Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15試劑或材料 16儀器設(shè)備 27實驗步驟 28結(jié)果判定 39廢棄物處理 3附錄A（資料性）相關(guān)試劑的配制 4附錄B（規(guī)范性）牦牛大腸桿菌、多殺巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR產(chǎn)物電泳圖 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心（畜牧總站）、西藏農(nóng)牧大學(xué)、林芝市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)站。本文件主要起草人：王冬經(jīng)，曾江勇，蘇中華，馬弘財，石斌，羅潤波，夏晨陽，元振杰、甘富斌。牦牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR檢測技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牦牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重PCR檢測技術(shù)。本文件適用于牦牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測、診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫NY/541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范SN/T2025動物檢疫實驗室生物安全操作規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多重PCR）多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加上兩對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)?？s略語bp：堿基對DNA：脫氧核糖核酸PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑或材料本方法試驗用水應(yīng)符合GB/T6682的相關(guān)規(guī)定。除另有規(guī)定外，所有化學(xué)試劑均采用分析純。DL500DNAMaker。2×TaqMasterMix。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。3%瓊脂糖凝膠，配制方法見附錄A中A.1。50×TAE緩沖液。核酸染料。儀器設(shè)備高速冷凍離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速應(yīng)不低于12000r/min。冰箱，2℃~8℃和-20℃兩種。微量移液器及配套吸頭，量程規(guī)格應(yīng)包含2.5μL、10μL、100μL。PCR儀及配套反應(yīng)管（板）。1.5mL離心管，應(yīng)無DNAase和RNAase。渦旋振蕩器。電子天平，精密度千分之一以上。生物安全柜。電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。高壓滅菌鍋。金屬浴。實驗步驟實驗室規(guī)范多重PCR檢測的實驗室規(guī)范應(yīng)符合GB19489和GB/T27401要求。樣本前處理樣本的采集、保存與運輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。樣品DNA提取按照商品化細(xì)菌基因組DNA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。多重PCR擴(kuò)增引物選擇大腸桿菌16SrRNA基因、多殺巴氏桿菌KMT-1基因和產(chǎn)氣莢膜梭菌CPA基因作為靶基因設(shè)計引物。引物信息如表1所示：引物序列表細(xì)菌引物名稱序列（5，→3，）產(chǎn)物長度/bp大腸桿菌E.coli-FATGCTGCCTCACTGAATGC141E.coli-RAGGTAACTGCGGGCTTGTC多殺性巴氏桿菌Pm-FAAACCGCTCTGTCGT248Pm-RTGAGTGGGCTTGTCG產(chǎn)氣莢膜梭菌Cp-FGCAGAGGAAAGAAAAGAAC190Cp-RCCCAATCATCCCAACTAT陽性對照和陰性對照以牦牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA分別作為陽性對照。以任意一種非目標(biāo)菌的DNA作為陰性對照。多重PCR反應(yīng)體系50μL體系：2×TaqMix25μL，DNA模板1μL，上、下引物各1μL，純水18μL。多重PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳將50×TAE緩沖液稀釋為1×TAE緩沖液；用1×TAE緩沖液加入0.1%體積的核酸染料制備3%瓊脂糖凝膠；取4~6μL多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行點樣，用DL500DNAMaker作參照；電壓100V，電流100A，電泳30~40min。用凝膠成像儀觀察分析，記錄、保存電泳結(jié)果。結(jié)果判定檢測結(jié)果成立條件牦牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性對照的多重PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，分別得到了141bp、248bp和190bp的特異性條帶，同時陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后沒有任何條帶，則試驗成立，否則不成立。結(jié)果判定在試驗結(jié)果成立的前提下，若樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在141bp、248bp和190bp的位置上出現(xiàn)特異性條帶，則判定為大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測陽性；若同時出現(xiàn)2條或3條特異性條帶，則判定為對應(yīng)的病原混合感染(見附錄B)。若樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在141bp、248bp和190bp的位置上均未出現(xiàn)特異性條帶，則判定為陰性。廢棄物處理檢測過程中的廢棄物無害化處理應(yīng)按照GB19489和SN/T2025的規(guī)定執(zhí)行。

（資料性）

相關(guān)試劑的配制3%瓊脂糖凝膠稱取3.0g瓊脂糖，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，加熱融化，溫度將至60℃時，加入10μL核酸染料，倒膠。

（規(guī)范性）

牦牛大腸桿菌、多殺巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