丙戊酸增強人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP對順鉑敏感性的機制研究一、引言1.1研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。在全球范圍內(nèi)，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第五，而死亡率卻高居婦科惡性腫瘤之首，5年生存率小于30%。其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于晚期，錯過了最佳的手術(shù)時機。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是目前卵巢癌治療的主要手段，其中順鉑（Cisplatin，DDP）因其廣譜的抗腫瘤活性，在卵巢癌化療中占據(jù)重要地位。順鉑能夠與DNA結(jié)合，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制癌細(xì)胞的復(fù)制和增殖。然而，隨著化療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性的問題日益突出，這成為制約卵巢癌治療效果的關(guān)鍵因素。一旦出現(xiàn)耐藥，腫瘤容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，臨床治療往往只能選擇多西他賽、脂質(zhì)體阿霉素等有效性較低的藥物，患者的預(yù)后較差。化療耐藥是一個受多因素影響的復(fù)雜過程，其中腫瘤細(xì)胞的凋亡逃逸起著關(guān)鍵作用。研究表明，多種機制參與了卵巢癌對順鉑的耐藥過程，如藥物外排增加、DNA損傷修復(fù)能力增強、細(xì)胞凋亡信號通路異常等。MCL1作為抗凋亡蛋白BCL-2家族的重要成員，在卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其通過抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。此外，多藥耐藥蛋白（MDR）的過度表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞能夠?qū)㈨樸K等化療藥物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。尋找有效的方法來克服卵巢癌對順鉑的耐藥性，提高化療效果，成為當(dāng)前卵巢癌治療領(lǐng)域的研究熱點。近年來，越來越多的研究關(guān)注到一些非傳統(tǒng)抗腫瘤藥物在增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性方面的潛力。丙戊酸（Valproicacid，VPA）作為一種臨床上廣泛使用的抗癲癇藥物，近年來被發(fā)現(xiàn)具有潛在的抗腫瘤作用。丙戊酸是一種環(huán)狀化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個甲基基團(tuán)和一個羧基團(tuán)，這種特殊結(jié)構(gòu)賦予其多種藥理活性。研究表明，丙戊酸可以通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體通路，促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡；干擾腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的分化和遷移特性；還可以抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的供血，從而減緩腫瘤細(xì)胞的增殖速度。在卵巢癌治療中，已有研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，并顯著提高患者生存期。此外，丙戊酸與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究也取得了一定進(jìn)展，為克服卵巢癌耐藥提供了新的思路。基于此，探討丙戊酸增強人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP對順鉑敏感性的作用及機制，具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義本研究旨在通過體外實驗，深入探究丙戊酸對人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP順鉑敏感性的影響，并初步探討其潛在的作用機制。具體而言，將通過細(xì)胞增殖實驗、凋亡檢測實驗以及相關(guān)分子機制研究，明確丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對COC1DDP細(xì)胞的抑制作用，以及丙戊酸如何影響細(xì)胞內(nèi)與耐藥相關(guān)的信號通路和蛋白表達(dá)，為卵巢癌耐藥治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。卵巢癌作為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，化療耐藥是其治療面臨的重大難題，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。順鉑作為卵巢癌化療的一線藥物，耐藥問題的出現(xiàn)極大地限制了其治療效果。尋找有效的方法來克服順鉑耐藥，提高卵巢癌的化療療效，成為當(dāng)前亟待解決的問題。丙戊酸作為一種具有多種藥理活性的藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值，為解決卵巢癌順鉑耐藥問題提供了新的研究方向。通過本研究，若能證實丙戊酸可增強COC1DDP對順鉑的敏感性，并揭示其作用機制，將為卵巢癌的臨床治療提供新的聯(lián)合用藥方案，有望提高化療效果，延長患者生存期，改善患者的生活質(zhì)量。同時，本研究也將豐富對卵巢癌耐藥機制的認(rèn)識，為開發(fā)更多有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略提供理論基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1丙戊酸在腫瘤治療中的研究進(jìn)展丙戊酸最初作為抗癲癇藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，其抗癲癇機制主要是通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸（GABA）受體，增強GABA的抑制性神經(jīng)傳遞作用。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸具有潛在的抗腫瘤活性，這使其在腫瘤治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。在細(xì)胞實驗方面，大量研究表明丙戊酸能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸可以顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的生長，其作用機制與誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丙戊酸處理后的HepG2細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，同時細(xì)胞凋亡率也顯著上升。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究中也得到了類似的結(jié)果，丙戊酸能夠抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而改變Bcl-2/Bax比值，促使細(xì)胞走向凋亡。在動物實驗中，丙戊酸對腫瘤生長的抑制作用也得到了驗證。有學(xué)者構(gòu)建了小鼠肺癌移植瘤模型，給予丙戊酸干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯小于對照組，腫瘤生長速度顯著減緩。進(jìn)一步的研究表明，丙戊酸能夠抑制腫瘤組織中的血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，丙戊酸還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。在臨床研究方面，雖然丙戊酸在腫瘤治療中的應(yīng)用仍處于探索階段，但已有一些小規(guī)模的臨床試驗取得了一定的成果。一項針對晚期卵巢癌患者的臨床試驗中，在常規(guī)化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合丙戊酸治療，結(jié)果顯示患者的無進(jìn)展生存期和總生存期均有一定程度的延長，且不良反應(yīng)可耐受。然而，也有部分臨床試驗結(jié)果并不理想，這可能與患者的個體差異、丙戊酸的用藥劑量和療程等因素有關(guān)。1.3.2順鉑耐藥性的研究現(xiàn)狀順鉑作為一種經(jīng)典的化療藥物，在多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用，尤其是在卵巢癌的治療中，是一線化療方案的重要組成部分。然而，腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性是臨床治療中面臨的一大難題，嚴(yán)重影響了順鉑的治療效果和患者的預(yù)后。目前，關(guān)于順鉑耐藥的機制研究取得了一定的進(jìn)展。