不同移植途徑下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)的影響探究一、引言1.1研究背景創(chuàng)傷性腦損傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是指由于外部暴力作用于頭部而引起的腦組織損傷，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。隨著工業(yè)化和現(xiàn)代化的快速發(fā)展，TBI的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年中國(guó)新增TBI患者超過(guò)300萬(wàn)例，且近二十年來(lái)患者數(shù)量持續(xù)增加。在美國(guó)，每年約有280萬(wàn)人受到TBI的影響。TBI不僅給患者帶來(lái)了嚴(yán)重的身體和心理創(chuàng)傷，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。TBI的損傷機(jī)制極為復(fù)雜，包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是指外力直接作用于腦組織，導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等的直接損傷和死亡，這種損傷往往在瞬間發(fā)生且難以逆轉(zhuǎn)。而繼發(fā)性損傷則是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、興奮性毒性、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞和腦水腫等。這些過(guò)程相互作用，進(jìn)一步加重了腦組織的損傷和神經(jīng)功能的缺損，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知障礙、感覺障礙、言語(yǔ)障礙、癲癇發(fā)作等多種臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。目前，TBI的常規(guī)治療方法主要包括急救處理、藥物治療和手術(shù)治療。急救處理旨在維持患者的生命體征穩(wěn)定，如保持呼吸道通暢、控制出血、降低顱內(nèi)壓等。藥物治療主要使用神經(jīng)保護(hù)劑、脫水劑、抗癲癇藥物等，以減輕繼發(fā)性損傷和緩解癥狀，但這些藥物的療效有限，且存在一定的副作用。手術(shù)治療主要用于清除顱內(nèi)血腫、減壓等，對(duì)于一些嚴(yán)重的TBI患者具有重要意義，但手術(shù)本身也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥?？傮w而言，現(xiàn)有的治療方法難以有效促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，許多TBI患者仍會(huì)遺留不同程度的后遺癥，給患者及其家庭帶來(lái)了巨大的痛苦。近年來(lái)，干細(xì)胞治療作為一種新興的治療手段，為TBI的治療帶來(lái)了新的希望。干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，能夠分化為多種細(xì)胞類型，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，并且能夠分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，改善損傷局部的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）是干細(xì)胞的一種，因其來(lái)源廣泛、易于獲取、免疫原性低、具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)等特性，在TBI的治療研究中受到了廣泛關(guān)注。大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明，BMSCs移植能夠改善TBI動(dòng)物模型和患者的神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)，展現(xiàn)出了良好的治療效果和應(yīng)用前景。然而，BMSCs移植治療TBI的最佳途徑尚未明確。不同的移植途徑可能會(huì)影響B(tài)MSCs的歸巢效率、存活時(shí)間、分化能力以及對(duì)神經(jīng)功能的改善效果。目前常用的移植途徑包括靜脈注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、顱內(nèi)注射和鼻腔給藥等，每種途徑都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。靜脈注射操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小，但BMSCs可能會(huì)在肺部等器官被截留，難以大量到達(dá)損傷部位；動(dòng)脈內(nèi)注射可以使BMSCs更直接地到達(dá)腦部，但存在一定的栓塞風(fēng)險(xiǎn)；顱內(nèi)注射能夠?qū)MSCs直接輸送到損傷部位，但其屬于有創(chuàng)操作，可能會(huì)引發(fā)感染、出血等并發(fā)癥；鼻腔給藥是一種非侵入性的方法，BMSCs可以通過(guò)嗅覺通路直接進(jìn)入大腦，避免了血腦屏障的阻礙，但給藥劑量和分布難以精確控制。因此，深入研究不同移植途徑對(duì)BMSCs治療TBI效果的影響，尋找最佳的移植途徑，對(duì)于提高BMSCs治療TBI的療效具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）不同移植途徑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響，通過(guò)對(duì)比分析不同移植途徑下BMSCs的歸巢效率、存活時(shí)間、分化能力以及對(duì)神經(jīng)功能的改善效果，為臨床治療TBI提供更優(yōu)化的細(xì)胞移植策略。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問題：不同移植途徑下BMSCs在TBI大鼠體內(nèi)的歸巢和分布差異：靜脈注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、顱內(nèi)注射和鼻腔給藥等不同移植途徑，BMSCs如何在體內(nèi)遷移并歸巢至損傷腦組織？各途徑下BMSCs在腦內(nèi)的分布模式和數(shù)量有何差異？這些差異對(duì)后續(xù)治療效果有何影響？不同移植途徑對(duì)BMSCs存活和分化的影響：在TBI大鼠復(fù)雜的病理微環(huán)境中，不同移植途徑是否會(huì)影響B(tài)MSCs的存活時(shí)間和存活數(shù)量？BMSCs在不同移植途徑下向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞類型分化的能力是否存在差異？這些差異與神經(jīng)再生和功能恢復(fù)之間存在怎樣的關(guān)聯(lián)？不同移植途徑對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的具體作用：通過(guò)行為學(xué)測(cè)試，如Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等，評(píng)估不同移植途徑下BMSCs對(duì)TBI大鼠運(yùn)動(dòng)功能、認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)記憶能力等神經(jīng)功能的改善程度。從細(xì)胞和分子層面，探究不同移植途徑如何影響神經(jīng)再生相關(guān)的細(xì)胞增殖、分化、遷移以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)等過(guò)程，揭示其促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的潛在機(jī)制。綜合評(píng)估不同移植途徑的安全性和有效性：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察不同移植途徑是否會(huì)引發(fā)感染、出血、栓塞等并發(fā)癥，評(píng)估其安全性。