InVivoMammalianAlkalineCometAssay

1范圍

本規(guī)范確定了體內(nèi)彗星試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測(cè)。

2試驗(yàn)?zāi)康?/p>

評(píng)價(jià)化妝品用原料的遺傳毒性。

3定義

3.1堿性單細(xì)胞凝膠電泳：在單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核水平檢測(cè)DNA損傷的一種敏感技術(shù)。

3.2彗星：經(jīng)過電泳后細(xì)胞核的形狀，形似彗星。細(xì)胞核部分形成彗星頭部，在電場(chǎng)力的

作用下脫離細(xì)胞核的DNA片斷形成彗尾。

3.3“刺猬狀”細(xì)胞：顯微圖像下由小或模糊不清的頭以及大的彌漫性尾組成的細(xì)胞。

3.4尾部DNA含量：反應(yīng)總強(qiáng)度（彗頭與彗尾之和）中彗星的強(qiáng)度。可反應(yīng)DNA片斷的

數(shù)量，用百分比表示。

3.5最大耐受劑量：試驗(yàn)期內(nèi)引起動(dòng)物產(chǎn)生輕微毒性效應(yīng)的最高劑量，在這個(gè)劑量下，動(dòng)

物產(chǎn)生明顯的臨床體征，如異常行為或反應(yīng)，輕微的體重下降或靶組織細(xì)胞毒性，但是并不

會(huì)引起死亡或痛苦。

4試驗(yàn)原理

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在強(qiáng)堿性溶液中（pH>13）會(huì)松弛，在電場(chǎng)力的作用下，正常的DNA

保留在原位不動(dòng)，而單鏈或雙鏈DNA斷裂所形成的DNA片斷在會(huì)向陽極移動(dòng)，形成彗星

狀。DNA片斷所形成的彗星狀拖尾的長(zhǎng)度及強(qiáng)度可以反應(yīng)DNA片斷的大小和數(shù)量。通過

檢測(cè)尾部DNA含量（%）等終點(diǎn)指標(biāo)可以評(píng)價(jià)DNA損傷程度。

5試驗(yàn)基本原則

動(dòng)物染毒一定時(shí)間后處死并解剖動(dòng)物，獲取靶器官，制備單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液與瓊

脂糖混合后經(jīng)過裂解過程去除細(xì)胞膜，并暴露于強(qiáng)堿性溶液（pH>13）中進(jìn)行DNA解旋，

經(jīng)過電泳、固定、染色，在熒光顯微鏡下觀察，通過分析軟件對(duì)彗星狀細(xì)胞進(jìn)行分析，判定

DNA損傷程度。每個(gè)樣品需分析足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行最終結(jié)果評(píng)價(jià)。

6溶液的配制（所有溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配）

6.10.5%(w/v)低熔點(diǎn)凝膠

低熔點(diǎn)膠以0.5%(w/v)的濃度溶于D-PBS（無Ca2+、Mg2+和酚紅）溶液中，并利用微波

爐加熱。配好的膠保存在37℃~45℃，用后棄去。

6.21.0%~1.5%（w/v）基底層標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠

常規(guī)熔點(diǎn)瓊脂糖經(jīng)微波爐加熱溶于磷酸鹽緩沖液中（pH7.0~7.4，不含Ca2+、Mg2+和酚

紅），制成1.0%~1.5%（w/v）標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠。

6.3裂解液

用純水配制溶液，裂解液終濃度為100mmol/LEDTA-2Na、10mmol/Ltris-base、2.5mol/L

NaCl，用5mol/LNaOH或6mol/LHCl將溶液pH調(diào)至10，保存于4℃~8℃冰箱中。試

驗(yàn)前，向裂解液中加入1%(v/v)triton-X100和10%(v/v)DMSO，保存于4℃~8℃冰箱至

少30min。

6.4堿性解旋液和電泳液

用純水配制溶液，堿性解旋液和電泳液終濃度為1mmol/LEDTA-2Na和300mmol/L

NaOH，pH≥13，用前保存于4~8℃冰箱中，并測(cè)定其pH值。

6.5中和液

用純水配制溶液，中和液終濃度為0.4mol/Ltris-base（用5mol/LNaOH或6mol/LHCl

調(diào)節(jié)pH7.5），保存于4℃~8℃冰箱中。

6.6組織勻漿緩沖液

將EDTA-2Na溶于HBSS（無Ca2+、Mg2+和酚紅）中，終濃度為20mmol/LEDTA-2Na，

用5mol/LNaOH或6mol/LHCl將其pH調(diào)至7.5，保存于4℃~8℃冰箱中，使用前加入

10%DMSO。

6.7染液

DNA熒光染料（如SYBRGold、SYBRGreenI、Gelred、碘化丙啶或溴化乙錠等），制

備和使用按照產(chǎn)品要求。

7實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境

7.1動(dòng)物的選擇

動(dòng)物的選擇應(yīng)符合GB14922.1和GB14922.2的有關(guān)規(guī)定，選用SPF級(jí)健康成年嚙齒類

動(dòng)物。常用6周齡以上雄性大鼠。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過±20%。

7.2動(dòng)物飼養(yǎng)

