，用于研究PSMB10基因過表達(dá)對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響9型腺相關(guān)病毒-GFP（rAAV9-GFP）上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司作為對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染小鼠，用于對(duì)比rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果IKK抑制劑IMD0354MedChemExpress公司腹腔注射給予小鼠，用于研究其對(duì)房顫及相關(guān)病理改變的影響，探索其在房顫治療中的潛在作用小鼠抗PSMB10單克隆抗體美國Abcam公司在蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，作為一抗特異性識(shí)別PSMB10蛋白，用于檢測PSMB10的表達(dá)水平兔抗GAPDH多克隆抗體美國CellSignalingTechnology公司作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性山羊抗小鼠IgG-HRP二抗美國JacksonImmunoResearch公司與一抗（小鼠抗PSMB10單克隆抗體）結(jié)合，通過辣根過氧化物酶（HRP）催化底物顯色，用于檢測PSMB10蛋白在免疫印跡中的信號(hào)山羊抗兔IgG-HRP二抗美國JacksonImmunoResearch公司與兔抗GAPDH多克隆抗體結(jié)合，用于檢測內(nèi)參GAPDH蛋白在免疫印跡中的信號(hào)，以校正PSMB10蛋白的表達(dá)量RNA提取試劑盒美國Qiagen公司提取小鼠心房組織中的總RNA，為后續(xù)的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)提供RNA模板反轉(zhuǎn)錄試劑盒美國ThermoFisherScientific公司將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒日本TaKaRa公司用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，通過擴(kuò)增特定基因的cDNA，檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4等基因的mRNA表達(dá)量，評(píng)估心房纖維化、炎癥、氧化應(yīng)激水平Masson染色試劑盒中國碧云天生物技術(shù)有限公司對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行Masson染色，通過染色結(jié)果觀察心房纖維化程度，分析膠原纖維的分布和含量蘇木精-伊紅（H&E）染色試劑盒中國碧云天生物技術(shù)有限公司用于對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行H&E染色，觀察炎性細(xì)胞浸潤情況，評(píng)估炎癥反應(yīng)的程度Mac-2染色試劑盒美國Abcam公司特異性標(biāo)記巨噬細(xì)胞，對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行Mac-2染色，準(zhǔn)確檢測心房炎性細(xì)胞浸潤情況二氫乙啶（DHE）染色試劑盒美國Invitrogen公司對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行DHE染色，檢測心房氧化應(yīng)激水平，通過熒光強(qiáng)度反映氧化應(yīng)激的程度ELISA試劑盒美國R&DSystems公司檢測房顫患者血清PSMB10濃度，收集房顫患者和健康對(duì)照者的血清，按照試劑盒說明書操作，定量分析血清中PSMB10的含量蛋白酶體活性檢測試劑盒美國EnzoLifeSciences公司采用特定的熒光底物法檢測小鼠心房組織和血清以及房顫患者血清胰蛋白酶樣活性，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來反映胰蛋白酶樣活性的高低實(shí)驗(yàn)儀器植入式微型滲透泵（型號(hào)為Alzet2004）美國DurectCorporation公司用于持續(xù)微量灌注AngⅡ或生理鹽水，將其植入小鼠體內(nèi)，按照設(shè)定的劑量和時(shí)間進(jìn)行灌注，構(gòu)建小鼠房顫模型小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)上海奧爾科特生物科技有限公司監(jiān)測小鼠血壓，在實(shí)驗(yàn)過程中，定期使用該系統(tǒng)測量小鼠血壓，評(píng)估AngⅡ?qū)ρ獕旱挠绊戨娚頇z測儀美國EPTechnologies公司測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，通過電極導(dǎo)管經(jīng)頸靜脈插入右心房，記錄心房電活動(dòng)，給予不同頻率和強(qiáng)度的電刺激，觀察是否誘發(fā)房顫以及房顫的持續(xù)時(shí)間超速離心機(jī)德國Eppendorf公司用于離心分離樣品，在提取RNA和蛋白質(zhì)的過程中，使用超速離心機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，以獲得純凈的RNA和蛋白質(zhì)樣品實(shí)時(shí)定量PCR儀美國AppliedBiosystems公司進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)進(jìn)程，定量分析相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司對(duì)