結(jié)合BMSCs的歸巢、存活、分化情況以及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，綜合評(píng)價(jià)不同移植途徑在治療TBI中的有效性，篩選出相對(duì)最佳的移植途徑。1.3研究意義本研究通過(guò)探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）不同移植途徑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響，具有重要的理論與實(shí)踐意義。在理論層面，有助于深入理解BMSCs治療TBI的作用機(jī)制。不同移植途徑下，BMSCs歸巢、存活與分化能力的差異研究，能為干細(xì)胞治療領(lǐng)域補(bǔ)充關(guān)鍵數(shù)據(jù)。目前，關(guān)于BMSCs在體內(nèi)如何遷移至損傷部位并發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全明晰，本研究通過(guò)分析不同途徑下BMSCs在TBI大鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，可從細(xì)胞和分子水平揭示其參與神經(jīng)再生和修復(fù)的具體過(guò)程，進(jìn)一步完善干細(xì)胞治療TBI的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有助于開發(fā)更有效的治療策略。從實(shí)踐角度出發(fā)，本研究將為TBI的臨床治療提供重要的參考依據(jù)。TBI患者數(shù)量眾多，現(xiàn)有治療手段難以滿足患者需求，BMSCs移植治療為TBI患者帶來(lái)新希望，但移植途徑的不確定性限制了其臨床應(yīng)用。通過(guò)本研究對(duì)比不同移植途徑的安全性和有效性，篩選出最佳移植途徑，可為臨床醫(yī)生提供更科學(xué)的治療方案選擇，提高治療效果，減少并發(fā)癥，降低患者痛苦和醫(yī)療成本，推動(dòng)BMSCs移植治療TBI從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，最終改善TBI患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重大的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）概述2.1.1TBI的定義與分類創(chuàng)傷性腦損傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是指由外部暴力作用于頭部而引起的腦組織損傷，國(guó)際上對(duì)TBI的定義主要基于外力作用導(dǎo)致的腦部創(chuàng)傷這一核心要素。根據(jù)損傷程度，TBI可分為輕型、中型和重型。輕型TBI通常表現(xiàn)為短暫的意識(shí)喪失或意識(shí)障礙，持續(xù)時(shí)間一般不超過(guò)30分鐘，可能伴有頭痛、頭暈、惡心、嘔吐等癥狀，神經(jīng)系統(tǒng)檢查及影像學(xué)檢查可能無(wú)明顯異常，或僅有輕微的腦震蕩表現(xiàn)。中型TBI患者的昏迷時(shí)間通常在30分鐘至6小時(shí)之間，可出現(xiàn)明顯的頭痛、嘔吐、癲癇發(fā)作等癥狀，影像學(xué)檢查可能顯示腦挫裂傷、顱骨骨折等損傷。重型TBI患者的昏迷時(shí)間超過(guò)6小時(shí)，常伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如肢體癱瘓、失語(yǔ)、瞳孔改變等，影像學(xué)檢查可見廣泛的腦挫裂傷、顱內(nèi)血腫、腦疝形成等嚴(yán)重病變。從損傷類型來(lái)看，TBI可分為閉合性損傷和穿透性損傷。閉合性損傷是指頭部受到外力撞擊后，頭皮、顱骨保持完整，但腦組織受到損傷，常見的類型包括腦震蕩、腦挫裂傷、彌漫性軸索損傷等。腦震蕩是最輕的腦損傷類型，傷后立即出現(xiàn)短暫的意識(shí)喪失，一般持續(xù)數(shù)分鐘至十余分鐘，不超過(guò)半小時(shí)，意識(shí)恢復(fù)后對(duì)受傷當(dāng)時(shí)和傷前近期的情況不能回憶，即逆行性遺忘。腦挫裂傷是指腦組織的實(shí)質(zhì)性損傷，可導(dǎo)致局部腦組織的出血、壞死，患者可出現(xiàn)不同程度的意識(shí)障礙、神經(jīng)功能缺損等癥狀。彌漫性軸索損傷是頭部遭受加速性旋轉(zhuǎn)外力作用時(shí)，以剪應(yīng)力造成的腦內(nèi)神經(jīng)軸索腫脹斷裂為主要特征的損傷，常導(dǎo)致患者長(zhǎng)期昏迷和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。穿透性損傷則是指頭部受到銳器或火器等穿透性物體的損傷，頭皮、顱骨和腦組織均被穿透，可導(dǎo)致嚴(yán)重的出血、感染和神經(jīng)功能損傷。此外，根據(jù)損傷部位的不同，TBI還可分為頭皮損傷、顱骨骨折和腦損傷。頭皮損傷包括頭皮血腫、頭皮裂傷、頭皮撕脫傷等；顱骨骨折按部位可分為顱蓋骨折與顱底骨折，按骨折形態(tài)可分為線形骨折與凹陷性骨折，按骨折與外界是否連通可分為開放性骨折與閉合性骨折；腦損傷除了上述提到的腦震蕩、腦挫裂傷、彌漫性軸索損傷外，還包括原發(fā)性腦干損傷、顱內(nèi)出血等。原發(fā)性腦干損傷是臨床上較為常見的一種腦損傷類型，可單獨(dú)出現(xiàn)，也可與其他部位腦挫裂傷同時(shí)存在，多數(shù)情況下是廣泛性腦挫裂傷的一部分，腦干表面挫裂傷和腦干內(nèi)點(diǎn)狀或片狀出血是其主要病理表現(xiàn)。顱內(nèi)出血按血腫部位可分為硬膜外血腫、硬膜下血腫和腦內(nèi)血腫，顱內(nèi)出血多因顱內(nèi)壓增高形成腦疝，如不及時(shí)處理，可危及生命。不同類型和程度的TBI會(huì)導(dǎo)致不同的病理生理變化和臨床癥狀，對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生重要影響。2.1.2TBI的發(fā)病機(jī)制TBI的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段。原發(fā)性損傷是指外力直接作用于腦組織，導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等的直接損傷和死亡。當(dāng)頭部受到外力撞擊時(shí)，顱骨內(nèi)的腦組織會(huì)因?yàn)閼T性而與顱骨發(fā)生碰撞，造成腦組織的挫傷、裂傷。同時(shí)，腦部血管也可能因?yàn)橥饬Χ屏殉鲅l(fā)顱內(nèi)血腫。此外，高速旋轉(zhuǎn)或加速-減速運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力還可導(dǎo)致神經(jīng)軸索的損傷，引起彌漫性軸索損傷。這些原發(fā)性損傷往往在瞬間發(fā)生，且損傷程度與外力的大小、方向、作用時(shí)間等因素密切相關(guān)，一旦發(fā)生，難以逆轉(zhuǎn)。繼發(fā)性損傷則是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，進(jìn)一步加重腦組織的損傷和神經(jīng)功能的缺損。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的重要組成部分。原發(fā)性損傷導(dǎo)致腦組織受損后，會(huì)激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，大量炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等聚集到損傷部位。這些炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子一方面可以直接損傷神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，另一方面還可通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路，引發(fā)氧化應(yīng)激、興奮性毒性等一系列病理過(guò)程，進(jìn)一步加重腦組織的損傷。