動(dòng)物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合GB14925、飲用水應(yīng)符合GB5749、飼料應(yīng)符合GB14924的有關(guān)

規(guī)定?？煞只\群飼（每籠通常不超過5只），也可單籠飼養(yǎng)。室內(nèi)的溫度應(yīng)控制在22℃（±3℃）。

相對(duì)濕度應(yīng)控制在50%~60%，不低于30%，最高不超過70%（清潔時(shí)例外）。照明應(yīng)控制

為12h光照、12h黑暗。常規(guī)飲食，自由飲水。

7.3動(dòng)物分組

首先應(yīng)確定實(shí)驗(yàn)分組，動(dòng)物隨機(jī)分配為對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少適

應(yīng)5天。一般實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要三個(gè)劑量組以及陰性和陽性對(duì)照組，每組動(dòng)物至少5只。編號(hào)應(yīng)

使用創(chuàng)傷較小的方法，包括：耳孔法、標(biāo)簽法、烙印法、染色法。

8試驗(yàn)條件

8.1溶劑

溶劑不應(yīng)該產(chǎn)生毒性作用，并且不應(yīng)當(dāng)與受試物產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用不常用的溶劑，

應(yīng)有數(shù)據(jù)支持該溶劑在受試動(dòng)物的應(yīng)用、暴露途徑及檢測(cè)終點(diǎn)等方面是可行的。應(yīng)根據(jù)受試

物的理化性質(zhì)（水溶性或脂溶性）確定受試物所用的溶劑，通常用水、植物油等。應(yīng)當(dāng)注意

的是，某些溶劑（特別是粘稠的溶劑）多次使用后，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及在接觸部位可能增加

DNA鏈斷裂的背景水平。

8.2樣品的制備

固體受試物應(yīng)溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲谢蚧旌显陲嬍郴蝻嬎?。液體受試物可直接或稀釋后染

毒。用吸入暴露時(shí)，根據(jù)受試物的物理化學(xué)性質(zhì)，將其處理為氣體、蒸汽或氣溶膠。受試物

應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

8.3對(duì)照

陽性對(duì)照。每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照，每種性別至少有3只可供分析的動(dòng)物。如需進(jìn)

行多次采樣（例如，用單一的染毒方案），不僅需要在每一個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置陽性對(duì)照，而且要

確保平行性。陽性對(duì)照的暴露途徑可以與受試物不同。陽性對(duì)照物質(zhì)應(yīng)該能夠引起靶器官產(chǎn)

生DNA鏈斷裂，可以選擇甲磺酸乙酯（EMS）作為陽性對(duì)照，其已經(jīng)被證實(shí)能夠誘發(fā)多種

組織器官產(chǎn)生DNA鏈斷裂效應(yīng)。陽性對(duì)照應(yīng)選擇能夠產(chǎn)生中等毒性效應(yīng)的劑量，同時(shí)能夠

評(píng)估試驗(yàn)的可行性和靈敏度，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的陽性物劑量-反應(yīng)曲線進(jìn)行選擇。陽性

對(duì)照組的尾DNA含量（%）應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)室前期建立的數(shù)據(jù)范圍保持一致。陽性對(duì)照物質(zhì)及

其靶器官（作用于嚙齒動(dòng)物）見表1。也可以選擇其他一些被證實(shí)陽性的物質(zhì)。

表1陽性對(duì)照物及其靶器官

化學(xué)物及CAS.號(hào)靶器官

甲磺酸乙酯EMS(CAS62-50-0)所有組織

乙基亞硝基脲(CAS759-73-9)肝、胃、十二指腸、空腸

甲磺酸甲酯MMS(CAS66-27-3)肝、胃、十二指腸、空腸、肺及支氣管肺泡細(xì)

胞、腎、膀胱、睪丸、骨髓造血系統(tǒng)

N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(CAS胃、十二指腸、空腸

70-25-7)

二甲基肼吡啶(CAS306-37-6)肝、腸

甲基亞硝基脲(CAS684-93-5)肝、骨髓、血細(xì)胞、腎、胃、空腸、腦

陰性對(duì)照。陰性對(duì)照組的動(dòng)物用溶劑單獨(dú)染毒，其余操作過程與試驗(yàn)組相同，每次試驗(yàn)

每個(gè)采樣點(diǎn)每種組織都應(yīng)該設(shè)置陰性對(duì)照。陰性對(duì)照組的尾DNA含量（%）應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室

