CCSB41DB42湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB42/T2384—2025前言 V 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5生物安全要求 26臨床診斷 27血涂片顯微鏡鏡檢 28PCR檢測方法 39抗體檢測 510綜合判定 611標(biāo)準(zhǔn)實施及評價 6附錄A（資料性）傳播媒介長角血蜱、鐮形扇頭蜱和血紅扇頭蜱的鑒定特征 8附錄B（資料性）吉氏巴貝斯蟲病典型癥狀及病理變化 10附錄C（規(guī)范性）溶液配制 11附錄D（資料性）紅細(xì)胞內(nèi)典型蟲體形態(tài) 13附錄E（資料性）PCR擴(kuò)增片段核酸序列 附錄F（規(guī)范性）P47基因特異性引物序列 附錄G（規(guī)范性）PCR反應(yīng)體系配置及注意事項 附錄H（規(guī)范性）PCR檢測質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果判定圖 附錄I（資料性）用于重組抗原制備的SA1基因片段核酸序列 18附錄J（規(guī)范性）吉氏巴貝斯蟲SA1重組抗原的制備 19附錄K（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)陰性對照血清的制備 21附錄L（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清的制備 22附錄M（規(guī)范性）抗體檢測試紙條的制備 23附錄N（規(guī)范性）抗體檢測試紙條檢測結(jié)果示意圖 25附錄O（資料性）湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)實施信息及意見反饋表 26DB42/T2384—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、湖北省動物疫病預(yù)防控制中本文件主要起草人：賀蘭、趙俊龍、楊心如、李東方、陳方維、王森、周丹娜、杜芬。本文件實施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：helan@。DB42/T2384—2025V犬巴貝斯蟲?。╟aninebabesiosis）是由巴貝斯科、巴貝斯屬的巴貝斯蟲寄生于犬的紅細(xì)胞內(nèi)所引起的蜱傳性血液原蟲病，患病犬常出現(xiàn)溶血性貧血、發(fā)熱、黃疸和血紅蛋白尿等典型臨床癥狀。該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播和流行，我國的犬巴貝斯蟲病的主要病原是吉氏巴貝斯蟲（Babesiagibsoni在中文文獻(xiàn)中也稱巴貝蟲、巴貝西蟲、巴貝西原蟲、巴貝斯原蟲等。1985年我國南京發(fā)現(xiàn)首例犬感染巴貝斯蟲的病例，隨后在我國大部分地區(qū)均有病例報道。春夏秋季節(jié)溫度適宜，環(huán)境潮濕導(dǎo)致蜱活動增加，犬在濕潤的草地、山地或濕地上玩耍時更容易被蜱叮咬，引起巴貝斯蟲感染。至今缺乏有效疫苗和根治藥物，宿主一旦感染終生帶蟲，因此早診斷對該病的綜合防控至關(guān)重要。目前國內(nèi)獸醫(yī)臨床上急性病例的診斷多采用姬姆薩染色血液涂片的顯微鏡觀察。該方法對檢測條件的要求較低，簡便快捷，可半小時內(nèi)出結(jié)果；由于鏡檢對染蟲率低的樣本檢出率低，需要檢測人員有豐富的經(jīng)驗，否則容易出現(xiàn)漏檢或誤判，尤其易與泰勒蟲混淆。另一方面，由犬巴貝斯蟲所引起的隱性感染和既往感染較為常見，需要做實驗室檢測。為了提高犬巴貝斯蟲檢測的準(zhǔn)確性，本文件從各檢測方法的檢測原理、敏感性和特異性等多方面綜合考慮，制定了一套適用于犬的巴貝斯蟲病的多方法聯(lián)合診斷方案，以期為臨床犬巴貝斯蟲病的精準(zhǔn)診斷提供依據(jù)。本文件中臨床診斷可初步判定患病犬感染巴貝斯蟲的潛在可能；血涂片顯微鏡檢測方法用于從活體動物的外周血液中檢測巴貝斯蟲；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）用于巴貝斯蟲核酸檢測，可檢測當(dāng)前感染；BgSA1抗體檢測試紙條用于檢測血清樣品中的巴貝斯蟲抗體，可用于實驗室檢測、流行病學(xué)調(diào)查和檢驗檢疫。DB42/T2384—20251犬巴貝斯蟲病診斷技術(shù)本文件規(guī)定了犬巴貝斯蟲病診斷的生物安全要求、臨床診斷、血涂片顯微鏡鏡檢、PCR檢測、抗體檢測和綜合判定的技術(shù)要求，描述了病原學(xué)和血清學(xué)的檢測方法和診斷技術(shù)要求。本文件適用于犬巴貝斯蟲病的臨床診斷、實驗室診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及檢驗檢疫。