例如，TNF-α可以上調(diào)一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)，導(dǎo)致一氧化氮（NO）的大量產(chǎn)生，NO與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化亞硝基陰離子，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死。氧化應(yīng)激也是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TBI后，腦組織內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等。這些自由基具有高度的活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化修飾和DNA損傷。細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)；蛋白質(zhì)氧化修飾會(huì)改變蛋白質(zhì)的活性和功能；DNA損傷則可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。此外，氧化應(yīng)激還可激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。興奮性毒性是指腦損傷后，細(xì)胞外興奮性氨基酸（如谷氨酸）大量釋放，過(guò)度激活谷氨酸受體，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)鈣離子超載，進(jìn)而引發(fā)一系列病理過(guò)程，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。正常情況下，細(xì)胞外谷氨酸的濃度受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持神經(jīng)元的正常功能。但在TBI后，由于細(xì)胞膜的損傷和轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙，谷氨酸的攝取減少，釋放增加，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度急劇升高。高濃度的谷氨酸與N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體結(jié)合，使這些受體過(guò)度激活。NMDA受體的激活導(dǎo)致鈣離子大量?jī)?nèi)流，而AMPA受體的激活則導(dǎo)致鈉離子內(nèi)流和鉀離子外流，進(jìn)一步加重細(xì)胞內(nèi)的離子失衡。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可激活一系列酶類，如蛋白酶、核酸酶、磷脂酶等，這些酶類的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、DNA斷裂、細(xì)胞膜磷脂降解等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。細(xì)胞凋亡也是TBI繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制之一。TBI后，多種因素如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性等均可激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，具有特征性的形態(tài)學(xué)和生化改變，如細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝聚、DNA片段化等。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要包括內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑。內(nèi)源性線粒體途徑是指在損傷因素的作用下，線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9（caspase-9），進(jìn)而激活下游的caspase-3等執(zhí)行凋亡的蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。外源性死亡受體途徑是指死亡配體如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）、Fas配體（FasL）等與相應(yīng)的死亡受體如TRAIL受體、Fas受體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase-3等執(zhí)行凋亡的蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，TBI還可導(dǎo)致血腦屏障破壞和腦水腫。血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足等組成的一種特殊的結(jié)構(gòu)，能夠限制血液中的有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。TBI后，由于炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素的作用，血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，導(dǎo)致其通透性增加。血液中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、免疫細(xì)胞等進(jìn)入腦組織，引起腦水腫和炎癥反應(yīng)的加重。腦水腫是指腦組織內(nèi)水分增多，導(dǎo)致腦體積增大和顱內(nèi)壓升高。腦水腫可進(jìn)一步壓迫腦組織，導(dǎo)致腦灌注不足，加重腦組織的缺血缺氧損傷，形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。這些繼發(fā)性損傷過(guò)程相互作用，共同導(dǎo)致了TBI患者腦組織的進(jìn)一步損傷和神經(jīng)功能的惡化。2.1.3TBI對(duì)神經(jīng)功能的影響TBI會(huì)導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)功能缺損，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)功能障礙是TBI常見的表現(xiàn)之一。患者可能出現(xiàn)肢體癱瘓、肌肉無(wú)力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降等癥狀。這是由于TBI損傷了大腦的運(yùn)動(dòng)中樞、錐體束或其他與運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)相關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)受阻，肌肉無(wú)法正常收縮和舒張。例如，腦挫裂傷或顱內(nèi)血腫壓迫運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)，可導(dǎo)致對(duì)側(cè)肢體的偏癱；彌漫性軸索損傷累及皮質(zhì)脊髓束，可引起肢體的運(yùn)動(dòng)障礙和肌張力異常。運(yùn)動(dòng)功能障礙會(huì)使患者的日常生活活動(dòng)能力受限，如行走、穿衣、進(jìn)食等，給患者的生活帶來(lái)極大的不便。認(rèn)知功能障礙也是TBI的常見后遺癥?；颊呖赡艹霈F(xiàn)記憶力減退、注意力不集中、思維遲緩、學(xué)習(xí)能力下降等癥狀。這是因?yàn)門BI損傷了大腦的顳葉、額葉、海馬等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域。顳葉的損傷可導(dǎo)致記憶障礙，尤其是近期記憶受損較為明顯；額葉的損傷會(huì)影響注意力、執(zhí)行功能和思維能力；海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，其損傷會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。