前期建立的背景數(shù)據(jù)范圍之內(nèi)。必要時(shí)增加空白對(duì)照。

9劑量設(shè)計(jì)

受試物應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量組。首先通過預(yù)試驗(yàn)確定最大耐受劑量,一般取最大耐受劑量及至

少兩個(gè)適當(dāng)間隔的劑量水平（優(yōu)選劑量間隔為）。對(duì)于無毒物質(zhì)，14天或以上的染毒期，

最大染毒劑量采用1000mg/kg/BW/d。如果染毒期少于14天，最大染毒劑量采用2000

mg/kg/BW/d。

10染毒方式

染毒方式一般選用灌胃方式，除一些陽性物質(zhì)外，一般不建議腹腔注射。灌胃或注射一

次染毒的最大體積取決于受試動(dòng)物的體重，灌胃量不應(yīng)超過1mL/100g體重，水溶液受試

物最大染毒量可達(dá)到2mL/100g體重。

11采樣時(shí)間

最佳采樣時(shí)間是由受試物或染毒途徑?jīng)Q定的，依據(jù)受試物藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)[在血漿中達(dá)

到峰值的時(shí)間或組織濃度時(shí)，或在多次染毒后的穩(wěn)定狀態(tài)。在沒有動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的情況下，一

般在持續(xù)兩次及以上染毒的最后一次染毒后2h~6h采樣，或在單次染毒后的2h~6h和16

h~26h均采樣。在最后一個(gè)（或一次性）采樣后，在同一時(shí)間內(nèi)尸檢所有動(dòng)物。采樣時(shí)間還

可以依據(jù)出現(xiàn)在靶器官（如果可用）上的毒作用表現(xiàn)來判斷。

12試驗(yàn)方法

12.1組織收集及樣本制備

肝臟是最常用來研究并收集數(shù)據(jù)的組織。如果沒有任何背景資料或特定組織，即可選取

肝臟。在某些情況下，也可檢查直接接觸部位的臟器（如，經(jīng)口染毒可選取胃）。肝臟及胃

的組織收集方法如下。

肝臟：

（1）取約5mm3肝左葉中間部分，用冷的組織勻漿緩沖液洗去多余的血細(xì)胞；

（2）剩下的肝左葉部分用福爾馬林固定用于病理檢查；

（3）取下的肝組織用剪刀剪約100次以釋放細(xì)胞；

（4）用3mL組織勻漿緩沖液將剪碎的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，輕輕吹打約15次，過篩

（孔徑：40μm）得上清液用于制片；

胃：

（1）將胃沿胃大彎剪開，用冷的PBS清洗胃部；

（2）胃分為左右兩部分，分別用于制片和福爾馬林固定病理檢查；

（3）用冷的組織勻漿緩沖液清洗用于試驗(yàn)的胃，棄去前胃部分，腺胃浸于現(xiàn)配冷的組

織勻漿緩沖液15min~30min；

（4）胃表面上皮用塑料刮板/解剖刀片或Teflon刀片刮幾次后用冷的組織勻漿緩沖液充

分沖洗；

（5）用不銹鋼壓舌板平的那一面/解剖刀片或Teflon刀片輕輕刮胃粘膜5次或更多以釋

放細(xì)胞；

（6）用3mL組織勻漿緩沖液將刮下的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，輕輕吹打約15次，過篩