注：本文件所稱犬巴貝斯蟲特指吉氏巴貝斯蟲。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫GB/T42011-2022實驗動物福利通則NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1犬巴貝斯蟲病caninebabesiosis由巴貝斯蟲寄生于犬的紅細(xì)胞內(nèi)引起的一種蜱傳性血液原蟲病，以發(fā)熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿為主要特征。3.2吉氏巴貝斯蟲屬于原生生物，為頂復(fù)門、孢子蟲綱、梨形蟲目、巴貝斯科、巴貝蟲屬的一種寄生于犬紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲，為小型蟲體，大小為1μm～2μm，在體內(nèi)可呈點(diǎn)狀、環(huán)狀、梨籽形。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對（basepair）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）IPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）2DB42/T2384—2025TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-EDTA）5生物安全要求樣品采集、處理及檢測過程中涉及的實驗操作，應(yīng)遵守GB19489、GB/T27401、GB/T42011-2022和NY/T541-2016的相關(guān)規(guī)定。6臨床診斷6.1流行特點(diǎn)犬感染吉氏巴貝斯蟲引起犬巴貝斯蟲病。吉氏巴貝斯蟲自然傳播主要是通過蜱的叮咬傳播，患病犬的發(fā)病大多數(shù)情況下與蜱叮咬直接相關(guān)，也可通過輸血、受污染的設(shè)備或經(jīng)胎盤傳播，以及犬只互相撕咬期間咬傷，通過血液傳播。長角血蜱、鐮形扇頭蜱和血紅扇頭蜱等是該病原的傳播媒介（見附錄A）。犬巴貝斯蟲病的發(fā)生與動物的性別及年齡相關(guān)性不大，任何年齡的犬只均可發(fā)病。犬巴貝斯蟲病多發(fā)于4月～10月，分布和發(fā)病季節(jié)往往與蜱的分布和活動季節(jié)密切相關(guān)。6.2典型臨床癥狀典型臨床癥狀包括但不限于：——發(fā)熱：體溫升高至40℃~41℃,持續(xù)3d～5d后，轉(zhuǎn)至正常，5d～7d后再次升高。即呈不規(guī)則間歇熱型；——貧血：漸進(jìn)性貧血，可視黏膜蒼白、黃染（見附錄B）；——血紅蛋白尿：尿液顏色深黃或桔紅或似濃茶水樣（見附錄B）；——嘔吐：部分病犬有嘔吐癥狀。6.3典型病理變化典型病理變化包括但不限于：——血液稀薄如水，凝固不良；——全身皮下脂肪黃染；——肝臟和脾臟腫大易碎，體積約為正常犬的2倍～3倍，甚至3倍～4倍（見附錄B）；——單側(cè)或雙側(cè)腎腫大。6.4結(jié)果判定犬出現(xiàn)本文件6.2典型臨床癥狀或者病死犬剖檢時有本文件6.3典型病理變化，并符合本文件6.1流行特點(diǎn)，判為疑似巴貝斯蟲病。7血涂片顯微鏡鏡檢7.1基本要求除特殊說明外，本文件所有操作程序均應(yīng)符合GB19489、GB/T27401、GB/T42011-2022和NY/T541-2016的規(guī)定。7.2試劑耗材DB42/T2384—20253試劑耗材包括但不限于：——除特別規(guī)定外，在檢測中使用的試劑均為分析純，試驗用水應(yīng)符合GB/T6682的要求；——姬姆薩染液原液，按照附錄C中的方法配制?；蚴褂蒙唐坊匪_染液；——甲醇；——香柏油；——載玻片。7.3儀器設(shè)備光學(xué)顯微鏡（含100×物鏡）。7.4血涂片制備用剪毛剪剪去犬耳尖毛發(fā)，揉搓采血部位，使血流旺盛，針頭刺破耳尖，擠取一滴耳尖靜脈血于載玻片上，用推片將血液推成薄血涂片，并迅速晾干。7.5血涂片固定加甲醇于血涂片，使甲醇完全覆蓋血涂層，待晾干后重復(fù)一次。7.6血涂片染色加姬姆薩染液于已固定好的血涂片，使其完全覆蓋血涂層。室溫條件染色30min。染色結(jié)束之后，用自來水沖掉染液。將血涂片自然晾干或者吹風(fēng)機(jī)吹干。7.7顯微鏡鏡檢在血涂片上滴加一滴香柏油，用光學(xué)顯微鏡在100×鏡下觀察100個視野。7.8結(jié)果判定7.8.1顯微鏡鏡檢陽性紅細(xì)胞內(nèi)觀察到典型的吉氏巴貝斯蟲（見附錄D）形態(tài)如圓環(huán)形、雙梨形等時，判為血涂片顯微鏡鏡檢陽性。7.8.2顯微鏡鏡檢疑似陽性犬紅細(xì)胞內(nèi)未見典型蟲體，但觀察到少量點(diǎn)狀疑似蟲體時（見附錄D），判為血涂片顯微鏡檢查疑似陽性。