第十一單元生物技術(shù)與工程第52講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用【課標要求】1.滅菌是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的前提；2.闡明無菌技術(shù)是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區(qū)域不被微生物污染的技術(shù)；3.說明通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方可有目的地培養(yǎng)某種微生物；4.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法；5.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法是測定微生物數(shù)量的常用方法?？键c1培養(yǎng)基和無菌技術(shù)考點透析知識1微生物的培養(yǎng)基1.概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.類型(1)根據(jù)物理性質(zhì)分①固體培養(yǎng)基——用于微生物的分離、純化、鑒定、活菌計數(shù)和保藏等。②液體培養(yǎng)基——一般用于工業(yè)生產(chǎn)和擴大培養(yǎng)(可通過振蕩、搖床等實現(xiàn)對培養(yǎng)基充分利用)。③半固體培養(yǎng)基。三者的區(qū)別在于是否加入凝固劑及加的量多少。常用的凝固劑有瓊脂等。(2)根據(jù)成分分①天然培養(yǎng)基——一般用于普通培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。②合成培養(yǎng)基——多用于研究和育種。(3)根據(jù)用途分eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(基礎培養(yǎng)基,特殊培養(yǎng)基\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(選擇培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基等))))3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成(1)各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)作用主要來源水良好的溶劑、細胞結(jié)構(gòu)的重要組成成分培養(yǎng)基、空氣、代謝產(chǎn)物碳源提供碳元素，有機碳源是異養(yǎng)生物的能源物質(zhì)葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、牛肉膏、蛋白胨等氮源提供氮元素，合成蛋白質(zhì)、核酸、磷脂以及含氮代謝產(chǎn)物無機氮源，如銨鹽、硝酸鹽等；有機氮源，如酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等無機鹽組成細胞結(jié)構(gòu)和許多化合物，調(diào)節(jié)生命活動；某些化能自養(yǎng)菌的能源如磷酸鹽等無機化合物(2)培養(yǎng)基的其他條件：滿足微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2等的需求。培養(yǎng)微生物種類特殊要求乳酸桿菌培養(yǎng)基中添加維生素霉菌培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性細菌培養(yǎng)基的pH調(diào)至中性或弱堿性厭氧微生物需要提供無氧的條件深度指津不同種類的微生物代謝特點不同，因此對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的需求也不同。如，自養(yǎng)型微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要是無機鹽，碳源可來自大氣中的CO2，氮源可由含氮無機鹽提供。異養(yǎng)型微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要是有機物，即碳源、氮源主要由有機物提供，部分異養(yǎng)型微生物也可以利用無機氮源。知識2無菌技術(shù)獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。無菌技術(shù)主要包括：消毒和滅菌。1.消毒和滅菌項目消毒滅菌概念使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、酒精消毒法、紫外線消毒法濕熱滅菌(如高壓蒸汽滅菌法)、干熱滅菌、灼燒滅菌區(qū)別最大區(qū)別在于是否殺死芽孢和孢子2.