3.1重組DNA技術(shù)的基本工具道縣一中

陳文玥人教版（2019）高中生物選擇性必修32025年“湘道杯”大賽考向解讀課標(biāo)要求1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟。

考情分析基因工程的原理及技術(shù)2024山東T13，2024湖南T21，2024廣東T21，2023全國新課標(biāo)T6，2023山東T25，2022山東T25，2022廣東T22，2021全國乙T38，2021全國甲T38考查方式本部分的命題，以非選擇題為主，

屬于高考必考內(nèi)容，題目內(nèi)容多，難度往往較大。

試題情境新穎，大多來自大學(xué)教材和最新的論文文獻(xiàn)，核心素養(yǎng)側(cè)重對科學(xué)思維和科學(xué)探究的考查。

從社會中來大腸桿菌轉(zhuǎn)基因大腸桿菌人胰島素基因?qū)胍葝u素提取(外源基因)(受體細(xì)胞)問題探討1.能否直接將胰島素基因送入大腸桿菌細(xì)胞？2.怎樣才能將胰島素基因送入大腸桿菌細(xì)胞呢？糖尿病患者需要注射胰島素，從生物體中提取胰島素成本高、產(chǎn)量低。而制備相應(yīng)工程菌能夠更經(jīng)濟有效地解決這個問題。怎么把胰島素基因?qū)氪竽c桿菌呢？重組DNA技術(shù)的基本工具2、怎樣才能將胰島素基因送入大腸桿菌細(xì)胞呢？1、能否直接將游離的胰島素基因送入大腸桿菌細(xì)胞？

游離的DNA片段進入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。通常是利用質(zhì)粒作為載體，將基因送入細(xì)胞。胰島素基因5’3’3’5’擬核DNA質(zhì)粒細(xì)菌結(jié)構(gòu)示意圖1分子運輸車——載體重組DNA技術(shù)的基本工具外源基因質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)敫鞣N受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別動物病毒噬菌體將

送入

，在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進行

。

在基因工程中使用的載體包括

等。1.作用：

2.種類：

受體細(xì)胞大量復(fù)制總結(jié)資料1：科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，炭疽熱的真兇是炭疽桿菌中的一種毒性物質(zhì)，可以感染宿主細(xì)胞，引發(fā)動物或人生病。美國生物學(xué)家喬治·萊德伯格于1952年將其命名為“質(zhì)粒”，并發(fā)現(xiàn)其在細(xì)菌基因重組中的功能，萊德伯格因此斬獲了1958年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。資料分析質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒思考1：載體需要有哪些優(yōu)點？可插入、可轉(zhuǎn)移、能復(fù)制、能找到資料2：資料分析天然質(zhì)粒＞15kbPET-20b(+)3.7kb復(fù)制原點可插入標(biāo)記基因真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。如右圖所示的PET-20b資料3：研究發(fā)現(xiàn)噬菌體可以侵染細(xì)菌，科學(xué)家利用同位素標(biāo)記的噬菌體侵染流感嗜血桿菌，結(jié)果出乎意料在實驗步驟沒有差錯的情況下，沒有在細(xì)菌中檢測到放射性。后來，有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中有一種酶可以通過切斷病毒的DNA來限制病毒增殖，這種酶被稱為限制性內(nèi)切核酸酶。資料分析如何對質(zhì)粒進行改造？

如何插入胰島素基因？資料4：EcoRⅠ是一種限制性內(nèi)切核酸酶，來自大腸桿菌(E.coli)的R型菌株，能專一識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。3′3′5′5′回文序列體現(xiàn)出限制酶的什么特性？酶的專一性學(xué)生活動一根據(jù)所提供的質(zhì)粒識別序列，請你自由選擇合適的限制酶（剪刀）將質(zhì)粒剪出缺口。注：EcoRⅠ(G↓AATTC)、BamHⅠ(G↓GATCC)、SmaⅠ(CCC↓GGG)、BclⅠ(T↓GATCA)、學(xué)生活動一課堂實況點評：