7.8.3顯微鏡鏡檢陰性未出現(xiàn)本文件7.8.1和7.8.2的結(jié)果，判為血涂片顯微鏡鏡檢陰性。8PCR檢測方法8.1基本要求除特殊說明外，本文件所有操作程序均應(yīng)符合GB19489、GB/T27401、GB/T42011-2022和NY/T541-2016的規(guī)定。DB42/T2384—202548.2試劑耗材試劑耗材包括但不限于：——2×RapidTaqMasterMix（商品化）包含TaqDNA聚合酶、dNTP以及優(yōu)化的緩沖體系；——雙蒸水；——全血基因組DNA提取試劑盒；——瓊脂糖（電泳級）；——1×TAE緩沖液，按照附錄C中的方法配制；——GelRed或其他核酸染料；——吉氏巴貝斯蟲陽性基因組對照（用體外純培養(yǎng)的吉氏巴貝斯蟲，染蟲率達(dá)到5%及以上時，收集樣品，提取血液基因組DNA，使用紫外分光光度計測濃度，稀釋至1ng/μL；或序列合成基因片段（見附錄E）作為陽性對照）；——吉氏巴貝斯蟲陰性基因組對照（篩選吉氏巴貝斯蟲陰性犬，提取血液基因組DNA，使用紫外分光光度計測濃度，稀釋至1ng/μL——核酸分子Marker2000；——抗凝真空采血管；——1.5mL無菌離心管；——200μLPCR管；——10μL、100μL、1000μL不同規(guī)格的微量移液器吸頭。8.3儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括但不限于：——PCR擴(kuò)增儀；——核酸電泳系統(tǒng)；）；——離心機(jī)；——紫外分光光度計；——凝膠成像分析系統(tǒng)。8.4樣品處理抗凝真空管采集犬靜脈血，編號，保存于4℃,送檢。8.5DNA提取用商業(yè)化的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，方法按照試劑盒說明書。提取的DNA立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增或保存于-20℃?zhèn)溆谩?.6PCR反應(yīng)操作方法8.6.1反應(yīng)體系擴(kuò)增吉氏巴貝斯蟲P47基因的引物BgF/BgR按照附錄F中生物序列合成。配制PCR反應(yīng)體系，按照附錄G來配制，反應(yīng)體系總體積為25μL。吉氏巴貝斯蟲陽性DNA為陽性基因組對照，吉氏巴貝斯蟲陰性犬血液基因組為陰性對照。8.6.2反應(yīng)條件DB42/T2384—20255于200μLPCR管中配制反應(yīng)體系，混勻，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min；然后95℃變性15s，61℃退火15s，72℃延伸1min，共擴(kuò)增35個循環(huán)；72℃延伸5min。8.7PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳和成像用1×TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠（配制方法見附錄C），取PCR產(chǎn)物10μL與2μL6×加樣緩沖液混合，加樣于含1×GelRed或其他核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠制備的凝膠塊中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm條件電泳30min，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)到底部時停止電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，并拍照保存。8.8質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)吉氏巴貝斯蟲陽性DNA對照出現(xiàn)1071bp的特異性條帶，且陰性對照無擴(kuò)增條帶時，判為試驗成立（應(yīng)符合附錄H的規(guī)定）。8.9結(jié)果判定8.9.1陽性用特異性引物自待檢樣品基因組DNA中擴(kuò)增出大小為1071bp的條帶，判定為吉氏巴貝斯蟲核酸陽性（應(yīng)符合附錄H的規(guī)定）。8.9.2陰性待檢樣品無特異性的陽性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，判定為吉氏巴貝斯蟲核酸陰性。9抗體檢測9.1基本要求除特殊說明外，本文件所有操作程序均應(yīng)符合GB19489、GB/T27401、GB/T42011-2022和NY/T541-2016的規(guī)定。9.2試劑耗材試劑耗材包括但不限于：——吉氏巴貝斯蟲BgSA1抗體檢測試紙條；——非抗凝真空采血管；——1.5mL無菌離心管；——10μL、100μL、1000μL不同規(guī)格的微量移液器吸頭。