三種滅菌方法的比較類型濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌媒介沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽熱空氣火焰的充分燃燒層方法高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃，維持15～30min160～170℃、1～2h直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒對象培養(yǎng)基等耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金屬用具等接種工具、試管口、瓶口等原理高溫或高溫、高壓使蛋白質(zhì)變性失活，導致微生物活體以及芽孢和孢子全部死亡3.操作對象或注意點(1)對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。(但是不耐高溫的培養(yǎng)基或成分可采用其他方法除菌，如血清可通過過濾除菌。)(3)為了避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作都應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。(4)實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。解疑釋惑教材中的高壓蒸汽滅菌鍋利用的是濕熱滅菌原理。關(guān)于手動式高壓蒸汽滅菌鍋的使用如下：操作步驟操作要領(lǐng)①加水向外層鍋內(nèi)加水(蒸餾水或純化水)，水面達到水位標記線即可(水量過少會燒干)②裝鍋將待滅菌物品放在滅菌桶中(不要裝得太滿，至少留1/3空間)，加蓋，對稱旋緊固定螺栓③加熱排氣加熱滅菌鍋，打開排氣閥，等冷空氣充分排出后，關(guān)閉排氣閥(否則壓強達標時，溫度上不去，蒸汽的穿透力低，影響滅菌效果)④保溫、保壓100kPa、121℃下，15～30min(蘇教版為103kPa、121℃下15～20min)⑤出鍋壓力表指針降至“0”點，溫度下降后再打開排氣閥思辨小練1.判斷下列說法的正誤：(1)液體培養(yǎng)基含有水，而固體培養(yǎng)基不含水。(×)提示：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基含量最多的物質(zhì)均是水，它們的區(qū)別為是否含有凝固劑。(2)以CO2為唯一碳源的自養(yǎng)微生物，其中碳源物質(zhì)也是該微生物的能源物質(zhì)。(×)提示：CO2為無機碳源，不能作為能源物質(zhì)。(3)(2023·山東卷T15B)平板涂布時涂布器使用前必須進行消毒。(×)提示：平板涂布時，涂布器使用前必須進行滅菌處理，以防止外來雜菌的污染。(4)(2023·山東卷T15A)不含氮源的平板不能用于微生物培養(yǎng)。(×)提示：不含有氮源的平板可用來培養(yǎng)能利用空氣中氮氣的微生物。(5)對接種環(huán)灼燒滅菌時，只需要在酒精燈火焰上燒紅環(huán)狀部分。(×)提示：需要灼燒接種環(huán)的金屬部分以及手柄，凡是能夠深入試管的部分都需要灼燒滅菌。2.在科研和生產(chǎn)上，研究和應用微生物的前提是防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物。在實驗室中培養(yǎng)微生物，一方面要為人們需要的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面確保其他微生物無法混入。典題說法考向1微生物的培養(yǎng)基例1下列關(guān)于培養(yǎng)基和所含營養(yǎng)物質(zhì)的說法，正確的是(C)A．通常情況下，瓊脂既可作為凝固劑，也可作為微生物的碳源B．蛋白胨為微生物的生長主要提供碳源、氮源、磷酸鹽和維生素C．培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加特殊營養(yǎng)物質(zhì)維生素D．被污染的培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后還能繼續(xù)使用【解析】一般情況下，瓊脂可以作為凝固劑，但不能作為微生物的碳源，A錯誤；蛋白胨主要為微生物的生長提供碳源、氮源和維生素等，不能提供磷酸鹽，牛肉膏提供碳源、氮源、磷酸鹽和維生素等，B錯誤；為了滿足乳酸桿菌對營養(yǎng)物質(zhì)的要求，保證乳酸桿菌能正常生長繁殖，培養(yǎng)乳酸桿菌的時候需要在培養(yǎng)基中添加維生素，C正確；污染的培養(yǎng)基滅菌后不能再次使用，因為可能導致營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生變化，從而使培養(yǎng)基失去營養(yǎng)價值，D錯誤?？