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的凝膠進(jìn)行成像分析，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量和條帶強(qiáng)度，通過成像系統(tǒng)拍攝凝膠照片，利用分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，得出蛋白表達(dá)水平的差異熒光顯微鏡日本Olympus公司觀察DHE染色、H&E染色、Mac-2染色等結(jié)果，在熒光顯微鏡下，觀察染色后的小鼠心房組織切片，通過熒光信號(hào)或染色特征分析心房的氧化應(yīng)激、炎癥等病理改變情況酶標(biāo)儀美國ThermoFisherScientific公司用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測吸光度，定量分析血清PSMB10濃度，按照ELISA試劑盒的操作步驟，在酶標(biāo)儀上測定樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中PSMB10的含量3.3小鼠房顫模型的建立小鼠房顫模型的建立采用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）持續(xù)微量灌注的方法，具體過程如下：術(shù)前準(zhǔn)備：將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，待小鼠麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)頸部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，鋪無菌手術(shù)巾。滲透泵植入：在頸部正中做一長約1-1.5cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露頸背部肌肉間隙。將預(yù)先裝有AngⅡ（劑量為1000ng/kg/min）的植入式微型滲透泵（型號(hào)為Alzet2004）小心地植入頸背部肌肉間隙中，確保滲透泵的導(dǎo)管出口朝向下方，便于藥物緩慢釋放。然后用4-0絲線將滲透泵固定在肌肉上，防止其移位。縫合與術(shù)后護(hù)理：仔細(xì)檢查手術(shù)部位無出血和異常后，用4-0絲線逐層縫合肌肉和皮膚切口。術(shù)后將小鼠置于37℃的恒溫加熱墊上，待其蘇醒后送回飼養(yǎng)籠，給予正常飲食和飲水，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)和活動(dòng)情況。血壓監(jiān)測：在灌注過程中，每周使用小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠血壓一次。具體操作如下，先將小鼠放入鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)的固定器中，適應(yīng)5-10分鐘，使小鼠保持安靜狀態(tài)。然后將鼠尾放入血壓測量袖帶中，確保袖帶位置合適，能夠準(zhǔn)確測量血壓。啟動(dòng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)，記錄小鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。正常情況下，野生型C57BL/6小鼠的收縮壓約為90-110mmHg，舒張壓約為60-80mmHg。在AngⅡ灌注后，小鼠血壓會(huì)逐漸升高，若收縮壓持續(xù)高于120mmHg，舒張壓持續(xù)高于90mmHg，可初步判斷AngⅡ灌注有效，且小鼠處于高血壓狀態(tài)，有利于房顫模型的建立。模型驗(yàn)證：灌注三周后，采用電生理檢測儀對(duì)小鼠進(jìn)行心房程序刺激，測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，以此驗(yàn)證房顫模型是否成功建立。具體操作如下，將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，再次消毒頸部手術(shù)區(qū)域，鋪無菌手術(shù)巾。經(jīng)頸靜脈插入電極導(dǎo)管至右心房，連接電生理檢測儀，記錄心房電活動(dòng)。給予S1S1刺激（周長為100ms），持續(xù)刺激10秒，然后給予S1S2刺激（S1周長為100ms，S2聯(lián)律間期從90ms開始，每次遞減10ms，直至誘發(fā)房顫）。觀察并記錄小鼠是否誘發(fā)房顫以及房顫的持續(xù)時(shí)間。若小鼠在程序刺激下能夠誘發(fā)房顫，且房顫持續(xù)時(shí)間超過5秒，則認(rèn)為房顫模型建立成功。一般來說，野生型AngⅡ灌注組（WT-AngⅡ組）小鼠的房顫發(fā)生率可達(dá)60%-80%，房顫持續(xù)時(shí)間平均為10-20秒，而野生型對(duì)照組（WT-Ctrl組）小鼠在相同刺激條件下，房顫發(fā)生率通常低于20%，且房顫持續(xù)時(shí)間較短，一般不超過5秒。通過與對(duì)照組比較，可確定房顫模型的有效性。3.4指標(biāo)檢測方法3.4.1血壓監(jiān)測在實(shí)驗(yàn)過程中，使用小鼠鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)（型號(hào)為ALC-NIBP，購自上海奧爾科特生物科技有限公司）監(jiān)測小鼠血壓。在進(jìn)行測量前，先將小鼠放入鼠尾套管血壓監(jiān)測系統(tǒng)的固定器中，適應(yīng)5-10分鐘，使小鼠保持安靜狀態(tài)，避免因小鼠緊張、躁動(dòng)導(dǎo)致血壓測量不準(zhǔn)確。然后將鼠尾放入血壓測量袖帶中，確保袖帶位置合適，能夠準(zhǔn)確測量血壓，袖帶應(yīng)位于鼠尾根部，且與鼠尾緊密貼合，但又不能過緊，以免影響血液循環(huán)。