9.3儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括但不限于：）；——離心機(jī)；——恒溫水浴鍋；——恒溫箱；——核酸蛋白檢測儀；——細(xì)胞破碎儀；——恒溫?fù)u床；DB42/T2384—20256——制冰機(jī)；——PCR儀。9.4材料準(zhǔn)備吉氏巴貝斯蟲SA1堿基序列見附錄I，SA1重組抗原按照附錄J制備，吉氏巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)陰性血清按照附錄K制備，吉氏巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按照附錄L制備，吉氏巴貝斯蟲抗體檢測試紙條按照附錄M制備，其他相關(guān)試劑按照附錄A配制。9.5待檢血清樣品的處理靜脈無菌采集犬血液1mL，靜置或置37℃中促其凝固，再于2℃~8℃冰箱中放置2h。4℃3000g離心10min，收集上清于1.5mL離心管中，于-20℃保存或送檢。9.6操作步驟取待檢血清樣品40μL～60μL（滴管2滴～3滴），緩慢加到樣品孔中，在樣品孔中滴加20μL（滴管1滴）抗體稀釋液，試紙條上將有紅色條帶移動。靜置15min，觀察結(jié)果。9.7結(jié)果判定9.7.1血清抗體陽性在試紙條上出現(xiàn)兩條線（檢測線和質(zhì)控線應(yīng)符合附錄N的規(guī)定）。9.7.2血清抗體陰性在試紙條上僅出現(xiàn)一條線（質(zhì)控線應(yīng)符合附錄N的規(guī)定）。9.7.3無效結(jié)果質(zhì)控線不顯示。10綜合判定出現(xiàn)本文件6.4疑似吉氏巴貝斯蟲病判定結(jié)果，進(jìn)一步判定如下：出現(xiàn)本文件7.8中a）項或8.7中a）項或9.7中a）項結(jié)果的，判為吉氏巴貝斯蟲病陽性；10.2隱性感染未出現(xiàn)本文件6.4疑似巴貝斯蟲病判定結(jié)果，進(jìn)一步判定如下：出現(xiàn)本文件7.8中b）項結(jié)果的，判為吉氏巴貝斯蟲隱性感染。10.3陰性未出現(xiàn)本文件6.4疑似巴貝斯蟲病判定結(jié)果，進(jìn)一步判定如下：出現(xiàn)本文件7.8中c）項、8.7中b）項和9.7中b）項結(jié)果的，判為吉氏巴貝斯蟲感染陰性。11標(biāo)準(zhǔn)實施及評價DB42/T2384—2025711.1結(jié)合本文件包括犬巴貝斯蟲診斷技術(shù)的實際，各級監(jiān)督管理層，基于操作層文化程度、監(jiān)督管理層操作工藝知識的實際，集合犬巴貝斯蟲病診斷技術(shù)實操與講解相結(jié)合的培訓(xùn)方法，認(rèn)真做好標(biāo)準(zhǔn)實施準(zhǔn)備，包括標(biāo)準(zhǔn)實施的方案準(zhǔn)備、組織準(zhǔn)備、知識準(zhǔn)備、手段準(zhǔn)備和物質(zhì)條件準(zhǔn)備等。11.2制定標(biāo)準(zhǔn)實施方案，明確適用于犬巴貝斯蟲診斷技術(shù)規(guī)程的對象和場景、提供實施必備條件和保障（組織、制度、資金、人員和設(shè)備儀器等）、推薦方法路徑，確定資源要素配置、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和控制點(diǎn)，提出標(biāo)準(zhǔn)實施中的注意事項。11.3各級監(jiān)督管理層了解安全風(fēng)險特性與應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)管控培訓(xùn)需求。在標(biāo)準(zhǔn)頒布實施后的1個月內(nèi)組織標(biāo)準(zhǔn)主要起草人完成標(biāo)準(zhǔn)實施方案制定，并報備標(biāo)準(zhǔn)歸口單位備案，同時編制完成標(biāo)準(zhǔn)宣貫講義；6個月內(nèi)，推動標(biāo)準(zhǔn)起草單位中的標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)要求，落實責(zé)任制，做到橫向到邊，縱向到底。11.4本文件的實施，為犬巴貝斯蟲病診斷提供成套技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、為相關(guān)技術(shù)和管理人員提供實施和管理的技術(shù)手段和方法、落實國家的環(huán)境保護(hù)、健康、衛(wèi)生、安全的要求。11.5本文件實施檢查標(biāo)準(zhǔn)實施方案的落實情況，需要逐條檢查標(biāo)準(zhǔn)實施內(nèi)容的落實，并記錄未實施內(nèi)容的理由或原因。為此文件起草單位將結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)宣貫，每季度組織1次標(biāo)準(zhǔn)實施檢查，也要檢查標(biāo)準(zhǔn)實施的支持和物質(zhì)條件的落實情況。