枷?無菌技術(shù)例2(2025·鎮(zhèn)江期初)防止雜菌污染是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵。下列敘述錯誤的是(C)A．利用微生物能夠寄生于多種細菌體內(nèi)使細菌裂解，可實現(xiàn)生物消毒B．利用紫外線對超凈工作臺進行消毒前，噴灑消毒液可加強消毒效果C．利用干熱滅菌箱對培養(yǎng)基進行滅菌時，應在160℃的熱空氣中維持2～3hD．利用酒精燈對金屬用具進行灼燒滅菌時，應在酒精燈火焰充分燃燒層進行【解析】有的微生物能夠寄生于多種細菌體內(nèi)使細菌裂解，因此可以使用這些微生物進行生物消毒，A正確；用紫外線照射30min，可以殺死物體表面或空氣中的微生物，在照射前，適量噴灑苯酚等消毒液，可以加強消毒效果，B正確；利用干熱滅菌箱對滅菌物品進行滅菌時，應在160～170℃的熱空氣中維持1～2h，培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法，C錯誤；接種環(huán)等金屬用具一般用灼燒滅菌法，即直接在酒精燈火焰充分燃燒層灼燒滅菌，D正確?？键c2微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)考點透析知識1微生物的純培養(yǎng)1.純培養(yǎng)：在微生物學中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。2.微生物純培養(yǎng)的步驟：配制培養(yǎng)基、滅菌、倒平板、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。3.酵母菌的純培養(yǎng)(1)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體。(2)獲得單菌落的兩種常用方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。(3)酵母菌的純培養(yǎng)步驟注：倒平板的具體操作步驟如下圖所示：解疑釋惑平板倒置培養(yǎng)的目的主要有：既可以防止皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基造成污染，又可以避免培養(yǎng)基中的水分過快地揮發(fā)，等等。知識2分離純化，獲得單菌落的兩種方法1.純化方法(1)上圖A可表示用平板劃線法接種獲得的平板，菌體的分離是通過連續(xù)劃線操作實現(xiàn)的。(2)上圖B可表示用稀釋涂布平板法接種獲得的平板，菌體的分散是通過一系列的梯度(等比)稀釋操作實現(xiàn)的。(3)獲得圖A用到的接種工具是接種環(huán)，而圖B是涂布器。圖A、B都可用于觀察菌落特征。2.平板劃線的具體操作解疑釋惑灼燒接種環(huán)的不同目的①第一次劃線前：殺死接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物；②每次劃線前：殺死殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端；③劃線結(jié)束后：殺死殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。思辨小練1.判斷下列說法的正誤：(1)培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進行滅菌。(×)提示：培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿的操作屬于倒平板，在配制培養(yǎng)基的過程中要先滅菌后倒平板。培養(yǎng)基滅菌一般是用試管或錐形瓶。(2)轉(zhuǎn)換劃線角度后需灼燒接種環(huán)再進行劃線。(√)(3)平板冷凝后應將平板倒置，防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。(√)(4)(2023·山東卷T15C)接種后未長出菌落的培養(yǎng)基可以直接丟棄。(×)提示：接種后未長出菌落的培養(yǎng)基也可能有少量微生物，應滅菌后再丟棄。2.如何判斷在制備和培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基是否被污染？提示：設置一組未接種微生物的空白培養(yǎng)基，與接種了微生物的平板放在相同的條件下培養(yǎng)，若空白培養(yǎng)基上未長出菌落，說明培養(yǎng)基未被污染。典題說法考向微生物的純培養(yǎng)例(2025·泰州靖江期中)實驗小組對釀酒酵母菌進行平板劃線的純培養(yǎng)操作，下列有關(guān)敘述正確的是(D)A．