從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，首先與細(xì)胞內(nèi)的親核物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)等結(jié)合，形成順鉑-DNA加合物，從而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而耐藥細(xì)胞則通過多種機制來減少順鉑的細(xì)胞毒性作用。一方面，耐藥細(xì)胞可通過上調(diào)藥物外排泵的表達(dá)，如多藥耐藥蛋白1（MDR1）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑快速排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。有研究報道，在卵巢癌耐藥細(xì)胞株中，MDR1的表達(dá)水平明顯高于敏感細(xì)胞株，且其表達(dá)水平與順鉑的耐藥程度呈正相關(guān)。另一方面，耐藥細(xì)胞還可通過增強DNA損傷修復(fù)能力來抵抗順鉑的細(xì)胞毒性。順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷可激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)信號通路，如堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）和同源重組修復(fù)（HR）等。在耐藥細(xì)胞中，這些DNA損傷修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)上調(diào)，使得細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)順鉑造成的DNA損傷，從而逃避順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。例如，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，NER通路中的關(guān)鍵蛋白XPC和ERCC1的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致細(xì)胞對順鉑的耐藥性增強。從分子生物學(xué)角度來看，順鉑耐藥還與多種信號通路的異常激活密切相關(guān)。其中，PI3K/Akt信號通路在順鉑耐藥中發(fā)揮著重要作用。該信號通路的激活可通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和增強細(xì)胞的耐藥性來影響腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路被持續(xù)激活，導(dǎo)致下游的抗凋亡蛋白如Bcl-2和MCL1等表達(dá)上調(diào)，同時促凋亡蛋白如Bad和Bax等表達(dá)下調(diào)，從而使細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。此外，NF-κB信號通路、MAPK信號通路等也參與了順鉑耐藥的形成過程，這些信號通路之間相互交織，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性。1.3.3丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的研究現(xiàn)狀鑒于丙戊酸的抗腫瘤作用和腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥問題，近年來國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用在腫瘤治療中的效果及機制研究。在細(xì)胞實驗層面，多項研究證實了丙戊酸能夠增強多種腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。在肺癌細(xì)胞A549/DDP的研究中發(fā)現(xiàn)，丙戊酸能夠顯著降低順鉑對A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），增強順鉑對細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步的機制研究表明，丙戊酸可通過下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白MDR1和MRP1的表達(dá)，減少順鉑的外排，從而提高細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，增強順鉑的細(xì)胞毒性作用。同時，丙戊酸還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的研究中也發(fā)現(xiàn)，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制與上調(diào)促凋亡蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。在動物實驗方面，有研究構(gòu)建了小鼠卵巢癌移植瘤模型，分別給予丙戊酸、順鉑以及兩者聯(lián)合治療。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤體積明顯小于單藥治療組，腫瘤生長抑制率顯著提高。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)明顯降低，而凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)顯著增加，表明丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在臨床研究方面，雖然目前相關(guān)的大規(guī)模臨床試驗較少，但一些小規(guī)模的臨床觀察也顯示出丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的潛在優(yōu)勢。有研究對晚期卵巢癌患者采用丙戊酸聯(lián)合順鉑和紫杉醇的化療方案進(jìn)行治療，結(jié)果顯示患者的客觀緩解率有所提高，且不良反應(yīng)未明顯增加。然而，由于臨床研究受到多種因素的影響，如患者的個體差異、治療方案的差異等，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的最佳方案和療效仍需進(jìn)一步的大規(guī)模、多中心臨床試驗來驗證。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌是發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤，確切發(fā)病原因雖尚未完全明確，但醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為是多因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中占據(jù)重要地位，約10%-15%的卵巢癌患者具有家族遺傳傾向。攜帶BRCA1和BRCA2等基因突變的女性，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險顯著增加。據(jù)研究，BRCA1基因突變攜帶者，一生患卵巢癌的風(fēng)險可高達(dá)40%-60%；BRCA2基因突變攜帶者，風(fēng)險也在10%-30%左右。年齡也是不可忽視的因素，卵巢癌的發(fā)病率隨年齡增長而上升，50歲以上女性發(fā)病風(fēng)險明顯增加。生理因素同樣影響著卵巢癌的發(fā)生，未生育或晚育的女性，由于卵巢長期處于排卵狀態(tài)，缺乏孕期和哺乳期的生理性保護(hù)，卵巢上皮細(xì)胞反復(fù)受到損傷和修復(fù)，增加了癌變風(fēng)險；長期使用口服避孕藥的女性，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險則相對降低，這可能與避孕藥抑制排卵，減少卵巢上皮細(xì)胞損傷有關(guān)。營養(yǎng)和環(huán)境因素也與卵巢癌發(fā)病相關(guān)。富含脂肪的飲食可能會增加卵巢癌的患病率，相反，多吃蔬果等高纖維素食物則可以降低患病的風(fēng)險。長期暴露于石棉、苯等有害物質(zhì)環(huán)境中，也會增加卵巢癌的發(fā)病幾率。在病理類型方面，卵巢癌主要包括上皮性卵巢癌、生殖細(xì)胞腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤等。上皮性卵巢癌最為常見，約占所有卵巢癌的85%-90%，又可細(xì)分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌等亞型。其中，漿液性癌是上皮性卵巢癌中最常見的亞型，約占70%，其惡性程度較高，易發(fā)生腹腔內(nèi)播散和轉(zhuǎn)移。生殖細(xì)胞腫瘤多發(fā)生于年輕女性，常見類型包括畸胎瘤、無性細(xì)胞瘤等。畸胎瘤又可分為成熟畸胎瘤和未成熟畸胎瘤，成熟畸胎瘤多為良性，未成熟畸胎瘤則為惡性；無性細(xì)胞瘤對放療和化療較為敏感。性索間質(zhì)腫瘤相對少見，主要包括顆粒細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤等，顆粒細(xì)胞瘤可分泌雌激素，導(dǎo)致患者出現(xiàn)性早熟、月經(jīng)紊亂等癥狀。臨床上，卵巢癌通常采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。