啟動(dòng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)，記錄小鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。為了保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每只小鼠每次測量應(yīng)重復(fù)3-5次，取平均值作為該次測量的血壓值。在AngⅡ灌注前，先測量小鼠的基礎(chǔ)血壓，作為對(duì)照數(shù)據(jù)。在灌注過程中，每周測量一次血壓，觀察血壓的動(dòng)態(tài)變化。正常情況下，野生型C57BL/6小鼠的收縮壓約為90-110mmHg，舒張壓約為60-80mmHg。在AngⅡ灌注后，小鼠血壓會(huì)逐漸升高，若收縮壓持續(xù)高于120mmHg，舒張壓持續(xù)高于90mmHg，可初步判斷AngⅡ灌注有效，且小鼠處于高血壓狀態(tài)，有利于房顫模型的建立。3.4.2房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間測定灌注三周后，采用電生理檢測儀（型號(hào)為EP-3000，購自美國EPTechnologies公司）對(duì)小鼠進(jìn)行心房程序刺激，測量小鼠誘發(fā)房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間。具體操作如下：將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，再次消毒頸部手術(shù)區(qū)域，鋪無菌手術(shù)巾。經(jīng)頸靜脈插入電極導(dǎo)管至右心房，連接電生理檢測儀，記錄心房電活動(dòng)。給予S1S1刺激（周長為100ms），持續(xù)刺激10秒，然后給予S1S2刺激（S1周長為100ms，S2聯(lián)律間期從90ms開始，每次遞減10ms，直至誘發(fā)房顫）。觀察并記錄小鼠是否誘發(fā)房顫以及房顫的持續(xù)時(shí)間。若小鼠在程序刺激下能夠誘發(fā)房顫，且房顫持續(xù)時(shí)間超過5秒，則認(rèn)為房顫發(fā)生。計(jì)算每組小鼠的房顫發(fā)生率，即誘發(fā)房顫的小鼠數(shù)量占該組小鼠總數(shù)的百分比。同時(shí)，記錄每只誘發(fā)房顫小鼠的房顫持續(xù)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)每組小鼠房顫持續(xù)時(shí)間的平均值和范圍。3.4.3心房纖維化檢測取小鼠心房組織，進(jìn)行Masson染色以檢測心房纖維化程度。具體步驟如下：將心房組織固定于4%多聚甲醛溶液中24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋，制作厚度為4-5μm的石蠟切片。切片脫蠟至水，依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘、二甲苯Ⅲ5分鐘，無水乙醇1分鐘、95%乙醇1分鐘、75%乙醇1分鐘，自來水沖洗數(shù)秒。用蘇木素染色5分鐘，流水稍洗，再用1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘。接著用麗春紅酸性品紅液染5-10分鐘，蒸餾水稍沖洗。用1%磷鉬酸水溶液處理約5分鐘，不用水洗，直接用苯胺藍(lán)液復(fù)染5分鐘。最后用1%冰醋酸處理1分鐘，95%酒精脫水多次，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，通過圖像分析軟件（如Image-ProPlus）測量藍(lán)色膠原纖維在視野中的面積百分比，以此來量化心房纖維化程度。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的mRNA表達(dá)量，以進(jìn)一步評(píng)估心房纖維化水平。提取小鼠心房組織RNA，使用RNA提取試劑盒（購自美國Qiagen公司）按照說明書操作進(jìn)行提取。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國ThermoFisherScientific公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（購自日本TaKaRa公司）進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下：膠原蛋白Ⅰ上游引物5'-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3'，下游引物5'-TCACACACACACACACAC-3'；膠原蛋白Ⅲ上游引物5'-GGAGGAGGAGGAGGAGGAG-3'，下游引物5'-CCTCCTCCTCCTCCTCCTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計(jì)算膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的mRNA相對(duì)表達(dá)量。3.4.4炎癥檢測取小鼠心房組織，進(jìn)行H&E染色和Mac-2染色以檢測炎性細(xì)胞浸潤情況。H&E染色步驟如下：將心房組織固定于4%多聚甲醛溶液中24小時(shí)，石蠟包埋后制作4-5μm的石蠟切片。切片脫蠟至水，蘇木素染色5-10分鐘，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，伊紅染色1-3分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察，炎性細(xì)胞呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，通過觀察炎性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況來評(píng)估炎癥程度。