將配制好的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基放入干熱滅菌箱內(nèi)滅菌B．在酒精燈火焰附近，將培養(yǎng)皿蓋完全打開后倒入培養(yǎng)基C．從第一次劃線的末端開始到第二次劃線結(jié)束，即完成接種D．將接種后的平板和未接種的平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)【解析】將配制好的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進行滅菌，A錯誤；在酒精燈火焰附近，將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，B錯誤；從第一次劃線的末端開始第二次劃線，重復該操作，一般再做第三、四、五次劃線，以便于得到單菌落，C錯誤；將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，其中設置空平板的目的是檢驗培養(yǎng)基滅菌是否合格，D正確。變式(2023·江蘇卷)下列關(guān)于細菌和酵母菌實驗的敘述，正確的是(A)A．通常酵母菌培養(yǎng)基比細菌培養(yǎng)基有更高的碳氮比B．通常細菌的生長速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大C．通常細菌培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌法滅菌，酵母菌培養(yǎng)基用過濾除菌法除菌D．血細胞計數(shù)板既可用于酵母菌的數(shù)量測定，也可用于細菌的數(shù)量測定【解析】通常細菌的生長速度比酵母菌快，酵母菌菌落比細菌大而厚，B錯誤；培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，易被雜菌污染，酵母菌和細菌培養(yǎng)基都可以用高壓蒸汽滅菌法滅菌，而過濾除菌法是用物理阻留的方法將液體或空氣中的細菌除去，一般用于不耐高溫的物體的除菌，C錯誤；血細胞計數(shù)板可用于酵母菌的數(shù)量測定，細菌計數(shù)板可用于細菌等較小的細胞的計數(shù)，D錯誤。考點3微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)知識1微生物的選擇培養(yǎng)1.選擇培養(yǎng)的作用原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。2.稀釋涂布平板法操作過程取樣，將10g土樣加入盛有90mL無菌水的瓶中，搖勻，取1_mL上清液加入盛有9_mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。取最后一支試管中菌液0.1_mL滴加到培養(yǎng)基表面進行涂布。如下圖所示：(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。(2)涂布平板時：①涂布器用體積分數(shù)為70%的酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上灼燒；②不要將過熱的涂布器放入盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精燈與培養(yǎng)皿距離要合適，移液管槍頭不要接觸任何物體；④培養(yǎng)皿蓋不能完全打開，應只掀開一條縫。概念辨析分離純化菌種的兩種方法的比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法接種用具接種環(huán)涂布器分離結(jié)果單菌落的獲得單菌落從后劃線的區(qū)域挑取只有達到合適的稀釋度才能得到單菌落應用都會在培養(yǎng)基表面形成單菌落，達到分離純化微生物的目的；都可用于觀察菌落特征不能用于微生物的計數(shù)可對微生物進行計數(shù)其他共同點都要用到固體培養(yǎng)基；都需進行無菌操作；都可以在培養(yǎng)基上形成由單個微生物繁殖而來的純培養(yǎng)物——單菌落知識2微生物的計數(shù)1.測定微生物數(shù)量常用的方法方法間接計數(shù)法(稀釋涂布平板法、活菌計數(shù)法)直接計數(shù)法(顯微計數(shù)法)原理當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌利用特定的血細胞計數(shù)板(常用于較大的真核細胞，如酵母菌、霉菌孢子等，及某些較大的原核細胞)或細菌計數(shù)板(常用于相對較小的細菌等)，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量公式每克樣品中的菌體數(shù)：C×M÷VC：某一稀釋度幾次重復培養(yǎng)后的菌落平均數(shù)；M：稀釋倍數(shù)；V：涂布所用的稀釋液體積數(shù)(mL)每毫升原液所含細