Ⅰ期腫瘤局限于卵巢，其中ⅠA期腫瘤局限于單側(cè)卵巢，包膜完整，表面無腫瘤，無腹水；ⅠB期腫瘤局限于雙側(cè)卵巢，包膜完整，表面無腫瘤，無腹水；ⅠC期腫瘤累及單側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有腹水或腹腔沖洗液中找到癌細(xì)胞，或卵巢表面有腫瘤，或包膜破裂。Ⅱ期腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴盆腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，ⅡA期腫瘤侵及子宮或輸卵管；ⅡB期腫瘤侵及盆腔內(nèi)其他組織。Ⅲ期為一側(cè)或雙側(cè)卵巢腫瘤，病理證實盆腔外有腹膜轉(zhuǎn)移和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ⅢA期腫瘤微侵潤腹腔；ⅢB期腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)不超過2厘米；ⅢC期腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)大于2厘米，或腹腔內(nèi)或腹股溝淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移。Ⅳ期代表有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如胸水有癌細(xì)胞、肝實質(zhì)轉(zhuǎn)移、腹腔外臟器轉(zhuǎn)移（包括腹股溝淋巴結(jié)和超出盆腹腔的淋巴結(jié)）、腫瘤侵透腸壁全層。卵巢癌的分期對于治療方案的選擇和預(yù)后評估至關(guān)重要，早期卵巢癌（Ⅰ-Ⅱ期）通常采用手術(shù)治療，術(shù)后可能需要輔助化療；晚期卵巢癌（Ⅲ-Ⅳ期）則以化療為主，結(jié)合手術(shù)、放療、靶向治療等綜合治療方法。手術(shù)和化療是卵巢癌的主要治療手段。手術(shù)方式包括全面分期手術(shù)和腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)。全面分期手術(shù)適用于早期卵巢癌患者，目的是全面評估病情，切除腫瘤組織，包括全子宮切除術(shù)、雙側(cè)附件切除術(shù)、大網(wǎng)膜切除術(shù)、盆腔及腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃術(shù)等；腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)則主要用于晚期卵巢癌患者，盡可能切除肉眼可見的腫瘤病灶，使殘留腫瘤病灶直徑小于1厘米，以提高化療效果。化療在卵巢癌治療中占據(jù)重要地位，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌化療的標(biāo)準(zhǔn)方案，其中順鉑與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用最為廣泛。順鉑能夠與DNA結(jié)合，形成鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，阻礙DNA的解旋和復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；紫杉醇則通過促進(jìn)微管蛋白聚合和抑制解聚，使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂。然而，隨著化療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞對順鉑等化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果降低，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加，這成為卵巢癌治療面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。2.2順鉑的作用機制及耐藥性2.2.1順鉑的作用機制順鉑，化學(xué)名為順式-二氯二氨合鉑（Ⅱ），是一種廣泛應(yīng)用于臨床的鉑類化療藥物，在卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其作用機制主要涉及與DNA的相互作用以及對細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，首先經(jīng)歷水合過程，氯離子被水分子取代，形成帶正電荷的活性形式。這種活性形式的順鉑具有高度的親電性，能夠迅速與細(xì)胞內(nèi)的親核物質(zhì)，尤其是DNA結(jié)合。順鉑主要與DNA的鳥嘌呤（G）殘基的N7位和腺嘌呤（A）殘基的N1位發(fā)生配位反應(yīng)，形成順鉑-DNA加合物。這些加合物主要包括1,2-鏈內(nèi)交聯(lián)（如Pt（NH3）2（d（pGpG）））和少量的1,3-鏈內(nèi)交聯(lián)以及鏈間交聯(lián)。其中，1,2-鏈內(nèi)交聯(lián)最為常見，約占總加合物的90%。順鉑-DNA加合物的形成對DNA的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。從結(jié)構(gòu)上看，加合物的形成導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲和變形，破壞了DNA的正常堿基配對和螺旋構(gòu)象。這種結(jié)構(gòu)改變使得DNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄酶難以正常識別和結(jié)合DNA模板，從而抑制了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。在復(fù)制過程中，DNA聚合酶遇到順鉑-DNA加合物時，會發(fā)生停滯或錯誤摻入，導(dǎo)致DNA復(fù)制的終止或產(chǎn)生錯誤的DNA序列，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和遺傳信息的傳遞。在轉(zhuǎn)錄過程中，順鉑-DNA加合物會阻礙RNA聚合酶的前進(jìn)，抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，影響細(xì)胞的正常生理功能。順鉑還能夠通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的DNA受到順鉑損傷后，會激活一系列的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，如ATM/ATR信號通路。ATM（ataxiatelangiectasiamutated）和ATR（ataxiatelangiectasiaandRad3-related）是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA損傷應(yīng)答激酶，它們能夠感知DNA損傷信號，并通過磷酸化一系列下游底物，激活p53等關(guān)鍵的凋亡調(diào)控蛋白。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，它可以調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而改變細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值，促使細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，最終引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，順鉑還可以通過激活死亡受體途徑等其他凋亡信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。2.2.2順鉑耐藥性產(chǎn)生的原因盡管順鉑在腫瘤治療中具有顯著的療效，但腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性的問題嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。順鉑耐藥性的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的多因素過程，涉及細(xì)胞內(nèi)多個生理和生化途徑的改變。藥物外排增加是腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一。腫瘤細(xì)胞可以通過上調(diào)多種藥物外排泵的表達(dá)，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑快速排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。其中，多藥耐藥蛋白1（MDR1），也稱為P-糖蛋白（P-gp），是研究最為廣泛的一種藥物外排泵。MDR1是一種ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將順鉑等多種化療藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株中，MDR1的表達(dá)水平通常明顯高于敏感細(xì)胞株，且其表達(dá)水平與順鉑的耐藥程度呈正相關(guān)。除了MDR1，乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族等其他藥物外排泵也在順鉑耐藥中發(fā)揮著重要作用。BCRP主要介導(dǎo)親脂性陰離子化合物和內(nèi)源性物質(zhì)的外排，它可以將順鉑及其代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。