認(rèn)知功能障礙會(huì)對(duì)患者的工作、學(xué)習(xí)和社交生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響，患者可能難以完成復(fù)雜的任務(wù)，無(wú)法集中精力學(xué)習(xí)新知識(shí)，與他人的溝通和交流也會(huì)出現(xiàn)困難。感覺功能障礙在TBI患者中也較為常見。患者可能出現(xiàn)觸覺、痛覺、溫度覺等感覺減退或異常，還可能出現(xiàn)視覺、聽覺障礙。例如，腦損傷累及感覺皮質(zhì)或感覺傳導(dǎo)通路，可導(dǎo)致對(duì)側(cè)肢體的感覺減退或缺失；損傷視覺中樞或視神經(jīng)，可引起視力下降、視野缺損等視覺障礙；損傷聽覺中樞或聽神經(jīng)，可導(dǎo)致聽力減退或耳鳴等聽覺障礙。感覺功能障礙會(huì)影響患者對(duì)周圍環(huán)境的感知和反應(yīng)能力，增加患者發(fā)生意外的風(fēng)險(xiǎn)。除了上述運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和感覺功能障礙外，TBI還可能導(dǎo)致言語(yǔ)障礙、癲癇發(fā)作、情緒和行為異常等。言語(yǔ)障礙包括表達(dá)性失語(yǔ)、接受性失語(yǔ)、混合性失語(yǔ)等，患者可能無(wú)法準(zhǔn)確表達(dá)自己的想法或理解他人的語(yǔ)言。癲癇發(fā)作是由于TBI導(dǎo)致大腦神經(jīng)元異常放電引起的，可表現(xiàn)為全身性發(fā)作或局灶性發(fā)作，頻繁的癲癇發(fā)作會(huì)進(jìn)一步加重腦組織的損傷。情緒和行為異常在TBI患者中也較為常見，患者可能出現(xiàn)焦慮、抑郁、易怒、攻擊性增強(qiáng)等情緒問題，以及行為失控、人格改變等行為異常。這些情緒和行為問題會(huì)嚴(yán)重影響患者的心理健康和社會(huì)適應(yīng)能力，增加患者和家庭的心理負(fù)擔(dān)。TBI對(duì)神經(jīng)功能的影響是多方面的，不同患者的表現(xiàn)可能有所差異，且這些神經(jīng)功能障礙往往會(huì)相互影響，進(jìn)一步加重患者的病情和生活負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)于TBI患者，及時(shí)有效的治療和康復(fù)訓(xùn)練對(duì)于改善神經(jīng)功能、提高生活質(zhì)量至關(guān)重要。2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）概述2.2.1BMSCs的來(lái)源與特性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）主要來(lái)源于骨髓組織。骨髓作為機(jī)體重要的造血組織，存在于身體的眾多骨骼內(nèi)，BMSCs就從其中被分離獲得。在骨髓中，BMSCs不僅對(duì)造血干細(xì)胞（HSC）起到支持作用，還能分泌如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-11（IL-11）、白血病抑制因子（LIF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）及干細(xì)胞因子（SCF）等多種生長(zhǎng)因子，為造血過(guò)程提供支持。BMSCs具備高度的自我更新能力。在適宜的培養(yǎng)條件下，BMSCs能夠不斷分裂增殖，維持自身細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。研究表明，在體外培養(yǎng)時(shí)，BMSCs可進(jìn)行多次傳代，且在一定代數(shù)內(nèi)仍能保持其生物學(xué)特性。例如，有研究將BMSCs在體外培養(yǎng)至10代以上，細(xì)胞依然具有較強(qiáng)的增殖活性和分化潛能，這一特性使其在干細(xì)胞治療和組織工程等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)楹罄m(xù)的研究和治療提供充足的細(xì)胞來(lái)源。多向分化潛能也是BMSCs的重要特性之一。BMSCs能夠在特定的誘導(dǎo)條件下，分化為多種組織細(xì)胞類型。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，BMSCs可向成骨細(xì)胞分化，表達(dá)成骨相關(guān)標(biāo)志物如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）等，并形成礦化結(jié)節(jié)；在成軟骨誘導(dǎo)條件下，BMSCs能夠分化為軟骨細(xì)胞，分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖；在成脂誘導(dǎo)環(huán)境中，BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴積累，且表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物如脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）等。此外，BMSCs還具有向肌肉、韌帶、肌腱、基質(zhì)等組織分化的能力，這種多向分化潛能使其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出巨大的潛力。BMSCs還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性。它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，對(duì)多種免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等的功能產(chǎn)生影響。BMSCs可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少其分泌促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等；對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體分泌也有抑制作用；能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，促使其向抗炎型M2表型轉(zhuǎn)化，減少炎癥因子的釋放；對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖能力也有一定的抑制效果。BMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子和細(xì)胞間直接接觸等方式實(shí)現(xiàn)，其分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）等細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這種免疫調(diào)節(jié)特性使得BMSCs在治療免疫相關(guān)疾病以及減少細(xì)胞移植后的免疫排斥反應(yīng)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。2.2.2BMSCs治療TBI的作用機(jī)制BMSCs治療TBI的作用機(jī)制是多方面的，主要包括分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、分化為神經(jīng)細(xì)胞以及調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)等。分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是BMSCs發(fā)揮治療作用的重要機(jī)制之一。BMSCs能夠分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、分化和修復(fù)具有重要作用。BDNF可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突生長(zhǎng)，增強(qiáng)神經(jīng)元的突觸可塑性，提高神經(jīng)元對(duì)損傷的抵抗能力。在TBI動(dòng)物模型中，注射BMSCs后，損傷腦組織中BDNF的表達(dá)顯著增加，神經(jīng)元的存活數(shù)量明顯增多，神經(jīng)功能得到改善。