做好標(biāo)準(zhǔn)實施驗證記錄，暢通標(biāo)準(zhǔn)實施信息采集的方式、方法和反饋渠道，定期整理并處理收集到的意見建議。依據(jù)《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》落實標(biāo)準(zhǔn)實施評價。11.6在本文件實施6個月后，對照標(biāo)準(zhǔn)實施方案，開展標(biāo)準(zhǔn)實施效果評價分析，總結(jié)實施經(jīng)驗成效，梳理存在的薄弱環(huán)節(jié)，標(biāo)準(zhǔn)實施的評價主要是評價實施的效果，主要從技術(shù)進(jìn)步、質(zhì)量水平提高、客戶滿意度、規(guī)范秩序、效率提高、節(jié)約費(fèi)用、節(jié)省時間、履行社會責(zé)任等方面進(jìn)行有益性評價，同時還要評價標(biāo)準(zhǔn)實施帶來的問題，以便為未來改進(jìn)提供參考，以評價促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的持續(xù)完善。11.7適時向?qū)I(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會和標(biāo)準(zhǔn)歸口管理單位反饋情況，提出標(biāo)準(zhǔn)推廣、修改、補(bǔ)充、完善或者廢止等意見建議。11.8標(biāo)準(zhǔn)實施信息及意見反饋表相關(guān)示例見附錄O。8(資料性)mm~1.75mm,褐黃色，假頭寬短，盾板亞圓形。mm~3.92mm,寬1.93mm~4.77mm,寬2.20雌蜱：體長2.8mm~3.8mm,寬1.8mm~2.0mm,假頭基寬短六角形，盾板長勝于寬，赤褐色。長角血蜱形態(tài)特征見圖A.1,鐮形扇頭蜱形態(tài)特征見圖A.2,血紅扇頭蜱形態(tài)特征見圖A.3。標(biāo)引序號說明：3——雄蜱；4——雌蜱。9標(biāo)引序號說明：1——雄蜱背面；2——雄蜱腹面；3——雌蜱背面；4——雌蜱腹面。標(biāo)引序號說明：1——雌蜱背面； 雌蜱腹面；3——雄蜱背面；4——雄蜱腹面。(資料性)吉氏巴貝斯蟲病典型癥狀及病理變化吉氏巴貝斯蟲病典型癥狀及病理變化見圖B.1。標(biāo)引序號說明：3——脾臟腫大，邊緣鈍圓。圖B.1巴貝斯蟲病典型癥狀及病理變化圖DB42/T2384—2025溶液配制C.1姬姆薩染液儲存液準(zhǔn)備33mL甘油，將0.5g姬姆薩染料置于研缽中，加少量甘油進(jìn)行充分研磨，然后加入全部的甘油，55℃~60℃水浴加熱1h～2h，期間不斷搖動混勻。冷卻至室溫后加入33mL甲醇，攪拌混勻，儲存在棕色瓶中室溫靜置6～12個月，避光保存。C.2姬姆薩染液工作液按每毫升去離子水加200μL姬姆薩染液原液進(jìn)行配制。C.3TAE溶液配制方法C.3.150×TAE貯存液50×TAE貯存液配方如表C.1所示，約800mL滅菌去離子水溶解，充分混勻后用滅菌去離子水補(bǔ)齊至1000mL，常溫保存?zhèn)溆?。表C.150×TAE貯存液配方NaEDTAOC.3.21×TAE使用液1×TAE貯存液配方如表C.2所示。表C.21×TAE貯存液配方C.41.5%的瓊脂糖凝膠1.5%的瓊脂糖凝膠配方如表C.3所示。微波爐加熱至瓊脂糖熔化，待稍冷卻后加入GelRed或同類核酸染料，搖勻。表C.31.5%的瓊脂糖凝膠配方DB42/T2384—2025C.5His-bindingBuffer（pH=8.0）1.5%的瓊脂糖凝膠配方如表C.3所示，完全溶解后，調(diào)pH值至8.0，加去離子水至1000mL，4℃存放備用。表C.4His-binging溶液配方NaHPO(資料性)紅細(xì)胞內(nèi)典型蟲體形態(tài)紅細(xì)胞內(nèi)的吉氏巴貝斯蟲形態(tài)如圖D.1所示。CC標(biāo)引序號說明： 紅細(xì)胞內(nèi)疑似蟲體(紅色箭頭所示);2——紅細(xì)胞內(nèi)圓環(huán)狀蟲體(紅色箭頭所示);圖D.1吉氏巴貝斯蟲典型形態(tài)圖DB42/T2384—2025（資料性）PCR擴(kuò)增片段核酸序列PCR擴(kuò)增片段P47基因片段序列如圖E.1所示。