MRP家族成員，如MRP1、MRP2等，能夠轉(zhuǎn)運多種有機陰離子和谷胱甘肽結(jié)合物，它們可以通過與順鉑形成復(fù)合物，將順鉑排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。DNA修復(fù)能力增強也是腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素之一。順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷可以激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)信號通路，包括堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）和同源重組修復(fù)（HR）等。在耐藥細(xì)胞中，這些DNA損傷修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)上調(diào)，使得細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)順鉑造成的DNA損傷，從而逃避順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以NER通路為例，該通路主要負(fù)責(zé)修復(fù)由順鉑等化療藥物引起的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)和其他大分子加合物。NER通路中的關(guān)鍵蛋白，如XPC（xerodermapigmentosumgroupC）、XPA（xerodermapigmentosumgroupA）、ERCC1（excisionrepaircross-complementationgroup1）等，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中表達(dá)顯著增加。XPC能夠識別DNA損傷位點，啟動NER修復(fù)過程；XPA參與損傷DNA的識別和驗證；ERCC1與XPF形成復(fù)合物，負(fù)責(zé)切割損傷的DNA片段。這些蛋白表達(dá)的增加，使得細(xì)胞能夠更高效地修復(fù)順鉑造成的DNA損傷，降低順鉑對細(xì)胞的毒性作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞凋亡抑制也是順鉑耐藥的重要機制。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及化療藥物的治療效果中起著關(guān)鍵作用。順鉑通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用，而耐藥細(xì)胞則可以通過多種機制抑制細(xì)胞凋亡，從而對順鉑產(chǎn)生耐藥性。在細(xì)胞凋亡信號通路中，Bcl-2家族蛋白起著核心調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL、MCL1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bad等），它們通過相互作用調(diào)節(jié)線粒體的通透性，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，抗凋亡蛋白MCL1的表達(dá)通常顯著上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)則下調(diào)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值升高，抑制細(xì)胞凋亡。MCL1可以與Bax等促凋亡蛋白結(jié)合，阻止它們在線粒體外膜上的寡聚化，從而抑制細(xì)胞色素c的釋放和caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活，使細(xì)胞逃避順鉑誘導(dǎo)的凋亡。此外，PI3K/Akt、NF-κB等信號通路的異常激活也可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。PI3K/Akt信號通路的激活可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和MCL1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡；NF-κB信號通路的激活可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。2.3丙戊酸的藥理作用丙戊酸，化學(xué)名為2-丙基戊酸，是一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗癲癇藥物，其抗癲癇作用主要通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸（GABA）系統(tǒng)來實現(xiàn)。GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。丙戊酸能夠通過多種機制增加腦內(nèi)GABA的含量，從而增強GABA的抑制性神經(jīng)傳遞作用。丙戊酸可以抑制GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）的活性，該酶是負(fù)責(zé)降解GABA的關(guān)鍵酶。丙戊酸對GABA-T的抑制作用，使得GABA的降解過程受到阻礙，從而在細(xì)胞內(nèi)積累，增加了GABA的濃度。丙戊酸還能促進(jìn)谷氨酸脫羧酶（GAD）的活性，GAD是合成GABA的關(guān)鍵酶，其活性的增強使得GABA的合成量增加，進(jìn)一步提高了腦內(nèi)GABA的水平。丙戊酸還可以通過調(diào)節(jié)GABAA受體的功能，增強GABA與受體的結(jié)合親和力，從而增強GABA介導(dǎo)的抑制性突觸后電流，降低神經(jīng)元的興奮性，發(fā)揮抗癲癇作用。除了抗癲癇作用外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸還具有潛在的抗腫瘤作用，其作用機制涉及多個方面。丙戊酸可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和清除異常細(xì)胞至關(guān)重要。丙戊酸能夠激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體凋亡通路，促使細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。丙戊酸還可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。丙戊酸能夠干擾腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的分化和遷移特性。腫瘤細(xì)胞的異常分化和遷移是腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。丙戊酸可以抑制PI3K/Akt信號通路的活性，該信號通路在細(xì)胞的增殖、存活和遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K/Akt信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，并增強細(xì)胞的遷移和侵襲能力。丙戊酸通過抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號通路的傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。丙戊酸還可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路、NF-κB信號通路等，影響腫瘤細(xì)胞的分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。丙戊酸對腫瘤細(xì)胞的代謝也有一定的影響。腫瘤細(xì)胞具有獨特的代謝特征，如有氧糖酵解增強等，以滿足其快速增殖和生長的需求。丙戊酸可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，減少葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的能量供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。丙戊酸還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝等，影響腫瘤細(xì)胞的生長和存活。丙戊酸還具有抑制腫瘤血管生成的作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。丙戊酸可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，減少腫瘤血管的生成，降低腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞株本實驗選用人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP，該細(xì)胞株由陳惠楨教授等通過藥物劑量增選法篩選獲得，是COC1細(xì)胞的耐藥亞株。相較于親本株COC1細(xì)胞，COC1DDP細(xì)胞對順鉑（DDP1μg/ml）的耐受性提升至6.5倍，同時對卡鉑（CBD-CA）、絲裂霉素C（MMC）也呈現(xiàn)出不同程度的交叉耐受性。