NGF能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，對(duì)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生具有積極作用。GDNF可以保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，促進(jìn)其存活和功能恢復(fù)，在TBI的治療中，有助于改善運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能。IGF-1則能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，減輕TBI后的神經(jīng)損傷。BMSCs分泌的這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)旁分泌作用，為受損的神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持，改善損傷局部的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)。分化為神經(jīng)細(xì)胞也是BMSCs治療TBI的重要作用途徑。在TBI的病理微環(huán)境中，BMSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。研究表明，在特定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如神經(jīng)元標(biāo)志物β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）、神經(jīng)絲蛋白（NF）等，以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）等，逐漸分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。分化后的神經(jīng)元能夠整合到受損的神經(jīng)回路中，替代受損的神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)功能；分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，能夠?yàn)樯窠?jīng)元提供支持和保護(hù)，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的形成，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度。雖然BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率相對(duì)較低，但這一過(guò)程在促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)中仍然具有重要意義。調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)是BMSCs治療TBI的關(guān)鍵機(jī)制。如前所述，TBI后會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織的進(jìn)一步損傷。BMSCs能夠調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，減輕炎癥損傷。一方面，BMSCs可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥因子的釋放。它可以抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平。另一方面，BMSCs能夠促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-4、IL-10等，調(diào)節(jié)免疫平衡，使炎癥反應(yīng)向有利于組織修復(fù)的方向發(fā)展。此外，BMSCs還可以通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，使其從促炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，減少炎癥介質(zhì)的釋放，減輕神經(jīng)炎癥對(duì)腦組織的損傷。通過(guò)調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，BMSCs能夠改善TBI后的病理微環(huán)境，為神經(jīng)再生和修復(fù)創(chuàng)造有利條件。BMSCs通過(guò)多種作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用，促進(jìn)TBI后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，為TBI的治療提供了新的策略和希望。三、研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料實(shí)驗(yàn)選用8周齡的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，共計(jì)120只，體重在250-300g之間。選擇該品系大鼠是因?yàn)槠渚哂羞z傳背景清晰、對(duì)實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)穩(wěn)定、繁殖能力強(qiáng)、成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。雄性大鼠可減少因性別差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：DMEM/F12培養(yǎng)基，用于BMSCs的培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清，含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)BMSCs的增殖和生長(zhǎng)；胰蛋白酶，用于消化細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液，可防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C，用于誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，以驗(yàn)證其多向分化潛能；兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）抗體、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體，用于免疫熒光染色，檢測(cè)BMSCs在體內(nèi)是否分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；DAPI染液，用于細(xì)胞核染色，便于在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞；伊文氏藍(lán)，用于檢測(cè)血腦屏障的通透性，評(píng)估TBI后血腦屏障的損傷程度。主要儀器設(shè)備有：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，可提供穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為BMSCs的培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境；倒置相差顯微鏡，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖情況；低溫離心機(jī)，用于細(xì)胞離心，分離細(xì)胞和培養(yǎng)液等；PCR儀，用于基因擴(kuò)增，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平；酶標(biāo)儀，可進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA），定量檢測(cè)細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的含量；小動(dòng)物腦立體定位儀，在顱內(nèi)注射BMSCs時(shí)，可精確確定注射部位，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性；Morris水迷宮，用于測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，評(píng)估TBI對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響以及BMSCs移植后的治療效果；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱，用于觀察大鼠的自主活動(dòng)、探索行為和焦慮水平，評(píng)估TBI對(duì)大鼠行為學(xué)的影響；轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，可測(cè)試大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和肌肉耐力，評(píng)估TBI對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響以及BMSCs移植后的治療效果。