血凝與血凝抑制實驗文檔ppt第1頁，共39頁。一、實驗?zāi)康?、掌握血凝和血凝抑制試驗的基本原理、操作方法和結(jié)果判定方法2、了解新城疫有關(guān)背景知識

第2頁，共39頁。二、實驗內(nèi)容1、血凝試驗(HA)檢測新城疫抗原2、血凝抑制試驗(HI)檢測新城疫抗體第3頁，共39頁。三、實驗原理1、血凝試驗（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種動物地紅細胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細胞的現(xiàn)象稱為血凝（HA）,也稱直接血凝反應(yīng)。病毒顆粒紅細胞第4頁，共39頁。2、血凝抑制試驗（HI）原理：當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒或其血凝素時，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆粒或血凝素直接接觸。這時紅細胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。Iamlate！抗體抗原第5頁，共39頁。四、實驗材料1、血凝板（2人/塊）2、新城疫陽性血清3、被檢血清（1份）4、1％紅細胞懸液5、稀釋液6、移液器（50ul,2人/把）7、槍頭第6頁，共39頁。五、實驗方法與結(jié)果判定血凝試驗（HA)1、在血凝板上第一排的1－12孔內(nèi)各加入50ul生理鹽水2、在第1孔內(nèi)加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀釋至第11孔，最后棄50ul3、每孔加入1％雞紅細胞懸液50ul4、輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37℃中靜置30分鐘5、結(jié)果判定第7頁，共39頁。1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×紅細胞對照生理鹽水505050505050505050505050抗原5050505050505050505050棄50紅細胞505050505050505050505050結(jié)果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－血凝效價測定第8頁，共39頁。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、＋＋＋＋：紅細胞呈細沙樣均勻鋪于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：紅細胞均勻鋪于孔底，當(dāng)邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：紅細胞形成一個環(huán)狀，四周有凝集塊，即50％凝集；4、＋：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，即25％凝集；5、－：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，即無凝集；第9頁，共39頁。第10頁，共39頁。血凝價的判定以出現(xiàn)＋＋（50％凝集）的抗原最高稀釋倍數(shù)為該抗原的血凝價（1:128）。50ul1:256稀釋的病毒抗原為該抗原的一個血凝單位。稀釋倍數(shù)2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×細胞對照結(jié)果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋————第11頁，共39頁。血凝抑制試驗1、將病毒抗原稀釋成4個血凝單位（1/128×4=1:32）2、在血凝板上1－12孔內(nèi)各加入50ul生理鹽水；3、在第1孔內(nèi)加入被檢血清50ul，然后倍比稀釋至第11孔，最后棄50ul；4、第1－12孔內(nèi)加入4單位抗原50ul（第12孔為病毒對照）；5、每孔加入1％雞紅細胞懸液50ul；6、輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37℃中靜置30分鐘6、結(jié)果判定第12頁，共39頁。1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×病毒對照生理鹽水505050505050505050505050血清5050505050505050505050棄504單位抗原505050505050505050505050紅細胞505050505050505050505050結(jié)果－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－血凝抑制效價測定第13頁，共39頁。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、＋＋＋＋：紅細胞呈細沙樣均勻鋪于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：紅細胞均勻鋪于孔底，當(dāng)邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：紅細胞形成一個環(huán)狀，四周有下凝集塊，即50％凝集；4、＋：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，即25％凝集；5、－：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，即無凝集。第14頁，共39頁。血凝抑制價的判定以出現(xiàn)完全抑制凝集(即不凝集)的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的血凝抑制價（1:4）。稀釋倍數(shù)2×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×血清對照結(jié)果——＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—第15頁，共39頁。六、注意事項1、紅細胞用前請搖勻2、用槍加樣定要準(zhǔn)，盡量不要有氣泡3、結(jié)果判定有耐心4、HA和HI勿相混第16頁，共39頁。七、新城疫背景介紹第17頁，共39頁。雞新城疫

（NewcastleDiseaseND）

第18頁，共39頁。1、概述ND是由ND病毒（NewcastlediseaseVirus,NDV）引起的高度接觸性和高度毀滅性的急性敗血性傳染病。1926年首先發(fā)生于印尼，同年發(fā)現(xiàn)于英國新城我國1928年有該病記載是當(dāng)今全球范圍內(nèi)最嚴(yán)重的家禽傳染病之一被國際獸疫局（OIE)列為A類傳染病

第19頁，共39頁。別名：新城疫、亞洲雞溫、偽雞瘟雞瘟：禽流感、歐洲雞溫、真性雞溫第20頁，共39頁。新城疫病毒，屬副粘病毒科，副粘病毒屬。病毒顆粒表面具有血凝素蛋白，可以刺激機體產(chǎn)生血凝抑制抗體，2、病原體第21頁，共39頁。第22頁，共39頁。根據(jù)臨診表現(xiàn)和病程長短分為：（1）最急性型：突然發(fā)病，病變不明顯，見于雛雞及本病流行初期。急性型：（典型新城疫）亞急性型（非典型ND)慢性型（非典型ND）3、病狀及病理變化第23頁，共39頁。（2）、急性型：侵害消化系統(tǒng)為主，也稱嗜內(nèi)臟速發(fā)型。病狀特點：a.食欲減退，飲水增加，離群呆立，眼睛半開半閉，翅膀下垂，冠、肉髯呈紫黑色。第24頁，共39頁。b.嗉囊積液、體溫升高、呼吸困難。鼻腔內(nèi)有大量分泌物，嚴(yán)重拉稀糞便呈黃綠色或褐色，有時混有血。第25頁，共39頁。c.死亡率高,非免疫雞感染后可以80-100%死亡。d.部分患雞出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭頸歪向一側(cè)而咀向上，母雞產(chǎn)蛋下降。第26頁，共39頁。第27頁，共39頁。病變特點：全身的粘膜和漿膜出血，突出病變在消化道。A.腺胃粘膜水腫，粘膜上的乳頭及其周圍有出血點，間有潰瘍。B.腺胃與肌胃、腺胃與食道交界處粘膜可見到出血點或出血帶。第28頁，共39頁。C.小腸、直腸、泄殖腔粘膜充血、出血或有壞死，D.盲腸扁桃體出血。第29頁，共39頁。第30頁，共39頁。皮下脂肪出血第31頁，共39頁。腦膜充血出血卵黃性腹膜炎第32頁，共39頁。有的病雞表現(xiàn)眼結(jié)膜炎第33頁，共39頁。（3）、亞急性型（非典型ND，以侵害呼吸道為主）也稱肺腦炎型：其主要的特點：是癥狀及病變不典型。癥狀：多見4-35日齡雞，25日齡前后最常發(fā)病。呼吸困難，精神沉郁，繼而較早地出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，此時出現(xiàn)歪頭，扭頸，角弓反張，倒地不能起立。第34頁，共39頁。病變：喉頭及氣管粘膜水腫，出血、充血、并有大量粘液，肺呈紫黑色（肺出血性炎癥）。硬腦膜下樹枝狀充血，并有出血點。心冠、脂肪有出血點。發(fā)病率高，死亡率較低。第35頁，共39頁。（4）、慢性型（非典型ND）母雞：輕者只表現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降（約10-30%），產(chǎn)軟殼蛋。重者出現(xiàn)精神沉郁，呼吸困難，黃綠色稀糞，喉頭、氣管粘膜充血、出血，個別病例出現(xiàn)消化道病變。第36頁，共39頁。5、診斷

1、血凝抑制試驗（HI）：監(jiān)測雞群中的HI抗體，評價疫苗的免疫效果及雞體內(nèi)的抗體水平。

2、分離病毒：鑒