P47基因片段序列5’-3’GCCTGTACATCCACAATTGGCTACCTTTCAACAGCAACTTGAATTTGTAGCAAGGTTTGATGAGGCGTTTAATACTGCCGAGGAAGAATATAAGAAGAAACTAGTTCACCTCCTTCCACTTTACAAGGTGAATCCTTTCAAAGACGTCTGGATTCATTTTAAGGAAGGTGTTAAGAATGTTGCTGAATTGTATGCTGTGTTACTTCGTGTCCCCCAATCTACAGCAACCCCTGCCGGTACGTTTATATATTCATCGATTCATTACCTTAGCAGATGAAGAGAGAAAGCCTTCTGCCTCTTTACAGAATCTGTTGGATATCGCTTTAAATGCAACAGGTGATGCTCTGCACATTGCAGATAAGGCTGTGAAGACTGTCATTGGAATAGAGATAAAGGATGGTGTTTTAAATGCGACGCTTGAAAATGCTGAGCTTCTGTCTGAAGTCCTGCCGGAGTTCTTTGAAAAACTTTTGGAGTTCAAAAAGGTGGTTGAGGATGCGTATGCCCCTGAATCCCAAGTTGATGGTGGTAAGTTATTCACACGACTTGGTCACAGCCCCGTTGAACCCTACTTGAAGAATCACGGTTTCAAAGATGGAGATTTTAAACGTGAAGCTTCATTAAAAGATTTGAGAAAGAAACTTATAGAGCTAGTTGACACTGGTAAGCATTTTCAGGAGGTCCTGGGCGTGCTTGCCGCAGATGCACTTATGCGAACTCCAGATGGCCCAATGAGAAAACAAGCATGGCTCTTTTTATTGTCAAGTACAATGCATAACGAAGCTATGAAGGAGAGGCTTAAGGATGCCGTAAACAAAGTAACCGGTAAAGGAGATACCTTTGTAGAGGAACTGAAGAAACTGGGACCACAAATTAAGCTTCCCAAGGAAAAGACTCCCAAAGGATACCTTTTCCCCGGTGAATATGTAAACTGCGATGTTCATCACTTCTGGACTGTGTTAACTGGGGTATTTGGTACCATACTTGACGATATAAGTAAAGCGGCCCCCACTGCAAAAACTGGAGGGGGTGTTGTCCCCCAGGAGTTAGCTGACCTTGTCAAGGTGCAAG圖E.1PCR擴(kuò)增片段P47基因片段序列DB42/T2384—2025（規(guī)范性）P47基因特異性引物序列采用PCR方法開展巴貝斯蟲檢測時，需合成擴(kuò)增P47基因的引物見表F.1。表F.1吉氏巴貝斯蟲P47基因特異性引物序列GCCTGTACATCCACAATTGGCTTGCACCTTGACAAGGTCADB42/T2384—2025（規(guī)范性）PCR反應(yīng)體系配置及注意事項G.1反應(yīng)體系配制每個PCR反應(yīng)體系包括的組分見表G.1。表G.1PCR反應(yīng)體系111G.2注意事項G.2.1在配制PCR反應(yīng)體系過程中，陽性對照DNA與待檢樣品DNA應(yīng)該在不同區(qū)域添加，以免造成污染。G.2.2所有試劑應(yīng)按照要求分別在4℃或-20℃條件保存，使用時在室溫條件下融化，混合均勻，放置于冰上。DB42/T2384—2025(規(guī)范性)標(biāo)引序號說明：1——吉氏巴貝斯蟲陽性基因組對照2——吉氏巴貝斯蟲陰性基因組對照用吉氏巴貝斯蟲P47基因特異性引物，自待檢樣品基因組中擴(kuò)增出大小約為1071bp的片段(見圖標(biāo)引序號說明：1——吉氏巴貝斯蟲陽性基因組對照2——待檢樣品3——吉氏巴貝斯蟲陰性基因組對照圖H.2吉氏巴貝斯蟲特異性引物檢測的陽性樣品結(jié)果圖DB42/T2384—2025（資料性）用于重組抗原制備的SA1基因片段核酸序列用于重組抗原制備的SA1基因片段核酸序列見圖I.1。SA1基因片段序列5’-3’ACACAAATAACAACACCTGTGGATGACAATGATTCTGCTCCAATGGAGCCACATTCTGTCAAAGATATGTTACACTTCCTAGGTAAATTGCAGCAGGACACAAACCTGAAAGAAAAGTTTGTCAATGAACTGGAGAAGGTAGTTAAGGAGTATCTGGACACCACGCAAGTTGAGAAAAAAGGGTATACTGCTAATTTCGATAGTTTGTTGGAACACGTGAATAAACTACGTCATGAGCTGTTGAACGACACCGGTGATTATGGAAAATTTAAGGATCTTAACGAAGAGGGTGTGACAAAGGCTTTTGAAATACTTGTCCAGTGGATTCCAATCTTGCACAGTGAGTTTTCGTTGCTGTATTTCCTCTCCTCTACGGAGGGACAAGGTATTGGCGGAAATCAATGGATTGAACAATATTTCGGACCAGAGCATACAGGTACACAGGCACACAAGTGGTTGACTGATAAGTTAAATGAAGCTAAGGACCCTTTCACTGTGAAGAAAGGTTTTGAGGATGGTGATCTAAAACGAGGTGGTAGGATTACCGCAGCTGTGACTGGTAATCTGGGAATAAACTACTATTCCGGCGGACCTCTAAACTACATGCAATATGGACTGTTTTTCCTTTCTGGTGATACTTTGCTAGCTGCGAATCTTGCAAGCGCCCTTCTATTCCTGGCAGAGTTCTGTAGGGAAGTAAGTGAGAACAAGTTTCCCGAGAAGACCACGCTTGATAAATATAAATGTCTTAAGGATGTATGCAAGGATGTAAAAGATAAAATTGATGCTTTTCATAAGCATATTTTGCCTCTATATAATCCTTTAACGGTTGAAGACATAGAAGGTGATGACGATAGTAAACTTGGTGAGGTTGTACGCATGGCGGAGGGTAGGTGTAATGAAATGTACAAAGGAAAGTTAAAAAAAGAGAAATTTGACGAATATGTCACATGGATGAAAAGGAATCTTGCAAAACTTATGCTTCTGCTGAGGGAGATGCACACTGACTCTGCCAGATGGACTGTTGAAGATTTAATGTATGTCCAGTCTCATGGACCATCCAAATACGGTTATACGTTCGTGGATAAGAGATGGGATACAAGTATATATTTCACATTTAAGCAGTCTATAGAAGACCTTGCACTTTTTGAATCAAGCAATGGTCTTTTTAGTCTGCTTAGGTGCTTAGATGGCCAGAGGGCATTAAGAGAGAGGGAAGTCTTTGAAAAATTAGAAGAAGAAAAGAAAAAGAAAGAAGAGGCTAATAAAAAAGTAAGACGGGTAGCTAAACCAGCAACTGAGGTTGGAGAAGGAGAGGGGAATTCGTCAGGAAAACAGACACCAGTTCCTACACCACCCACTGGTAAGACCCAGTTGAAGGAACAAACACTTGCGGATGGTCATTCTGAAGATCCAAAACACAAGGGTGCAACTAAGCAGACCTCTGAAACCGTTCCACCTGCTCACCAAACAACAGCAAAAGGACCTCCAACAGAAAATGAGGCAGGCCATAAGGCATCAAAGCCAAATGAAACTGAGTCTAACAAGGCAGAAGGGGTTCCTAAGAAGGAAGAGGAAGTGCCTCAAGAAGGAAAAGGAGATGAGAAAGGTGTCCATACCTCCGTTAAAGCAAAGGCGGAAGGCACAGCGAATGAGGCATCATTCTCTGCTTACTCAGTGAGAGTGGCCACAGCATTTTTGGCCCTTTTGTCTGTAATGTAA圖I.1SA1基因片段核酸序列DB42/T2384—2025（規(guī)范性）吉氏巴貝斯蟲SA1重組抗原的制備J.1器械與設(shè)備鍋、恒溫箱、核酸蛋白檢測儀、細(xì)胞破碎儀、恒溫?fù)u床、制冰機(jī)、PCR儀。J.2材料引物ExpSA1-F/ExpSA1-R（20μmol/L），BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，克隆載體pETASY-Blunt，表達(dá)載體pET-28a，感受態(tài)大腸桿菌DH5α,感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），卡那霉素，異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑0.45μm），蛋白濃縮管。J.3引物序列擴(kuò)增吉氏巴貝斯蟲SA1基因表達(dá)片段的引物序列見表J.1，ExpSA1-F和ExpSA1-R引物對擴(kuò)增吉氏巴貝斯蟲SA1表達(dá)片段大小為1719bp。表J.1擴(kuò)增吉氏巴貝斯蟲SA1基因表達(dá)片段的引物GGATCCACACAAATAACAACCTCGAGTTACATTACAGACAXhoIJ.4表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定J.4.1吉氏巴貝斯蟲表達(dá)片段的擴(kuò)增引物用ExpSA1-F和ExpSA1-R，DNA模板用吉氏巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性基因組DNA，反應(yīng)體系為25μL，加樣比例見附錄G中G.1，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，53℃退火20s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸5min，15℃保溫。擴(kuò)增結(jié)束后，用商品化瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收合適大小的PCR產(chǎn)物。J.4.2雙酶切用20μL酶切體系：J.4.1回收的10μL吉氏巴貝斯蟲SA1基因PCR產(chǎn)物或pET-28a質(zhì)粒，10×酶切緩沖液2μL，BamHI和XhoI各1μL，ddH2O6μL，37℃酶切30min～60min。