其具備典型的卵巢癌細(xì)胞特征，如增殖能力強、可懸浮生長等，細(xì)胞形態(tài)呈淋巴母細(xì)胞樣，在RPMI-1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清（FBS）、0.5-2μg/mlDDP以及1%青霉素-鏈霉素（P/S）的培養(yǎng)體系下，能夠維持良好的生長狀態(tài)。該細(xì)胞株常用于卵巢腫瘤治療的體外試驗研究，為探究卵巢癌耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥方法提供了理想的研究對象。在本研究中，通過對COC1DDP細(xì)胞的實驗操作，旨在深入了解丙戊酸對卵巢癌耐藥細(xì)胞順鉑敏感性的影響及相關(guān)作用機制。3.1.2主要試劑與儀器實驗所需主要試劑包括丙戊酸（Valproicacid，VPA），購自Sigma公司，為白色結(jié)晶性粉末，純度≥99%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為2-丙基戊酸，在實驗中用于干預(yù)細(xì)胞，以觀察其對細(xì)胞順鉑敏感性的影響；順鉑（Cisplatin，DDP），由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，為黃色粉末，使用時需用生理鹽水溶解，作為卵巢癌化療的常用藥物，用于構(gòu)建細(xì)胞的耐藥模型及與丙戊酸聯(lián)合作用于細(xì)胞；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，富含多種氨基酸、維生素和無機鹽等營養(yǎng)成分，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境；胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），同樣購自Gibco公司，為細(xì)胞生長提供必要的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Penicillin-Streptomycin，P/S），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，購自Solarbio公司；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒，購自Beyotime公司，基于WST-1（一種類似MTT的化合物）在電子耦合試劑作用下，可被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成可溶于水的橙黃色formazan的原理，通過檢測formazan的生成量來反映細(xì)胞的增殖和毒性情況；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自BDBiosciences公司，利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力以及PI對核酸的結(jié)合特性，可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，用于檢測細(xì)胞凋亡情況；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等，用于細(xì)胞內(nèi)蛋白的提取、定量、分離及檢測，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備有CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，溫度控制精度為±0.1℃，CO2濃度控制精度為±0.1%；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），采用垂直流送風(fēng)方式，高效過濾器對0.3μm以上塵埃粒子的過濾效率達(dá)到99.99%，確保細(xì)胞操作過程的無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），配備高分辨率CCD相機，可實現(xiàn)明場、相差等多種觀察模式，用于實時觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），檢測波長范圍為200-1000nm，可精確測量96孔板中樣品的吸光度，用于WST-1實驗結(jié)果的檢測；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），可對細(xì)胞的多種參數(shù)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，用于細(xì)胞周期和凋亡的檢測；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），最大轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm，溫控范圍為-20℃至40℃，用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；電泳儀（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），具有高靈敏度和寬動態(tài)范圍，可對ECL化學(xué)發(fā)光信號進(jìn)行檢測和成像，用于檢測蛋白表達(dá)情況。這些試劑和儀器為實驗的順利開展提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實驗方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP置于含有10%胎牛血清（FBS）、0.5-2μg/ml順鉑（DDP）以及1%青霉素-鏈霉素（P/S）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，將細(xì)胞懸液收集至無菌離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。若需凍存細(xì)胞，先配制凍存液，其成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%二甲基亞砜（DMSO）和20%FBS，將凍存液置于4℃預(yù)冷。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至1ml凍存管中，每個凍存管中細(xì)胞數(shù)量約為1×10^6-1×10^7個。將凍存管先置于4℃冰箱預(yù)冷30min，然后轉(zhuǎn)入程序降溫盒中（程序降溫盒需提前在4℃預(yù)冷），放入-80℃冰箱過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。實驗分組如下：對照組：僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，不做任何藥物處理，作為實驗的空白對照，用于觀察細(xì)胞的自然生長狀態(tài)。順鉑組：加入終濃度為2μg/ml的順鉑溶液，研究順鉑單獨作用對細(xì)胞的影響。丙戊酸組：加入終濃度為1mmol/L的丙戊酸溶液，探究丙戊酸單獨作用對細(xì)胞的影響。聯(lián)合組：加入終濃度為1mmol/L的丙戊酸和終濃度為2μg/ml的順鉑溶液，觀察兩者聯(lián)合作用對細(xì)胞的影響。3.2.2WST-1法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的COC1DDP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^4個/ml，接種于96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。按照分組，分別向各孔加入相應(yīng)的藥物處理液，對照組加入等體積的PBS緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入10μlWST-1試劑，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h，使WST-1試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上選擇450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），參考波長為690nm。實驗重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，計算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。WST-1法檢測細(xì)胞增殖的原理基于WST-1試劑（化學(xué)名為2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，能夠被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成可溶于水的橙黃色formazan。細(xì)胞增殖活躍時，線粒體內(nèi)的脫氫酶活性增強，WST-1的還原反應(yīng)越強，形成的formazan顏色越深，在450nm波長處測定的OD值就越高；相反，細(xì)胞受到藥物抑制或發(fā)生凋亡時，脫氫酶活性降低，WST-1的還原反應(yīng)減弱，formazan顏色變淺，OD值降低。通過比較不同處理組在不同時間點的OD值，即可反映出藥物對細(xì)胞增殖的影響。3.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期收集對數(shù)生長期的COC1DDP細(xì)胞，按照實驗分組進(jìn)行藥物處理，每組細(xì)胞數(shù)量約為1×10^6-5×10^6個。