3.2實(shí)驗(yàn)分組將120只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組24只，分別為假手術(shù)組、創(chuàng)傷模型組、腦內(nèi)移植組、靜脈移植組、頸外動(dòng)脈移植組。分組依據(jù)如下：假手術(shù)組僅進(jìn)行麻醉、開顱等操作，但不進(jìn)行創(chuàng)傷打擊，用于作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照，以排除手術(shù)操作本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。創(chuàng)傷模型組采用自由落體打擊法制作TBI模型，不進(jìn)行BMSCs移植，用于觀察TBI大鼠自然恢復(fù)過(guò)程中的神經(jīng)功能變化和病理生理改變，作為評(píng)估BMSCs治療效果的基線。腦內(nèi)移植組在制作TBI模型后，通過(guò)腦立體定位儀將BMSCs直接注射到損傷灶周圍，該組用于探究直接將BMSCs輸送至損傷部位對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響。靜脈移植組在制作TBI模型后，經(jīng)尾靜脈注射BMSCs，此途徑操作相對(duì)簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，可觀察BMSCs經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)損傷部位的歸巢和治療效果。頸外動(dòng)脈移植組在制作TBI模型后，通過(guò)頸外動(dòng)脈注射BMSCs，可使BMSCs更直接地到達(dá)腦部，同時(shí)避免了靜脈注射可能導(dǎo)致的肺部截留等問題，用于研究該途徑下BMSCs對(duì)TBI大鼠的治療作用。通過(guò)這樣的分組設(shè)置，能夠全面對(duì)比不同移植途徑下BMSCs對(duì)TBI大鼠的治療效果，為篩選最佳移植途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的獲取與培養(yǎng)過(guò)程如下：將SD大鼠以10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉后，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡消毒10min，隨后在無(wú)菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨和脛骨。用含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓細(xì)胞吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液以1500r/min離心5min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，裂解完成后再次以1500r/min離心5min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，之后每3天換液一次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。取第3代BMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志物（如CD29、CD44、CD90等呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45等呈陰性表達(dá)）以及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)（成骨、成脂分化誘導(dǎo)）來(lái)鑒定BMSCs的純度和多向分化潛能。在成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等），培養(yǎng)2-3周后，通過(guò)茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成，以驗(yàn)證其成骨分化能力。在成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含地塞米松、胰島素、吲哚美辛等），誘導(dǎo)2-3周后，通過(guò)油紅O染色檢測(cè)脂滴的形成，以驗(yàn)證其成脂分化能力。3.4創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的建立采用改良Marmarou's法建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型。具體操作如下：將大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上。使用電動(dòng)牙科鉆在大鼠右側(cè)頂骨處（前囟后1.0mm，中線旁2.5mm）鉆一直徑約5mm的骨窗，注意在操作過(guò)程中避免損傷硬腦膜。骨窗鉆好后，將大鼠頭部移至落體打擊裝置下方，使撞擊桿的中心對(duì)準(zhǔn)骨窗中心。落體打擊裝置的撞擊桿質(zhì)量為20g，從20cm高度自由落下，垂直撞擊在骨窗處的硬腦膜上，造成腦損傷。撞擊完成后，迅速將大鼠從立體定位儀上取下，縫合頭皮切口。術(shù)中使用碘伏消毒，術(shù)后給予青霉素鈉（8萬(wàn)U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織大體觀察。在造模后24h，采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。mNSS評(píng)分包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡等多個(gè)方面的測(cè)試，總分為18分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。正常大鼠的mNSS評(píng)分為0分，若大鼠的mNSS評(píng)分在7-12分之間，則判定為中度腦損傷，提示建模成功。同時(shí)，對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行大體觀察，可見損傷部位腦組織表面有明顯的挫傷灶，呈出血、水腫狀，表明模型建立成功。若大鼠的mNSS評(píng)分低于7分或腦組織大體觀察無(wú)明顯損傷表現(xiàn)，則視為建模失敗，需重新建模。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行麻醉、開顱暴露硬腦膜等操作，但不進(jìn)行落體打擊。假手術(shù)組大鼠在術(shù)后也需進(jìn)行同樣的護(hù)理和觀察，以作為正常對(duì)照組，用于與創(chuàng)傷模型組和各移植組進(jìn)行對(duì)比分析。3.5不同途徑的干細(xì)胞移植操作腦內(nèi)移植：在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型建立后7天，進(jìn)行腦內(nèi)移植操作。將大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上。