ICS71.100.70CCSY42上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會發(fā)布IT/SPMA009-2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15儀器和設(shè)備 16主要試劑及耗材 27試驗(yàn)方法 28結(jié)果計(jì)算 49試驗(yàn)有效性判定 410結(jié)果報(bào)告 411結(jié)果相關(guān)性解讀 4附錄A（資料性）RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖片示例 5附錄B（資料性）溶液制備 6T/SPMA009-2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：上海市疾病預(yù)防控制中心、廣東博溪生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、片仔癀（上海）生物科技研發(fā)有限公司、浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司、時(shí)垠(上海)生物科技有限公司、北京鑫金證國際技術(shù)服務(wù)有限公司、常州諳美生物科技有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司、上海海關(guān)技術(shù)中心、南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院、上海嘉亨日用化學(xué)品有限公司、上海測譜檢測技術(shù)有限公司、上海其然生物科技有限公司、上海永熙信息科技有限公司。本文件首期承諾執(zhí)行單位：上海市疾病預(yù)防控制中心、廣東博溪生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、片仔癀（上海）生物科技研發(fā)有限公司、浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司、時(shí)垠(上海)生物科技有限公司、北京鑫金證國際技術(shù)服務(wù)有限公司、常州諳美生物科技有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司、上海海關(guān)技術(shù)中心、南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院、上海嘉亨日用化學(xué)品有限公司、上海測譜檢測技術(shù)有限公司、上海其然生物科技有限公司、上海永熙信息科技有限公司。本文件主要起草人：崔文廣、陳田、霍倩、陶功華、盧永波、王飛飛、趙玥、任君宇、廖峰、許春暉、錢陳、李竹、周利紅、洪新宇、應(yīng)夢超、張艷云、李晶晶、趙曉、周峰、方國珊、魏春花、常懷龍、田守生、李小林、王銀娟、袁登峰、張坤、葉理、曹平、魯楠、袁旻嘉、喻竟。本文件為首次制定。1T/SPMA009-2023化妝品舒緩功效測試方法基于脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系炎癥細(xì)胞模型的一氧化氮含量測定本文件規(guī)定了細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264.7釋放一氧化氮（NO）含量檢測的方法。本文件適用于化妝品舒緩功效的測試評價(jià)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1一氧化氮nitricoxide,（NO）是一種具有多種生物學(xué)活性的小分子信使物質(zhì)，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，影響機(jī)體免疫功能。3.2光密度opticaldensity（OD）物質(zhì)在溶液中吸收特定波長光線強(qiáng)弱的參數(shù)，光密度值與光吸收物質(zhì)在溶液中的濃度成相關(guān)性。4原理具有舒緩功效的化妝品有助于改善皮膚刺激狀態(tài)。皮膚刺激狀態(tài)的發(fā)生主要涉及皮膚屏障-神經(jīng)血管-免疫炎癥的生理過程，通過舒緩皮膚炎癥反應(yīng)可以改善皮膚刺激問題。一氧化氮（NO）作為一種免疫調(diào)節(jié)因子參與皮膚炎癥反應(yīng)的生理過程，通過抑制活化的免疫細(xì)胞釋放過量一氧化氮（NO）可以減輕皮膚的免疫反應(yīng)從而改善皮膚的刺激狀態(tài)。通過細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264.7釋放NO，采用Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO濃度，計(jì)算受試物對小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制率，評價(jià)受試物的舒緩功效。5儀器和設(shè)備2T/SPMA009-20235.1調(diào)節(jié)移液槍：1000μL、200μL、50μL、10μL。5.2CO2培養(yǎng)箱：37℃,飽和濕度、5%CO2/空氣。5.3酶標(biāo)儀：配置540nm濾光片。5.4超凈工作臺。5.5分析天平：精度0.1mg。5.6細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。5.7倒置顯微鏡。5.8低速離心機(jī)。6主要試劑及耗材除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材均應(yīng)作無菌處理。6.1細(xì)胞選用小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264.7（見附錄A），建議細(xì)胞株來源于美國典型物質(zhì)保藏中心(ATCC)，選用型號為ATCCTIB-71。6.2細(xì)胞培養(yǎng)涉及試劑及耗材高糖DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清、0.25%胰酶（含0.1%EDTA）、磷酸鹽緩沖液（1xPBS）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶。6.3檢測涉及試劑及耗材細(xì)菌脂多糖（LPS）、細(xì)胞培養(yǎng)板（規(guī)格24孔）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒（內(nèi)附標(biāo)準(zhǔn)品）。7試驗(yàn)方法7.1細(xì)胞準(zhǔn)備將冷凍保存的細(xì)胞培養(yǎng)物以合適的密度接種到培養(yǎng)基，并在檢測前至少傳代一次。細(xì)胞應(yīng)以合適的密度接種到培養(yǎng)基中用于試驗(yàn)，細(xì)胞接種密度應(yīng)保證在接種12h后，融合度達(dá)到45%~60%。7.2受試物準(zhǔn)備7.2.1除非有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明儲備液可接受，否則受試物應(yīng)在使用前新鮮配制并直接使用。7.2.2水中溶解度受限的受試物應(yīng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，溶劑體積應(yīng)在所有培養(yǎng)物中保持一致，即在陰性對照和受試物中保持一致，且無細(xì)胞毒性。受試物濃度的選擇應(yīng)避免出現(xiàn)沉淀和溶液呈現(xiàn)云霧狀。7.2.3建議使用二甲基亞砜（DMSO）和無水乙醇作為溶劑。在使用溶劑前，應(yīng)依據(jù)受試物的特殊性質(zhì)，評估受試物是否與溶劑發(fā)生反應(yīng)。