菌數(shù)：①每小格平均細菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)；②5(或4)個中方格的菌體數(shù)×5(或4)×10000×稀釋倍數(shù)結(jié)果比實際值偏小，因為當兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落(因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示)比實際值偏大，因為此法不能區(qū)分死細胞和活細胞注：稀釋涂布平板法計數(shù)中，為了使結(jié)果接近真實值，應設置三個或三個以上的平板(平行重復原則，增強實驗的說服力和準確性)，計算菌落平均數(shù)。另外，為了保證結(jié)果的準確，要求選擇同一稀釋度的平板菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。深度指津(1)微生物的計數(shù)方法非常多樣，應根據(jù)實際情況選擇合適的方法。涉及一些新的微生物計數(shù)方法，應根據(jù)具體情境，弄清其背后的原理。列舉兩個其他計數(shù)方法：①比濁法：隨著微生物的繁殖，液體培養(yǎng)基的渾濁程度會增加，因此可根據(jù)液體培養(yǎng)物的渾濁程度來估計微生物的數(shù)量，通常使用分光光度計測定光的透過率。②實時熒光定量PCR(qPCR)：通過定量PCR技術(shù)檢測特定微生物的DNA，可以精確測定微生物的數(shù)量。(2)稀釋涂布平板法用于微生物分離時不需要平板上菌落數(shù)在30～300；稀釋涂布平板法用于篩選基因工程轉(zhuǎn)化的細胞時，不一定需要再次平板劃線處理，可以直接PCR擴增以獲得陽性克隆的細胞；如果是稀釋涂布平板法用于純化微生物時，才需要多次平板劃線操作，以減少一個菌落是由2個或多個連在一起的微生物細胞繁殖而來的概率。2.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)(1)分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機物的過程中起到催化作用。CO(NH2)2＋H2Oeq\o(→,\s\up9(脲酶))CO2＋2NH3(2)分離方法：利用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)。(3)鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變紅說明菌落中的菌體為分解尿素的細菌。(4)統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)一般用稀釋涂布平板法。(5)實驗流程：土壤取樣→樣品的稀釋→微生物的培養(yǎng)與觀察→細菌的計數(shù)。概念辨析選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基的比較比較項目選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基原理添加某物質(zhì)或控制溫度或pH等允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品，產(chǎn)生特定的顏色或其他變化用途從眾多微生物中分離所需微生物(目的菌)鑒別不同種類的微生物舉例①加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌；②以尿素為唯一氮源，分離出分解尿素的微生物①以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑；②利用剛果紅染色法篩選分解纖維素的微生物(出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈)；③用伊紅—亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌(菌落呈深紫色，并有金屬光澤)注：鑒定微生物除了利用表中的鑒別培養(yǎng)基進行如指示劑鑒別、染色鑒別等方法，還可以根據(jù)菌落特征鑒別，即根據(jù)微生物在固體平板培養(yǎng)基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別。思辨小練判斷下列說法的正誤：(1)選擇培養(yǎng)基可以鑒定某種微生物的種類。(×)(2)(2023·山東卷T15D)利用以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物。(√)(3)“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”實驗中，土壤取樣時需要對紙袋和鐵鏟都預先滅菌。