在大鼠右側(cè)頂骨處（前囟后1.0mm，中線旁2.5mm），即損傷灶周圍，用牙科鉆鉆一直徑約1mm的小孔。將含有1×10?個(gè)BMSCs的細(xì)胞懸液（10μl）裝入微量注射器，通過(guò)腦立體定位儀將注射器針頭緩慢插入腦內(nèi)，深度約為3mm，然后以1μl/min的速度緩慢注射細(xì)胞懸液。注射完畢后，留針5min，以防止細(xì)胞懸液反流，隨后緩慢拔出針頭，用骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮切口。靜脈移植：在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型建立后7天，經(jīng)尾靜脈注射BMSCs。將大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉后，固定于鼠板上，將含有1×10?個(gè)BMSCs的細(xì)胞懸液（200μl）吸入1ml注射器中，連接4號(hào)半頭皮針。選擇大鼠尾靜脈，用酒精棉球擦拭消毒后，將頭皮針沿尾靜脈平行方向刺入，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射速度約為0.1ml/min。注射過(guò)程中密切觀察大鼠的反應(yīng)，確保注射順利進(jìn)行，注射完畢后拔出針頭，用棉球按壓注射部位片刻，防止出血。頸外動(dòng)脈移植：在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型建立后7天，進(jìn)行頸外動(dòng)脈移植操作。將大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚消毒，沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離頸外動(dòng)脈，小心結(jié)扎頸外動(dòng)脈的分支，如甲狀腺上動(dòng)脈、舌動(dòng)脈等。在頸外動(dòng)脈近心端用動(dòng)脈夾夾閉，遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，在兩結(jié)扎點(diǎn)之間剪一小口，將含有1×10?個(gè)BMSCs的細(xì)胞懸液（100μl）通過(guò)微導(dǎo)管緩慢注入頸外動(dòng)脈，注射速度約為0.05ml/min。注射完畢后，用絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈的切口處，松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)頸外動(dòng)脈血流，逐層縫合頸部皮膚。3.6檢測(cè)指標(biāo)與方法3.6.1神經(jīng)功能損傷評(píng)分在移植后1天、3天、7天、14天、28天，采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。mNSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：運(yùn)動(dòng)功能方面，正常運(yùn)動(dòng)得0分，若出現(xiàn)輕度運(yùn)動(dòng)障礙，如行走時(shí)稍顯不穩(wěn)但能自主行走，得1分；中度運(yùn)動(dòng)障礙，表現(xiàn)為行走困難、步態(tài)明顯不穩(wěn)、肢體協(xié)調(diào)性差，得2分；重度運(yùn)動(dòng)障礙，幾乎不能自主行走，肢體活動(dòng)嚴(yán)重受限，得3分；肢體癱瘓則得4分。感覺功能評(píng)估中，正常感覺得0分，對(duì)觸覺、痛覺或本體感覺刺激反應(yīng)稍遲鈍為輕度感覺障礙，得1分；對(duì)感覺刺激反應(yīng)明顯遲鈍，需較強(qiáng)刺激才有反應(yīng)，為中度感覺障礙，得2分；幾乎對(duì)感覺刺激無(wú)反應(yīng)，僅在強(qiáng)烈刺激下有微弱反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)，為重度感覺障礙，得3分。反射功能里，正常反射得0分，部分反射減弱，如角膜反射或耳反射稍有延遲，得1分；反射明顯減弱，需較強(qiáng)刺激才能引出且動(dòng)作不完整或延遲明顯，得2分；大部分反射消失，即使強(qiáng)烈刺激也難引出反射動(dòng)作，得3分。此外，還包括平衡測(cè)試等，總分范圍為0-18分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。mNSS評(píng)分能全面反映大鼠神經(jīng)功能損傷程度，通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分對(duì)比，可清晰觀察到各組大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，為評(píng)估BMSCs不同移植途徑對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響提供量化依據(jù)。3.6.2組織形態(tài)學(xué)觀察在移植后28天，將大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉后，經(jīng)左心室用生理鹽水灌注沖洗，直至流出的液體清亮為止，隨后用4%多聚甲醛固定液進(jìn)行灌注固定。取大鼠腦組織，放入4%多聚甲醛固定液中后固定24h，然后將腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5-10min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，伊紅染液染色2-5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色完成后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，包括神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量、排列情況，膠質(zhì)細(xì)胞的增生情況，以及腦組織的出血、水腫、壞死等病理改變。通過(guò)對(duì)切片的觀察和分析，對(duì)比不同組大鼠腦組織的損傷修復(fù)情況，評(píng)估BMSCs不同移植途徑對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)的影響。3.6.3神經(jīng)再生相關(guān)因子檢測(cè)免疫組化法：在移植后28天，取大鼠腦組織制作石蠟切片，步驟同組織形態(tài)學(xué)觀察中的切片制作。切片脫蠟至水后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)等方法。修復(fù)后冷卻至室溫，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30min，以減少非特異性染色。棄去封閉液，不洗，滴加一抗（兔抗大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）抗體、兔抗大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）抗體等，稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20-30min。PBS沖洗3次后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-20min。PBS沖洗3次，DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，適時(shí)終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色情況，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值，半定量分析NGF、BDNF等神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)水平。