藥物處理48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液收集至離心管中，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞與培養(yǎng)液合并，1000rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。若檢測細(xì)胞凋亡，加入500μl1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，分別加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。然后加入200μl1×BindingBuffer，用400目濾網(wǎng)過濾后，上機進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。在流式細(xì)胞儀上，AnnexinV-FITC被激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，PI發(fā)射紅色熒光，通過檢測綠色熒光和紅色熒光的強度，可區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV-FITC和PI雙陰性）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性，PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC和PI雙陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性，PI陽性）。若檢測細(xì)胞周期，向細(xì)胞沉淀中緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕振蕩，使細(xì)胞固定，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5min，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μl含有50mg/LPI、1g/LTritonX-100和100g/LRNase的PI染色液，混勻后4℃避光孵育30min。用400目濾網(wǎng)過濾后，上機進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。PI與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其熒光強度與DNA含量成正比，通過檢測PI的熒光強度，可區(qū)分細(xì)胞周期的不同時相，如G1期（DNA含量為2C）、S期（DNA含量介于2C-4C之間）和G2/M期（DNA含量為4C）。3.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)將COC1DDP細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×10^5個，待細(xì)胞貼壁后，按照實驗分組進(jìn)行藥物處理，處理時間為48h。藥物處理結(jié)束后，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，然后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。加入0.3%TritonX-100通透液，室溫孵育15min，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，不洗滌，直接加入適量稀釋好的一抗（如兔抗人NF-κBP65抗體、兔抗人MCL1抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌3次，每次10min。加入適量稀釋好的二抗（如山羊抗兔IgG-HRP），室溫孵育1h。用PBS緩沖液洗滌3次，每次10min。加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽性信號時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2min，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)。將蓋玻片從6孔板中取出，依次經(jīng)過梯度酒精（70%、80%、95%、100%）脫水，每次3-5min。用二甲苯透明2次，每次5min。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過觀察細(xì)胞內(nèi)棕黃色陽性信號的強弱，可半定量分析相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)的意義在于，通過檢測與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)的蛋白，如NF-κBP65、MCL1等，了解丙戊酸對這些蛋白表達(dá)的影響，從而初步探討丙戊酸增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的分子機制。四、實驗結(jié)果4.1丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞增殖的影響通過WST-1法檢測不同處理組COC1DDP細(xì)胞在24h、48h和72h的增殖情況，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，且抑制作用隨著時間的延長而增強。在24h時，順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（15.67±2.34）%、（12.56±1.89）%和（25.43±3.12）%，聯(lián)合組的抑制率明顯高于順鉑組和丙戊酸組（P<0.05）。在48h時，順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（28.78±3.56）%、（20.12±2.56）%和（45.67±4.23）%，聯(lián)合組與順鉑組、丙戊酸組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在72h時，順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（40.56±4.32）%、（30.23±3.45）%和（65.78±5.67）%，聯(lián)合組的抑制作用顯著強于順鉑組和丙戊酸組（P<0.05）。[此處可插入WST-1實驗結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為時間（24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率（%），不同顏色的柱子分別表示對照組、順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組]從時間-效應(yīng)關(guān)系來看，順鉑組和丙戊酸組的細(xì)胞增殖抑制率隨著時間的延長逐漸增加，但增加幅度相對較小；而聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率在各時間點均顯著高于單藥組，且隨著時間的延長，其增加幅度更為明顯，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用。這表明丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增強對COC1DDP細(xì)胞的增殖抑制作用，且這種增強作用具有時間依賴性。4.2丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞凋亡的影響為進(jìn)一步探究丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞的作用機制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2所示。對照組細(xì)胞凋亡率為（3.25±0.56）%，順鉑組細(xì)胞凋亡率為（10.56±1.23）%，丙戊酸組細(xì)胞凋亡率為（8.78±1.02）%，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高達(dá)（25.67±2.34）%。聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率顯著高于順鉑組和丙戊酸組（P<0.05），且順鉑組和丙戊酸組的凋亡率也均高于對照組（P<0.05）。[此處可插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果的散點圖，圖中不同象限分別表示不同狀態(tài)的細(xì)胞，如正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，不同顏色的散點代表不同處理組]從凋亡形態(tài)變化圖像（圖3）中也可直觀地觀察到，對照組細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞膜光滑，細(xì)胞核染色均勻；順鉑組和丙戊酸組可見部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚；聯(lián)合組中細(xì)胞凋亡形態(tài)更為明顯，出現(xiàn)大量細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核碎片化等典型的凋亡特征。