(√)(4)分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉(zhuǎn)化為氨，使得培養(yǎng)基的酸堿度降低。(×)(5)統(tǒng)計菌落數(shù)目時，統(tǒng)計的菌落數(shù)就是活菌的實際數(shù)目。(×)(6)細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，大部分距離地表3～8cm，因此取樣時一般要鏟去表層土壤。(√)(7)剛果紅可以與纖維素形成透明復合物，所以可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。(×)典題說法考向1微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)例1(2025·鎮(zhèn)江期初)聚乙烯醇(PVA)是化工污水中的一種難以降解的大分子有機物，PVA分解菌能產(chǎn)生PVA酶對其進行降解。下列關(guān)于PVA分解菌的篩選與培養(yǎng)的敘述，正確的是(D)A．土壤樣品應加到以PVA為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基中培養(yǎng)B．直接選擇水解圈直徑最大的菌株以利于快速獲得高效降解菌C．利用平板劃線法進行計數(shù)得出的微生物數(shù)量常比實際值小D．可利用不含PVA的培養(yǎng)基對篩選出的PVA分解菌進行擴大培養(yǎng)【解析】以PVA為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上只有能分解PVA的微生物能生長，其他微生物一般不能生長，因此采用以PVA為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基(而非鑒別培養(yǎng)基)篩選能降解PVA的細菌，A錯誤；菌落直徑/水解圈直徑的值越小，說明細菌降解PVA的能力越強，B錯誤；平板劃線法可用于獲得單菌落，但不能用于微生物的計數(shù)，C錯誤；擴大培養(yǎng)是對篩選后的菌種進行的培養(yǎng)，故對篩選出的PVA分解菌進行擴大培養(yǎng)時，所用培養(yǎng)基可不含PVA，D正確?？枷?微生物培養(yǎng)的應用例2(2025·南通期初)水體中氮素的去除對清潔水體有重要意義，異養(yǎng)硝化細菌能將硝酸銨轉(zhuǎn)化為氨，科研工作者從污水中篩選出異養(yǎng)硝化細菌ZW2和ZW5菌株，并研究其轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果如圖。相關(guān)敘述正確的是(B)A．進行ZW2和ZW5菌株初步篩選時，采用平板劃線法接種并計數(shù)B．初步篩選并培養(yǎng)后，一般依據(jù)菌落形狀等特征來區(qū)分不同的微生物C．分離ZW2和ZW5菌株時，培養(yǎng)基中需要添加剛果紅作為指示劑D．ZW2菌株的轉(zhuǎn)化能力較ZW5強，可以擴大化培養(yǎng)用于水體凈化【解析】平板劃線法不能進行菌種計數(shù)，A錯誤；可根據(jù)菌落的形狀、大小和顏色等方面的特征區(qū)別不同微生物，B正確；異養(yǎng)硝化細菌能將硝酸銨轉(zhuǎn)化為氨，分離ZW2和ZW5菌株時，培養(yǎng)基中需要添加酚紅作為指示劑，C錯誤；ZW5菌落周圍的紅色圈更大，說明其降解硝酸銨產(chǎn)生氨的能力更強，所以要得到目標菌，應該選擇ZW5菌株進一步擴大培養(yǎng)，D錯誤。深度指津選擇培養(yǎng)基——4種常見制備方法或?qū)嵗涮拙毜谑粏卧锛夹g(shù)與工程第52講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用一、單項選擇題1.(2025·淮安一聯(lián))微生物需要從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)并通過代謝來維持正常的生長和繁殖，下列與此有關(guān)的說法，正確的是(A)A．有的氮源可以作為細菌的能源物質(zhì)B．加入酚紅指示劑的培養(yǎng)基，可以篩選大腸桿菌C．大腸桿菌與分解尿素的細菌所利用的氮源相同D．以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上長出的一定是能分解尿素的細菌【解析】有的氮源可以作為細菌的能源物質(zhì)，如有機氮也可以作為細菌的能源物質(zhì)，A正確；加入酚紅指示劑的培養(yǎng)基可以鑒別尿素分解菌，B錯誤；分解尿素的細菌利用的氮源是尿素，大腸桿菌不能利用尿素，C錯誤；以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上長出的可能是固氮菌，它可以利用空氣中游離的N2作為氮源，D錯誤。2.下列關(guān)于微生物實驗操作的敘述，錯誤的是(A)A．培養(yǎng)微生物的試劑和器具都要進行高壓蒸汽滅菌B．