（孔徑：40μm）得上清液用于制片；

備注：最好將取下的胃展平后固定在硅膠墊板上再進(jìn)行細(xì)胞的刮?。ㄔ搲|板也需冰?。?。

12.2制備玻片

（1）預(yù)涂載玻片。制片前，載玻片應(yīng)用甲醇浸泡過液以除去表面的油脂，風(fēng)干。預(yù)涂

截玻片保證干凈無塵，滴1%凝膠溶液50μL于載玻片上，加上蓋玻片，使瓊脂糖溶液散開，

凝固后取下蓋玻片，風(fēng)干30min。

（2）制片過程需在單細(xì)胞懸液制備完成1h內(nèi)完成。用冷的組織勻漿緩沖液將細(xì)胞濃度

調(diào)至2.0×105個(gè)/mL。取上述制備好的各組織單細(xì)胞懸液與0.5%低熔點(diǎn)凝膠1:10混合(應(yīng)確保

玻片上的低熔點(diǎn)瓊脂糖的百分比不少于0.45%)。

（3）混勻后的單細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合物均勻鋪于第一層凝膠上面，加上蓋玻

片，置于4℃冰箱固化5-10min，至凝膠凝固，蓋玻片可慢慢從瓊脂糖上移除。

12.3裂解細(xì)胞

載玻片在預(yù)冷的裂解液中，于4℃~8℃冷藏浸泡中至少1h（或過夜），應(yīng)避免暴露于可

能含有紫外線的白光，可以使用黃光或避光。裂解后使用純凈水、中性緩沖液或磷酸鹽緩沖

液來沖洗載玻片以去除殘留洗滌劑和鹽份。

12.4解旋和電泳

載玻片均衡放置在水平電泳槽中，加入足夠的電泳溶液，使得玻片的表面被完全覆蓋（覆

蓋深度應(yīng)該始終一致），并盡量減少批次之間的變化。玻片應(yīng)該放置至少20min，等待DNA

解旋。

在0.7V/cm條件下，電泳時(shí)間不少于20min。電泳時(shí)間越長(zhǎng)（例如30min~40min，可最

大限度地提高靈敏度）已知誘變劑的陽性反應(yīng)越強(qiáng)。但是延長(zhǎng)電泳時(shí)間也可能會(huì)導(dǎo)致陰性對(duì)

照組樣品過度遷移。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整緩沖液的深度以保持電壓穩(wěn)定，以0.7V/cm的速度電

泳，電流應(yīng)在保持在300mA。在電泳開始和結(jié)束都需要記錄電流。用于解旋和電泳通常在

4℃~10℃避光進(jìn)行，記錄解旋開始時(shí)、電泳開始時(shí)和電泳結(jié)束后的溫度。

12.5中和與固定

電泳后，用預(yù)冷的中和緩沖液漂洗玻片至少5min，在37℃下干燥15min后，室溫或

冷藏保存（濕度不高于60%）。

12.6染色

使用適當(dāng)?shù)腄NA熒光染料（如SYBRGold、SYBRGreenI、Gelred、碘化丙啶或溴化乙

錠等）避光染色5min?？稍诩t光或黃光下進(jìn)行，避免受試細(xì)胞受外界其他因素影響，增加

結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。

13結(jié)果測(cè)定方法

13.1使用自動(dòng)或半自動(dòng)的圖像分析系統(tǒng)來定量評(píng)分彗星。顯微鏡使用恰當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)（如

200倍）進(jìn)行觀察，顯微鏡上可配備有熒光發(fā)射器和適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器或數(shù)碼照相機(jī)（如CCD）。

13.2分析所有玻片，包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，每個(gè)樣本（每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)組織）至少觀

察150個(gè)細(xì)胞。每劑量至少5只動(dòng)物，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)150個(gè)細(xì)胞。在同樣的密度下多觀察幾

個(gè)視野以確保彗星的尾部沒有重疊。玻片邊緣部分不需要計(jì)分。單獨(dú)記錄“刺猬狀”細(xì)胞的發(fā)

生頻率。

13.3細(xì)胞在彗星圖像中可分為3類圖譜，即計(jì)分細(xì)胞（有清晰的頭部和尾部并與相鄰細(xì)胞

沒有干擾）、“刺猬狀”細(xì)胞和不計(jì)分細(xì)胞（如彗星頭、彗星尾不清晰或重疊細(xì)胞等），其中

只有計(jì)分細(xì)胞能夠進(jìn)行尾部DNA百分比的分析，避免偽影。

13.4彗星試驗(yàn)DNA鏈斷裂的觀察終點(diǎn)以尾部DNA含量（也稱尾部強(qiáng)度）作為結(jié)果評(píng)價(jià)

與分析的指標(biāo)。

14試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)14.1試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算方法：每個(gè)樣本（每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)組織）至少觀察

150個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的終點(diǎn)指標(biāo)（尾長(zhǎng)、尾矩、尾DNA含量），每個(gè)終點(diǎn)指標(biāo)首先計(jì)

算150個(gè)細(xì)胞的平均值，再計(jì)算每劑量組5只動(dòng)物的平均值作為該劑量組該項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果。

溶劑對(duì)照組

每個(gè)細(xì)胞的終點(diǎn)指標(biāo)

????

=空白對(duì)照組

?

Ti=受試組或陽性物終點(diǎn)測(cè)定指標(biāo)（尾長(zhǎng)、尾矩、尾部DNA含量）

溶劑對(duì)照組=溶劑對(duì)照組終點(diǎn)測(cè)定M標(biāo)（尾長(zhǎng)、尾矩、尾部DNA含量）平均值

?

空白對(duì)照組=空白對(duì)照組終點(diǎn)測(cè)定指標(biāo)（尾長(zhǎng)、尾矩、尾部DNA含量）平均值

?

14.2試驗(yàn)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為試驗(yàn)成立

陰性對(duì)照組數(shù)值落在實(shí)驗(yàn)室預(yù)先建立的歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，且陰性對(duì)照組尾部

DNA含量百分比值應(yīng)<8%；

陽性對(duì)照組數(shù)值落在實(shí)驗(yàn)室預(yù)先建立的歷史陽性對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，且與陰性對(duì)照組數(shù)值

相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

14.3受試物組與平行陰性對(duì)照組相比，