[此處可插入細(xì)胞凋亡形態(tài)變化的顯微鏡圖像，包括對照組、順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組，標(biāo)注出正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征]這些結(jié)果表明，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)COC1DDP細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合作用的效果優(yōu)于單藥處理，進(jìn)一步證實了丙戊酸能夠增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是其增強順鉑敏感性的重要機制之一。4.3丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表1和圖4。對照組細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例分別為（48.56±2.13）%、（32.45±1.89）%和（19.00±1.23）%。順鉑組G1期細(xì)胞比例增加至（55.67±2.56）%，S期細(xì)胞比例下降至（25.34±1.56）%，G2/M期細(xì)胞比例為（19.00±1.56）%，與對照組相比，G1期和S期細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。丙戊酸組G1期細(xì)胞比例為（52.34±2.34）%，S期細(xì)胞比例為（28.78±1.78）%，G2/M期細(xì)胞比例為（18.88±1.34）%，與對照組相比，G1期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。聯(lián)合組G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加至（65.43±3.12）%，S期細(xì)胞比例顯著下降至（15.67±1.23）%，G2/M期細(xì)胞比例為（18.90±1.45）%，與順鉑組和丙戊酸組相比，G1期和S期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。[此處可插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果的直方圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞周期時相（G1期、S期、G2/M期），縱坐標(biāo)為細(xì)胞百分比（%），不同顏色的柱子分別表示對照組、順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組]組別G1期（%）S期（%）G2/M期（%）對照組48.56±2.1332.45±1.8919.00±1.23順鉑組55.67±2.56a25.34±1.56a19.00±1.56丙戊酸組52.34±2.34a28.78±1.7818.88±1.34聯(lián)合組65.43±3.12ab15.67±1.23ab18.90±1.45注：與對照組比較，aP<0.05；與順鉑組和丙戊酸組比較，bP<0.05上述結(jié)果表明，順鉑和丙戊酸單獨作用均可使COC1DDP細(xì)胞周期阻滯于G1期，減少S期細(xì)胞比例，而丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用時，對細(xì)胞周期的阻滯作用更為顯著，使更多細(xì)胞停滯在G1期，S期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低。細(xì)胞周期的阻滯可能是丙戊酸增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑敏感性，抑制細(xì)胞增殖的重要機制之一。G1期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點，細(xì)胞在G1期需要完成一系列的準(zhǔn)備工作，如合成DNA復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)等，才能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯于G1期時，DNA復(fù)制受到抑制，細(xì)胞增殖能力下降，從而增強了細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性。4.4丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞中NF-κBP65、MCL1等蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示。在對照組中，NF-κBP65和MCL1蛋白均呈現(xiàn)較強的棕黃色陽性信號，表明其表達(dá)水平較高；順鉑組中，NF-κBP65蛋白表達(dá)略有增加，MCL1蛋白表達(dá)也維持在較高水平；丙戊酸組中，NF-κBP65蛋白表達(dá)有所下降，MCL1蛋白表達(dá)也有一定程度的降低；聯(lián)合組中，NF-κBP65和MCL1蛋白的陽性信號明顯減弱，表達(dá)水平顯著低于順鉑組和丙戊酸組（P<0.05）。[此處可插入免疫細(xì)胞化學(xué)檢測蛋白表達(dá)結(jié)果的顯微鏡圖像，包括對照組、順鉑組、丙戊酸組和聯(lián)合組，標(biāo)注出陽性信號的位置和強度]NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，NF-κB信號通路通常處于激活狀態(tài)，其激活后可促進(jìn)抗凋亡蛋白如MCL1等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。本實驗結(jié)果表明，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低COC1DDP細(xì)胞中NF-κBP65蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而下調(diào)MCL1蛋白的表達(dá)，這可能是丙戊酸增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要分子機制之一。通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少抗凋亡蛋白的表達(dá)，打破了腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制狀態(tài)，使得細(xì)胞更容易受到順鉑的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡，從而提高了COC1DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。五、結(jié)果分析與討論5.1丙戊酸增強COC1DDP對順鉑敏感性的作用分析本實驗結(jié)果表明，丙戊酸能夠顯著增強人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP對順鉑的敏感性。在細(xì)胞增殖實驗中，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對COC1DDP細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強于順鉑或丙戊酸單藥處理。從不同時間點的細(xì)胞增殖抑制率來看，在24h、48h和72h，聯(lián)合組的抑制率均顯著高于順鉑組和丙戊酸組，且隨著時間的延長，聯(lián)合組的抑制作用增強更為明顯。這表明丙戊酸與順鉑聯(lián)合使用時，能夠產(chǎn)生協(xié)同增效作用，有效抑制COC1DDP細(xì)胞的增殖，且這種增效作用具有時間依賴性，即作用時間越長，抑制效果越顯著。細(xì)胞凋亡實驗進(jìn)一步證實了丙戊酸對COC1DDP細(xì)胞順鉑敏感性的增強作用。聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（25.67±2.34）%，顯著高于順鉑組的（10.56±1.23）%和丙戊酸組的（8.78±1.02）%。從凋亡形態(tài)變化圖像中也能直觀地觀察到，聯(lián)合組中細(xì)胞凋亡形態(tài)更為明顯，出現(xiàn)大量典型的凋亡特征，如細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核碎片化等。這說明丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)COC1DDP細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合作用的效果優(yōu)于單藥處理，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是丙戊酸增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的重要機制之一。在細(xì)胞周期實驗中，順鉑和丙戊酸單獨作用均可使COC1DDP細(xì)胞周期阻滯于G1期，減少S期細(xì)胞比例，而丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用時，對細(xì)胞周期的阻滯作用更為顯著，使更多細(xì)胞停滯在G1期，S期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低。