接種前后，接種環(huán)都要在酒精燈火焰上進行灼燒C．接種后的培養(yǎng)皿要倒置，以防培養(yǎng)污染D．菌種分離和菌落計數(shù)都可以使用固體培養(yǎng)基【解析】接種室、接種箱等常用紫外線消毒法處理，接種環(huán)等常用灼燒滅菌法處理，吸管、培養(yǎng)皿等常用干熱滅菌法處理，培養(yǎng)基及多種器材用高壓蒸汽滅菌法處理。3.人們在研究、利用微生物時，需用無菌技術(shù)培養(yǎng)獲取純種微生物，并對其進行計數(shù)或保存。下列有關(guān)敘述正確的是(A)A．用稀釋涂布平板法進行微生物計數(shù)時，結(jié)果往往比實際值低B．培養(yǎng)基配制過程是計算、稱量、溶化、調(diào)pH、定容、滅菌、倒平板C．高壓蒸汽滅菌后，打開排氣閥，待壓力表指針降至“0”后開蓋取物D．獲得純種微生物后，利用涂布平板法接種至斜面培養(yǎng)基上，進行低溫保存【解析】用稀釋涂布平板法進行微生物計數(shù)時，由于兩個或多個細胞常形成一個菌落，因此結(jié)果往往比實際值低，A正確；培養(yǎng)基配制過程先定容，后調(diào)pH，B錯誤；滅菌后，等壓力表指針降至“0”時，打開排氣閥排氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品，C錯誤；獲得純種微生物后，利用劃線分離法接種至斜面培養(yǎng)基上，進行低溫保存，D錯誤。4.(2024·南京調(diào)研)為純化菌種，在鑒別培養(yǎng)基上劃線接種纖維素降解細菌，培養(yǎng)結(jié)果如下圖所示。下列敘述正確的是(B)A．圖示采用的接種方法為稀釋涂布平板法B．圖中Ⅰ、Ⅱ區(qū)的細菌數(shù)量均太多，應從Ⅲ區(qū)挑取單菌落C．該實驗結(jié)果因單菌落太多，不能達到菌種純化的目的D．菌落周圍的纖維素被降解后，可被剛果紅染成紅色【解析】據(jù)圖可知，圖中的微生物接種方法是平板劃線法，A錯誤；隨著劃線次數(shù)增加，菌落數(shù)目減少，該實驗Ⅲ區(qū)有單菌落，可以達到菌種純化目的，C錯誤；剛果紅與纖維素可形成紅色復合物，纖維素被降解后，會形成誘明圈，D錯誤。5.(2025·如皋期初)瘤胃是牛、羊等反芻動物具有的特殊的器官，其中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡。如圖表示從牛的瘤胃中分離和鑒定纖維素分解菌。下列敘述正確的是(D)A．牛體內(nèi)提取的瘤胃液不能使用干熱滅菌，應使用濕熱滅菌B．甲和乙應使用纖維素為唯一碳源的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．乙和丁的接種方法均可分離純化并進行計數(shù)D．實驗中培養(yǎng)基表面加入一層無菌石蠟能促進目的菌生長【解析】牛體內(nèi)提取的瘤胃液含有微生物，不能滅菌，A錯誤；甲和乙應使用纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基，B錯誤；乙的接種方法是平板劃線法，可以分離，但不可以計數(shù)，丁的接種方法是稀釋涂布法，可分離純化并進行計數(shù)，C錯誤；牛胃中的纖維素分解菌是厭氧微生物，實驗中培養(yǎng)基表面加入一層無菌石蠟能促進目的菌生長，D正確。6.(2024·南通一模)南通某中學興趣小組從垃圾堆放點的土壤中分離出一株分解柴油的芽孢桿菌。相關(guān)敘述正確的是(C)A.配制培養(yǎng)基時應以柴油為唯一氮源，并加入瓊脂B．配制好的培養(yǎng)基應先分裝至培養(yǎng)皿，再用濕熱滅菌法滅菌C．土壤樣液可先進行富集培養(yǎng)，再進行涂布篩選D．選擇平板中的菌落數(shù)必須在30～300之間【解析】配制培養(yǎng)基時應以柴油作為唯一碳源，柴油不含N，A錯誤；實驗室大量實驗需要較多的培養(yǎng)基，一般用大燒杯配制，然后分裝到錐形瓶或者試管內(nèi)滅菌，錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基滅菌后再倒平板，試管內(nèi)培養(yǎng)基滅菌后可以直接擱置斜面，B錯誤；用選擇培養(yǎng)基篩選時只要出現(xiàn)目標菌落即可，不要求菌落數(shù)在30～300個，只有當稀釋涂布平板法用于計數(shù)時，才要求菌落數(shù)在30～300，D錯誤。7.下列關(guān)于產(chǎn)纖維素酶菌分離及運用的敘述，不合理的是(A)A．篩選培養(yǎng)基中應含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生長營養(yǎng)B．可從富含腐殖質(zhì)的林下土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶菌C．在分離平板上長出的菌落需進一步確定其產(chǎn)纖維素酶的能力D．