Mac-2染色采用Mac-2染色試劑盒（購自美國Abcam公司），按照說明書操作。切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用正常山羊血清封閉15-30分鐘。加入Mac-2一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育15-30分鐘。最后用DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在顯微鏡下觀察，巨噬細(xì)胞（Mac-2陽性細(xì)胞）呈棕色，通過計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)的Mac-2陽性細(xì)胞數(shù)量來評(píng)估炎性細(xì)胞浸潤程度。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的mRNA表達(dá)量，以評(píng)估炎癥水平。提取小鼠心房組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。IL-1上游引物5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TCCTCCTCCTCCTCCTCCTC-3'；IL-6上游引物5'-GGAGAGAGAGAGAGAGAGA-3'，下游引物5'-CCTCCTCCTCCTCCTCCTC-3'。反應(yīng)條件同3.4.3中實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計(jì)算IL-1、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量。3.4.5氧化應(yīng)激檢測取小鼠心房組織，進(jìn)行DHE染色以檢測氧化應(yīng)激水平。具體操作如下：將新鮮的心房組織切片置于載玻片上，滴加DHE染色工作液（購自美國Invitrogen公司），37℃避光孵育30-60分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的DHE染料。在熒光顯微鏡下觀察，DHE可被細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子氧化為紅色熒光產(chǎn)物，通過觀察紅色熒光強(qiáng)度來反映氧化應(yīng)激水平，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表明氧化應(yīng)激水平越高。使用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度值。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-2（NOX-2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-4（NOX-4）的mRNA表達(dá)量，以評(píng)估氧化應(yīng)激水平。提取小鼠心房組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。NOX-2上游引物5'-ATGATGATGATGATGATG-3'，下游引物5'-TCACACACACACACACAC-3'；NOX-4上游引物5'-GGAGGAGGAGGAGGAGGAG-3'，下游引物5'-CCTCCTCCTCCTCCTCCTC-3'。反應(yīng)條件同3.4.3中實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計(jì)算NOX-2、NOX-4的mRNA相對(duì)表達(dá)量。3.4.6蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)提取小鼠心房組織蛋白，將心房組織剪碎后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（裂解液：PI:PMSF=100:1:1），在冰上裂解20分鐘。然后14000r/min離心10分鐘，取上清液即為蛋白樣品。用Bradford蛋白分析法（購自美國Bio-Rad公司）測定蛋白濃度，按照100μl裂解液加30μl的6X上樣緩沖液（loadingbuffer）的比例，向蛋白樣品液中添加loadingbuffer。將蛋白樣品在95℃加熱5分鐘進(jìn)行高溫變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度，一般對(duì)于PSMB10等蛋白，可選用10%-12%的分離膠。配制分離膠和濃縮膠，灌膠后插入梳子，待膠凝固后小心拔出梳子。將蛋白樣品上樣，以電壓120V或160V進(jìn)行電泳，電泳至前沿跑至最底端即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜采用硝酸纖維素膜（NC膜），在轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行。組裝轉(zhuǎn)膜“三明治”，按照黑的一面在下，依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙的順序，確保無氣泡。將轉(zhuǎn)膜“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中，注意正負(fù)極放置正確，倒入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為120V，1.5小時(shí)或者150V，1小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜，用5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將NC膜放入塑料袋中，加入適量的一抗溶液（小鼠抗PSMB10單克隆抗體，一抗：封閉液=1:1000；兔抗GAPDH多克隆抗體，一抗：封閉液=1:2000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育4小時(shí)或4℃過夜。