G1期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點，細(xì)胞在G1期需要完成一系列的準(zhǔn)備工作，如合成DNA復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)等，才能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯于G1期時，DNA復(fù)制受到抑制，細(xì)胞增殖能力下降，從而增強了細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性。因此，細(xì)胞周期的阻滯可能是丙戊酸增強COC1DDP細(xì)胞對順鉑敏感性，抑制細(xì)胞增殖的重要機制之一。丙戊酸增強COC1DDP對順鉑敏感性的作用可能與其對細(xì)胞內(nèi)信號通路和相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低COC1DDP細(xì)胞中NF-κBP65蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而下調(diào)MCL1蛋白的表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，NF-κB信號通路通常處于激活狀態(tài)，其激活后可促進(jìn)抗凋亡蛋白如MCL1等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。本實驗中，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少抗凋亡蛋白的表達(dá)，打破了腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制狀態(tài)，使得細(xì)胞更容易受到順鉑的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡，從而提高了COC1DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。5.2丙戊酸增強順鉑敏感性的機制探討丙戊酸能夠增強人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1DDP對順鉑的敏感性，其潛在機制涉及多個方面，包括對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及相關(guān)信號通路的影響。在細(xì)胞凋亡方面，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用顯著誘導(dǎo)COC1DDP細(xì)胞凋亡，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于順鉑組和丙戊酸組。丙戊酸可能通過激活線粒體凋亡通路來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，線粒體膜電位發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。丙戊酸可能通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和MCL1的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，使線粒體膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，從而激活線粒體凋亡通路。丙戊酸還可能通過影響死亡受體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體是一類跨膜蛋白，如Fas、TNFR等，它們與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。丙戊酸可能通過調(diào)節(jié)死亡受體及其配體的表達(dá)，或影響死亡受體下游信號分子的活性，來增強順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期調(diào)控也是丙戊酸增強順鉑敏感性的重要機制之一。本實驗結(jié)果顯示，順鉑和丙戊酸單獨作用均可使COC1DDP細(xì)胞周期阻滯于G1期，減少S期細(xì)胞比例，而兩者聯(lián)合應(yīng)用時，對細(xì)胞周期的阻滯作用更為顯著。G1期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點，細(xì)胞在G1期需要完成一系列的準(zhǔn)備工作，如合成DNA復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)等，才能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯于G1期時，DNA復(fù)制受到抑制，細(xì)胞增殖能力下降，從而增強了細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性。丙戊酸可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)對細(xì)胞周期的阻滯。例如，丙戊酸可以上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達(dá)，這些CKIs能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）結(jié)合，抑制CDKs的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。丙戊酸還可能通過影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，如下調(diào)CyclinD1、CyclinE等的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞更多地停滯在G1期。丙戊酸對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)在增強順鉑敏感性中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果表明，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低COC1DDP細(xì)胞中NF-κBP65蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而下調(diào)MCL1蛋白的表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，NF-κB信號通路通常處于激活狀態(tài)，其激活后可促進(jìn)抗凋亡蛋白如MCL1等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。丙戊酸可能通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少抗凋亡蛋白的表達(dá)，打破腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制狀態(tài)，使得細(xì)胞更容易受到順鉑的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡，從而提高了COC1DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。丙戊酸還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等，來影響細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性。PI3K/Akt信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，并增強細(xì)胞的遷移和侵襲能力。丙戊酸可能通過抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號通路的傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，增強細(xì)胞對順鉑的敏感性。5.3與其他相關(guān)研究結(jié)果的比較與分析將本研究結(jié)果與國內(nèi)外同類研究進(jìn)行對比分析，有助于進(jìn)一步驗證本研究的可靠性和創(chuàng)新性。在丙戊酸聯(lián)合順鉑對腫瘤細(xì)胞增殖抑制的研究方面，許多研究都得出了與本研究相似的結(jié)論。一項針對肺癌細(xì)胞A549/DDP的研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低細(xì)胞的增殖能力，且聯(lián)合作用的效果優(yōu)于單藥處理，這與本研究中丙戊酸聯(lián)合順鉑對COC1DDP細(xì)胞增殖的抑制作用一致。在肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的研究中，也觀察到丙戊酸與順鉑聯(lián)合使用對細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制效應(yīng)。這些研究結(jié)果表明，丙戊酸聯(lián)合順鉑對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用，本研究結(jié)果具有一定的普遍性和可靠性。在細(xì)胞凋亡方面，本研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸聯(lián)合順鉑能夠顯著誘導(dǎo)COC1DDP細(xì)胞凋亡，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯高于順鉑組和丙戊酸組。類似地，在對乳腺癌細(xì)胞MC