用產(chǎn)纖維素酶菌發(fā)酵處理農(nóng)作物秸稈可提高其飼用價值【解析】篩選產(chǎn)纖維素酶菌的培養(yǎng)基應以纖維素為唯一碳源，A不合理；木材、秸稈中富含纖維素，故可以從富含腐殖質(zhì)的林下土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶菌，B合理；用以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選纖維素分解菌后，為了確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行實驗進一步確定其產(chǎn)纖維素酶的能力，C合理；用產(chǎn)纖維素酶菌發(fā)酵處理農(nóng)作物秸稈，可以把纖維素分解成葡萄糖，提高飼用價值，D合理。8.(2025·海安期初)研究者用酸筍開發(fā)具有降低膽固醇功能的益生菌。先將酸筍發(fā)酵液接種到含有CaCO3的固體培養(yǎng)基上，篩選出乳酸菌，然后將乳酸菌接種到含有膽固醇的培養(yǎng)液中，篩選出能夠降解膽固醇的乳酸菌。相關(guān)敘述正確的是(D)A．腌制酸筍需要水封，為乳酸菌發(fā)酵提供無菌環(huán)境B．乳酸菌細胞內(nèi)能進行堿基互補配對的細胞器有線粒體和核糖體C．菌落直徑與溶鈣圈直徑比值大的菌落為目標菌落D．膽固醇既可以為乳酸菌的生長提供碳源，也可以參與動物細胞膜的組成【解析】乳酸菌是厭氧菌，腌制酸筍需要水封，為乳酸菌發(fā)酵提供無氧環(huán)境，A錯誤；乳酸菌是原核生物，沒有線粒體，有核糖體，B錯誤；乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸能與CaCO3發(fā)生反應，使CaCO3分解成可溶性物質(zhì)乳酸鈣和CO2，導致菌落周圍出現(xiàn)溶鈣圈，故溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值可代表微生物溶解CaCO3的能力，比值越大，微生物溶解CaCO3的能力越大，所以溶鈣圈直徑與菌落直徑比值大的菌落為目標菌落，C錯誤；膽固醇屬于脂質(zhì)，含有C、H、O，可以為微生物的生長提供碳源，膽固醇也是構(gòu)成動物細胞膜的重要成分，D正確。9.(2025·蘇州期初)某興趣小組為研究“使用公筷對餐后菜品細菌數(shù)量的影響”，將每道菜分為3盤，一盤取樣冷藏，一盤使用公筷，一盤不用公筷，實驗過程如下圖。下列相關(guān)操作或敘述正確的是(B)A．固體培養(yǎng)基X對菜品中的細菌有選擇性，屬于選擇培養(yǎng)基B．配制培養(yǎng)基X并在121℃、100kPa條件下處理15～30minC．在固體培養(yǎng)基X上可用平板劃線法或涂布法接種細菌D．根據(jù)菌落的特征可準確判斷細菌的種類【解析】固體培養(yǎng)基X沒有做任何處理，對菜品中的細菌沒有選擇性，A錯誤；對配制的培養(yǎng)基X需要采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌，即在121℃、100kPa條件下處理15～30min，B正確；據(jù)題意可知，在固體培養(yǎng)基X上接種后，還需要對微生物進行計數(shù)，因此只能用稀釋涂布平板法接種細菌，不能用平板劃線法，C錯誤；在一定的培養(yǎng)條件下，不同種微生物表現(xiàn)出各自穩(wěn)定的菌落特征，根據(jù)菌落的形狀、大小、顏色等特征，可以初步區(qū)分出不同種微生物，但不能準確判斷，D錯誤。二、多項選擇題10.(2025·海門一診)土壤中有些細菌可以利用原油中的多環(huán)芳烴。為篩選出能高效降解原油的菌株并投入除污，某研究小組進行了相關(guān)實驗。下列有關(guān)敘述錯誤的有(BCD)A．配制以多環(huán)芳烴為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)B．培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌結(jié)束后，待冷卻到室溫再倒平板C．平板劃線分離計數(shù)時，需控制每個平板30～300個菌落D．純培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿倒置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的搖床上培養(yǎng)【解析】培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌結(jié)束后，待冷卻到50℃左右再倒平板，B錯誤；平板劃線法可以分離，但不能計數(shù)，C錯誤；純培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿倒置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)