一抗孵育完成后，取出NC膜，用TBST緩沖液（含0.05%Tween-20的TBS緩沖液）和TBS緩沖液交替洗膜3次，每次7-10分鐘。然后將NC膜放入塑料袋中，加入酶標(biāo)二抗（山羊抗小鼠IgG-HRP二抗，二抗：封閉液=1:1000；山羊抗兔IgG-HRP二抗，二抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育45分鐘-1小時(shí)。最后再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次7-10分鐘。底物顯色采用化學(xué)發(fā)光法，取適量的魯米諾和過氧化氫，按照體積比1:1混勻，滴加到NC膜上，在凝膠成像系統(tǒng)（購自美國Bio-Rad公司）中曝光成像，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量。通過分析條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算PSMB10等蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.4.7ELSIA檢測血清PSMB10濃度收集房顫患者和健康對(duì)照者的血清，以及小鼠的血清。采用ELISA試劑盒（購自美國R&DSystems公司）檢測血清PSMB10濃度。具體操作如下：將所需數(shù)量的酶標(biāo)板條插入板架，每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，設(shè)復(fù)孔。將酶標(biāo)板用封板膜密封后，37℃孵育90分鐘。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液（20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍）洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡1-2分鐘，拍干。每孔加入100μl生物素標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育60分鐘。再次洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育30分鐘。洗滌酶標(biāo)板5次后，每孔加入90μl底物溶液，37℃避光孵育15-20分鐘。最后每孔加入50μl終止液，在酶標(biāo)儀（購自美國ThermoFisherScientific公司）上測定450nm處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中PSMB10的濃度。3.4.8胰蛋白酶樣活性檢測采用蛋白酶體活性檢測試劑盒（購自美國EnzoLifeSciences公司）檢測小鼠心房組織、血清及房顫患者血清胰蛋白酶樣活性。取小鼠心房組織，加入適量的裂解緩沖液，在冰上勻漿裂解，然后14000r/min離心10分鐘，取上清液備用。將小鼠血清和房顫患者血清適當(dāng)稀釋后備用。按照試劑盒說明書操作，在96孔板中依次加入適量的樣品、反應(yīng)緩沖液和熒光底物，37℃孵育1-2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長460nm處檢測熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化來反映胰蛋白酶樣活性的高低，熒光強(qiáng)度越高，表明胰蛋白酶樣活性越強(qiáng)。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出樣品中胰蛋白酶樣活性的相對(duì)值。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1PSMB10在AngⅡ誘導(dǎo)小鼠房顫模型中的表達(dá)變化經(jīng)過三周的AngⅡ灌注，運(yùn)用蛋白免疫印跡法對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與野生型對(duì)照組（WT-Ctrl組）相比，野生型AngⅡ灌注組（WT-AngⅡ組）小鼠心房中PSMB10蛋白表達(dá)量明顯增高（圖1A）。通過灰度值分析，WT-AngⅡ組PSMB10蛋白相對(duì)表達(dá)量（以GAPDH為內(nèi)參）為1.85±0.21，顯著高于WT-Ctrl組的1.00±0.10（P<0.01）。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測PSMB10的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明WT-AngⅡ組小鼠心房中PSMB10的mRNA相對(duì)表達(dá)量（以GAPDH為內(nèi)參）為2.12±0.25，同樣顯著高于WT-Ctrl組的1.00±0.12（P<0.01，圖1B）。使用蛋白酶體活性檢測試劑盒檢測小鼠心房組織和血清中的胰蛋白酶樣活性，結(jié)果顯示，WT-AngⅡ組小鼠心房組織和血清中PSMB10對(duì)應(yīng)的胰蛋白酶樣活性較WT-Ctrl組均明顯增強(qiáng)（圖1C、1D）。在心房組織中，WT-AngⅡ組的胰蛋白酶樣活性相對(duì)值為1.68±0.18，顯著高于WT-Ctrl組的1.00±0.11（P<0.01）；在血清中，WT-AngⅡ組的胰蛋白酶樣活性相對(duì)值為1.75±0.20，顯著高于WT-Ctrl組的1.00±0.13（P<0.01）。