并回收酶切產(chǎn)物。J.4.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化用20μL連接體系：J.4.2酶切回收的吉氏巴貝斯蟲SA1基因片段9μL，雙酶切回收的質(zhì)粒pET-28a片段3μL，T4DNA連接酶1μL，10×連接緩沖液2μL，ddH2O5μL。25℃水浴連接40min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α,操作步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。J.4.4陽性菌株的鑒定DB42/T2384—2025將J.4.3篩選的陽性菌液送相關(guān)公司測序，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞用于重組抗原表達(dá)。J.5蛋白表達(dá)和純化J.5.1取J.4.4吉氏巴貝斯蟲SA1陽性菌株菌液，按1：100的比例接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8。加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)4h。J.5.2將誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液分裝到離心管中，在4℃下8000rpm離心10min，棄上清液。J.5.3沉淀用His-bindingBuffer（配制方法見附錄C）重懸到50mL離心管中。將離心管垂直置于碎冰，于4℃,1000bar壓力破碎儀上破碎3～5次。J.5.4將J.5.3壓力破碎的菌體裂解物在4℃以12000rpm離心10min，取上清液用0.45μm濾器過濾。濾過液用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白。J.5.5將純化后的蛋白溶液裝入處理好的透析袋中，用PBS（pH7.5）在4℃透析4h～5h，重復(fù)該透析步驟3次。J.5.6將透析后的蛋白轉(zhuǎn)入蛋白濃縮管，于4℃4000rpm離心，用核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度，待濃縮管中蛋白濃度大于1mg/mL時停止離心。J.5.7濃縮的重組蛋白分裝于1.5mL離心管，每支1.0mL，置于-20℃保存。DB42/T2384—2025（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)陰性對照血清的制備K.1實驗動物選擇選取健康無病原感染的比格犬，按照6和7的要求進(jìn)行血涂片檢查和PCR檢測，兩種方法均為陰性時符合要求。K.2血清抗體檢測采集符合K.1要求的犬耳尖靜脈血1mL，分離血清。以附錄M制備的BgSA1抗體檢測試紙條，檢測犬血清中抗吉氏巴貝斯蟲的抗體。當(dāng)出現(xiàn)9.7中b項結(jié)果時符合要求。K.3標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的收集將符合K.2要求的犬頸動脈放血至死亡，無菌收集全部血液，或采集需要量的靜脈血，分離血清。該血清即為標(biāo)準(zhǔn)陰性對照血清，分裝于不同規(guī)格的血清瓶或離心管，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。DB42/T2384—2025（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清的制備L.1實驗動物選擇選擇符合K.1和K.2要求的犬，用于制備吉氏巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清。L.2吉氏巴貝斯蟲感染將已知染蟲率的吉氏巴貝斯蟲培養(yǎng)物進(jìn)行2800×g2min離心，取下層107個染蟲紅細(xì)胞于無菌EP管中，加入1mL生理鹽水混勻。選擇符合L.1要求的比格犬，進(jìn)行保定，隨后對注射位點(diǎn)消毒，將含107個染蟲紅細(xì)胞的混合液于背部分5～6點(diǎn)進(jìn)行皮下注射。L.3抗體檢測攻蟲后每天定時檢測感染犬體溫，5d～7d后采耳尖血制作血涂片，姬姆薩染液染色后鏡檢計算染蟲率。14d后采集犬靜脈血1mL，分離血清。用BgSA1抗體檢測試紙條，檢測L.2分離的感染前血清和感染后血清中的吉氏巴貝斯蟲抗體。當(dāng)感染前血清出現(xiàn)8.7中b項結(jié)果，感染后血清出現(xiàn)8.7中a項結(jié)果時符合要求。L.4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清收集將符合L.3要求