7.2.4可以使用渦旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當(dāng)溫度等方法輔助溶解，除非這些操作會影響到受試物的穩(wěn)定性。7.3試驗(yàn)條件7.3.1受試物濃度3T/SPMA009-2023應(yīng)通過細(xì)胞毒性測試確定受試物的濃度范圍，選擇細(xì)胞活力≥90%的受試物濃度。7.3.2刺激條件選擇合適濃度的LPS是誘導(dǎo)RAW264.7模型試驗(yàn)關(guān)鍵的因素。LPS推薦暴露劑量為1μg/mL，具體暴露劑量可根據(jù)試驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。與空白對照相比，一般要求LPS誘導(dǎo)陰性對照組NO含量上調(diào)倍數(shù)≥2倍。7.3.3陽性對照每一次試驗(yàn)應(yīng)同步設(shè)置陽性對照組。陽性劑推薦使用100μg/mL地塞米松，具體的暴露劑量可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整，一般要求陽性對照組的NO抑制率≥25%。7.4試驗(yàn)步驟7.4.1細(xì)胞消化、接種7.4.1.1棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，胰酶用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)瓶面積確定，建議T25培養(yǎng)瓶中加入1mL、T75培養(yǎng)瓶中加入3mL。37℃條件下消化細(xì)胞。7.4.1.2顯微鏡下觀察至大部分細(xì)胞變圓并處于懸浮狀態(tài)時(shí)，加入約胰酶體積2~3倍的含血清的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，并收集至離心管中，800r/min離心6min，轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。7.4.1.3離心結(jié)束后，棄掉上清液，向離心管中加入5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，彎頭吸管吹打混勻細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。7.4.1.4用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至接種密度（接種12h后融合度達(dá)到45%~60%），接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔液量為2mL。建議接種密度為4×105cells/孔，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。7.4.1.5接種結(jié)束后，放置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、95%RH）中培養(yǎng)24h。7.4.2誘導(dǎo)及受試物處理7.4.2.1棄掉細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，受試物組加入含有受試物和LPS的培養(yǎng)液，陰性對照組加入含有LPS的細(xì)胞培養(yǎng)基，陽性對照組加入含有陽性對照的工作液，空白對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔1.8mL。每組均應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。7.4.2.2受試物處理完畢后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2、95%RH）培養(yǎng)2h±10min。孵育結(jié)束后，受試物組加200μL含有LPS的受試物工作液，陰性對照組加200μL的LPS工作液，陽性對照組加200μL含有陽性劑的LPS工作液，空白對照組加200μL細(xì)胞培養(yǎng)液。補(bǔ)加完畢后，晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板5次，混勻孔內(nèi)液體，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2、95%RH）繼續(xù)培養(yǎng)22h±30min。7.4.3細(xì)胞上清收集孵育培養(yǎng)結(jié)束后，每孔收集400μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液于1.5mL無菌離心管中，即時(shí)開展NO含量檢測。7.4.4NO含量檢測按照一氧化氮（NO）檢測試劑盒的操作說明書進(jìn)行檢測。4T/SPMA009-20238結(jié)果計(jì)算8.1NO含量計(jì)算推薦使用專業(yè)曲線制作軟件，以一氧化氮（NO）檢測試劑盒內(nèi)附標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，以校正后的標(biāo)準(zhǔn)品OD540值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程式，將受試物校正后的OD540值代入方程式，計(jì)算NO含量，取3個(gè)復(fù)孔的平均值作為最終的NO含量結(jié)果。8.2NO抑制率計(jì)算抑制率式中：T—受試物組NO含量的3次平均值；C—陰性對照組NO含量的3次平均值。9試驗(yàn)有效性判定每批次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對照組和陽性對照組，每批次陰性對照組與空白對照組相比，NO含量上調(diào)倍數(shù)應(yīng)≥2倍；陽性對照組與陰性對照組相比，NO含量抑制率應(yīng)≥25%，判定試驗(yàn)體系有效。10結(jié)果報(bào)告10.1受試物在某一測試濃度下的NO的含量應(yīng)表述為：NO含量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。10.2評價(jià)受試物抑制NO含量的能力，需要受試物組NO含量值低于陰性對照組，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。10.3對于受試物抑制NO含量的表述，應(yīng)包含受試濃度。11結(jié)果相關(guān)性解讀在試驗(yàn)體系滿足有效性判定的基礎(chǔ)上，受試物組與陰性對照組相比，NO抑制率為正值，且與陰性對照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明受試物在該受試濃度下具有抑制NO含量的作用，可作為化妝品舒緩功效宣稱的證據(jù)支持。5T/SPMA009-2023（資料性）RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖片示例下面給出了RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖片示例。圖A.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖片（20倍物鏡）6T/SPMA009-2023溶液制備B.1地塞米松貯備液（100mg/mL）制備將地塞米松整瓶置于玻璃培養(yǎng)皿中擰開瓶蓋，置于烘箱，105℃干燥2h。干燥后將粉末收集于1.5mL離心管中，稱重（1.5mL離心管事先稱重根據(jù)重量按照100mg加1000μLDMSO的量等比例放大，震搖2h，充分混勻，按照20μL/支的體積進(jìn)行分裝，保存于-80℃冰箱。B.2地塞米松工作液制備用細(xì)胞培養(yǎng)液將100m