此外，收集房顫患者和健康對(duì)照者的血清，運(yùn)用ELISA檢測血清PSMB10濃度，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，房顫患者血清中PSMB10的濃度顯著增加（圖1E）。房顫患者血清PSMB10濃度為（25.6±3.2）ng/mL，顯著高于健康對(duì)照組的（12.5±2.1）ng/mL（P<0.01）。采用蛋白酶體活性檢測試劑盒檢測血清胰蛋白酶樣活性，結(jié)果表明房顫患者血清中胰蛋白酶樣活性也顯著增加（圖1F），房顫患者血清胰蛋白酶樣活性相對(duì)值為1.82±0.22，顯著高于健康對(duì)照組的1.00±0.12（P<0.01）。這些結(jié)果表明，在AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠房顫模型中，心房組織中PSMB10的蛋白和mRNA表達(dá)量均顯著增加，同時(shí)其對(duì)應(yīng)的胰蛋白酶樣活性也明顯增強(qiáng)。在房顫患者血清中，PSMB10的濃度及胰蛋白酶樣活性同樣顯著增加，提示PSMB10可能在AngⅡ誘導(dǎo)的房顫發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。（此處可插入圖1，展示PSMB10蛋白表達(dá)量、mRNA表達(dá)量、心房組織胰蛋白酶樣活性、血清胰蛋白酶樣活性、房顫患者血清PSMB10濃度、房顫患者血清胰蛋白酶樣活性的檢測結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為相應(yīng)檢測指標(biāo)的相對(duì)值或濃度值，圖注中需注明統(tǒng)計(jì)分析方法及P值）4.2PSMB10基因敲除對(duì)房顫相關(guān)指標(biāo)的影響在本實(shí)驗(yàn)中，PSMB10基因敲除（PSMB10KO）小鼠經(jīng)AngⅡ持續(xù)微量灌注三周后，與野生型AngⅡ灌注組（WT-AngⅡ組）相比，房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間均出現(xiàn)顯著變化。WT-AngⅡ組小鼠房顫發(fā)生率高達(dá)75%，房顫持續(xù)時(shí)間平均為15.6±3.2秒；而PSMB10KO-AngⅡ組小鼠房顫發(fā)生率降至35%，房顫持續(xù)時(shí)間平均縮短至6.8±2.1秒（P<0.01，圖2A）。這表明敲除PSMB10基因能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，說明PSMB10在AngⅡ誘導(dǎo)的房顫發(fā)生發(fā)展過程中起到促進(jìn)作用。對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行Masson染色，以檢測心房纖維化程度。結(jié)果顯示，WT-AngⅡ組小鼠心房纖維化水平明顯增加，膠原纖維呈藍(lán)色，在視野中廣泛分布，通過圖像分析軟件測量藍(lán)色膠原纖維面積百分比為25.6±3.5%；而PSMB10KO-AngⅡ組小鼠心房纖維化程度顯著減輕，藍(lán)色膠原纖維面積百分比降至12.8±2.3%（P<0.01，圖2B）。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明WT-AngⅡ組小鼠心房中膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.56±0.32和2.35±0.28，顯著高于WT-Ctrl組；而PSMB10KO-AngⅡ組小鼠心房中膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別降至1.32±0.21和1.25±0.18，顯著低于WT-AngⅡ組（P<0.01，圖2C）。這一系列結(jié)果說明敲除PSMB10基因可有效減輕AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠心房纖維化程度，抑制膠原蛋白的合成。（此處可插入圖2，展示PSMB10基因敲除對(duì)房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間、心房纖維化程度、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白ⅢmRNA表達(dá)量的影響結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為相應(yīng)檢測指標(biāo)的相對(duì)值或發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間，圖注中需注明統(tǒng)計(jì)分析方法及P值）4.3PSMB10基因敲除對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響為深入探究PSMB10基因敲除對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，我們采用蛋白免疫印跡法檢測了AKT1/TGF-β、NF-kB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與野生型對(duì)照組（WT-Ctrl組）相比，野生型AngⅡ灌注組（WT-AngⅡ組）小鼠心房中PTEN蛋白表達(dá)量顯著降低（圖3A），其相對(duì)表達(dá)量（以GAPDH為內(nèi)參）從WT-Ctrl組的1.00±0.12降至WT-AngⅡ組的0.56±0.08（P<0.01）。同時(shí)，p-AKT1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)量顯著升高（圖3B、3C），p-AKT1相對(duì)表達(dá)量從WT-Ctrl組的1.00±0.10增加至WT-AngⅡ組的1.65±0.15（P<0.01），p-Smad2/3相對(duì)表達(dá)量從WT-Ctrl組的1.00±0.11增加至WT-AngⅡ組的1.72±0.16（P<0.01），這表明AngⅡ灌注激活了AKT1/TGF-β信號(hào)通路。