以EcoRⅠ(G↓AATTC)為例，出現(xiàn)以下兩種切法，請判斷正誤并說明理由根據(jù)所提供的質(zhì)粒識別序列，請你自由選擇合適的限制酶（剪刀）將質(zhì)粒剪出缺口。錯誤原因：下面那條鏈沒有按照EcoRⅠ的識別位點進行切割2分子手術(shù)刀——限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）重組DNA技術(shù)的基本工具①實例1——EcoRⅠ限制酶切割*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端②實例2——SmaⅠ限制酶切割

*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端總結(jié)學(xué)生活動二選擇合適的限制酶（剪刀）將DNA中的胰島素基因剪切出來。注：EcoRⅠ(G↓AATTC)、BamHⅠ(G↓GATCC)、SmaⅠ(CCC↓GGG)、BclⅠ(T↓GATCA)、胰島素基因思考2：從人DNA中切取胰島素基因，應(yīng)如何選擇酶切位點？質(zhì)粒學(xué)生活動二課堂實況點評：思考2：從人DNA中切取胰島素基因，應(yīng)如何選擇酶切位點？實例1如圖所示，胰島素基因能連接到質(zhì)粒中嗎？切割目的基因和質(zhì)粒后得到的黏性末端之間要能夠

。

堿基互補配對SmaⅠBclⅠEcoRⅠ學(xué)生活動二課堂實況點評：思考2：從人DNA中切取胰島素基因，應(yīng)如何選擇酶切位點？1.如左圖所示，質(zhì)粒與目的基因均用EcoRⅠ切割，目的基因能連接到質(zhì)粒中嗎？2.在轉(zhuǎn)錄方向確定的情況下，目的基因會發(fā)生右圖所示的反向連接，此時會有什么問題呢？轉(zhuǎn)錄的模板鏈會改變，無法正確產(chǎn)生胰島素實例2質(zhì)粒目的基因?qū)W生活動二思考3：使用單酶切法，會出現(xiàn)目的基因的反向連接和自身環(huán)化問題，如何有效避免此類情況發(fā)生？課堂實況點評：實例3SmaⅠEcoRⅠEcoRⅠBclⅠ采用雙酶切法

切割目的基因得到的兩側(cè)末端不同，且與質(zhì)粒兩端的黏性末端互補配對。復(fù)制原點胰島素基因標(biāo)記基因如何將人胰島素基因和質(zhì)粒連接自主學(xué)習(xí)：閱讀P72，小組討論找出DNA連接酶的作用、種類、來源、區(qū)別?資料分析3分子縫合針——DNA連接酶將

連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的

。

1、作用：注意：不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）兩個DNA片段磷酸二酯鍵總結(jié)來源作用差別2、種類：E.coliDNA連接酶連接平末端時效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。E.coli

DNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體學(xué)生活動三將切割好的質(zhì)粒和胰島素基因進行重組，各小組派代表上臺展示。胰島素基因質(zhì)?？萍继剿髦?958年，質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎)1978年，限制性內(nèi)切核酸酶假說(諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎)1980年，基因工程創(chuàng)始人Berg(諾貝爾化學(xué)獎)1993年P(guān)CR技術(shù)(諾貝爾化學(xué)獎)2020年，基因編輯技術(shù)(諾貝爾化學(xué)獎)基因工程一直在進步！E.coliDNA連接酶③

有一個至多個限制酶切割位點質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒作用部位：種類DNA連接酶切開DNA分子的磷酸二酯鍵主要存在于原核生物中具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對受體細(xì)胞無害②

能自我復(fù)制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標(biāo)記基因運載工具條件種類：磷酸二酯鍵限制酶作用部位：來源：特點：作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端課堂小結(jié)：重組DNA技術(shù)的基本工具一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是（

）A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術(shù)中,將外源基因送入受體細(xì)胞的載體可以是

（

）A.大腸桿菌的質(zhì)粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用來識別特定基因的DNA探針C

A

磷酸二酯鍵DNA聚合酶的作用T4DNA連接酶可以連接互補的黏性末端，又可連接平末端課堂檢測3.