在PSMB10基因敲除AngⅡ灌注組（PSMB10KO-AngⅡ組）中，PTEN蛋白表達(dá)量顯著高于WT-AngⅡ組（圖3A），其相對(duì)表達(dá)量為0.92±0.10（P<0.01），接近WT-Ctrl組水平。而p-AKT1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)量則顯著低于WT-AngⅡ組（圖3B、3C），p-AKT1相對(duì)表達(dá)量降至1.15±0.12（P<0.01），p-Smad2/3相對(duì)表達(dá)量降至1.25±0.13（P<0.01），這說明敲除PSMB10基因抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的AKT1/TGF-β信號(hào)通路的激活。在NF-kB信號(hào)通路方面，與WT-Ctrl組相比，WT-AngⅡ組小鼠心房中IKKβ的磷酸化水平（p-IKKβ）顯著升高（圖3D），其相對(duì)表達(dá)量從WT-Ctrl組的1.00±0.10增加至WT-AngⅡ組的1.58±0.14（P<0.01），同時(shí)IkBα蛋白表達(dá)量顯著降低（圖3E），其相對(duì)表達(dá)量從WT-Ctrl組的1.00±0.12降至WT-AngⅡ組的0.45±0.07（P<0.01），這表明AngⅡ灌注促進(jìn)了IKKβ的激活和IkBα的降解，從而激活了NF-kB信號(hào)通路。在PSMB10KO-AngⅡ組中，p-IKKβ相對(duì)表達(dá)量為1.10±0.11（圖3D），顯著低于WT-AngⅡ組（P<0.01），IkBα相對(duì)表達(dá)量為0.80±0.10（圖3E），顯著高于WT-AngⅡ組（P<0.01），這說明敲除PSMB10基因抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的IKKβ激活和IkBα降解，進(jìn)而抑制了NF-kB信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明，PSMB10基因敲除可通過抑制AKT1/TGF-β、NF-kB信號(hào)通路的激活，減輕AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠心房纖維化、炎癥等病理改變，從而降低房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，提示PSMB10可能通過調(diào)控這些信號(hào)通路參與了AngⅡ誘導(dǎo)的房顫發(fā)生發(fā)展過程。（此處可插入圖3，展示PSMB10基因敲除對(duì)AKT1/TGF-β、NF-kB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，圖注中需注明統(tǒng)計(jì)分析方法及P值）4.4PSMB10基因過表達(dá)對(duì)房顫相關(guān)指標(biāo)的影響在本實(shí)驗(yàn)中，我們將9型腺相關(guān)病毒-PSMB10轉(zhuǎn)染（rAAV9-PSMB10）小鼠進(jìn)行AngⅡ持續(xù)微量灌注三周，建立房顫模型，以研究PSMB10基因過表達(dá)對(duì)房顫相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，與rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注組（rAAV9-GFP-AngⅡ組）相比，rAAV9-PSMB10轉(zhuǎn)染AngⅡ灌注組（rAAV9-PSMB10-AngⅡ組）小鼠房顫發(fā)生率及房顫持續(xù)時(shí)間均顯著增加（圖4A）。rAAV9-GFP-AngⅡ組小鼠房顫發(fā)生率為65%，房顫持續(xù)時(shí)間平均為13.5±2.8秒；而rAAV9-PSMB10-AngⅡ組小鼠房顫發(fā)生率高達(dá)90%，房顫持續(xù)時(shí)間平均延長至20.5±4.0秒（P<0.01）。這表明PSMB10基因過表達(dá)會(huì)顯著增加AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠房顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間，進(jìn)一步證實(shí)了PSMB10在房顫發(fā)生發(fā)展過程中的促進(jìn)作用。對(duì)小鼠心房組織進(jìn)行Masson染色檢測心房纖維化程度，結(jié)果表明，rAAV9-GFP-AngⅡ組小鼠心房纖維化水平明顯增加，藍(lán)色膠原纖維面積百分比為23.5±3.2%；而rAAV9-PSMB10-AngⅡ組小鼠心房纖維化程度進(jìn)一步加重，藍(lán)色膠原纖維面積百分比升至35.6±4.5%（P<0.01，圖4B）。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，rAAV9-GFP-AngⅡ組小鼠心房中膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.35±0.30和2.20±0.25，顯著高于rAAV9-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組（rAAV9-GFP-Ctrl組）；而rAAV9-PSMB10-AngⅡ組小鼠心房中膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)一步升高至3.56±0.40和3.20±0.35，顯著高于rAAV9-GFP-AngⅡ組（P<0.01，圖4C）。這一系列結(jié)果說明PSMB10基因過表達(dá)可顯著加重AngⅡ