Westernblot法：在移植后28天，取大鼠腦組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min，然后在4℃下以12000r/min離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入一抗（兔抗大鼠NGF抗體、兔抗大鼠BDNF抗體等，稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，通過(guò)分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算NGF、BDNF等神經(jīng)再生相關(guān)因子的相對(duì)表達(dá)量。3.6.4干細(xì)胞在體內(nèi)的分布與分化檢測(cè)利用激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布與分化情況。在移植后28天，取大鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定液固定后，進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為10μm。將切片用PBS沖洗3次，每次5min，然后用0.3%TritonX-100溶液室溫孵育15-20min，以增加細(xì)胞膜的通透性。PBS沖洗3次后，用5%正常山羊血清封閉液室溫封閉30min。棄去封閉液，不洗，滴加一抗（小鼠抗大鼠綠色熒光蛋白（GFP）抗體，用于標(biāo)記移植的BMSCs，稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書確定；兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）抗體或兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體，用于檢測(cè)BMSCs是否分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加相應(yīng)的熒光二抗（AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），室溫避光孵育1-2h。PBS沖洗3次后，用DAPI染液室溫避光孵育5-10min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色熒光表示GFP標(biāo)記的BMSCs，紅色熒光表示NSE或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核。通過(guò)觀察綠色熒光與紅色熒光的共定位情況，確定BMSCs是否分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并分析其在腦組織中的分布情況。該檢測(cè)指標(biāo)可直觀反映干細(xì)胞在體內(nèi)的分化命運(yùn)和分布位置，對(duì)于了解BMSCs不同移植途徑對(duì)其分化和歸巢的影響具有重要意義。3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。神經(jīng)功能損傷評(píng)分在不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以分析不同移植途徑對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的時(shí)間效應(yīng)和組間差異。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01被認(rèn)為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理的統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠準(zhǔn)確揭示不同移植途徑下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生影響的差異，為研究結(jié)論的可靠性提供有力保障。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定結(jié)果原代培養(yǎng)的BMSCs在接種24h后，可見少量細(xì)胞貼壁，呈圓形或橢圓形，折光性強(qiáng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈漩渦狀或放射狀排列。培養(yǎng)至第5-7天，細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)較為均一，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖1）。傳代后的BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖速度加快，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中具有較好的生物學(xué)活性。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)BMSCs的表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，BMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD90，陽(yáng)性表達(dá)率均超過(guò)95%；而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD45表達(dá)呈陰性，陽(yáng)性表達(dá)率均低于5%（圖2）。這表明所培養(yǎng)的細(xì)胞符合BMSCs的表面標(biāo)志物特征，具有較高的純度，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs接種于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3周后，進(jìn)行茜素紅染色。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞可見大量紅色鈣結(jié)節(jié)形成，而對(duì)照組細(xì)胞未見明顯鈣結(jié)節(jié)（圖3），表明BMSCs在成骨誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細(xì)胞，具有成骨分化潛能。在成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs接種于成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3周后，進(jìn)行油紅O染色。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂滴（圖4），表明BMSCs在成脂誘導(dǎo)條件下能夠分化為脂肪細(xì)胞，具有成脂分化潛能。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功獲取并培養(yǎng)了BMSCs，所培養(yǎng)的BMSCs具有典型的形態(tài)特征、特定的表面標(biāo)志物表達(dá)以及多向分化潛能，可用于后續(xù)的創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型治療研究。（此處可插入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化圖片、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖片、成骨誘導(dǎo)茜素紅染色圖片、成脂誘導(dǎo)油紅O染色圖片，圖片編號(hào)依次對(duì)應(yīng)圖1、圖2、圖3、圖4，以直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果）4.2不同移植途徑對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響對(duì)各組大鼠在移植后1天、3天、7天、14天、28天進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS），結(jié)果如圖5所示。在移植后1天，假手術(shù)組大鼠的mNSS評(píng)分為0分，創(chuàng)傷模型組、腦內(nèi)移植組、靜脈移植組、頸外動(dòng)脈移植組的mNSS評(píng)分無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明此時(shí)不同移植途徑尚未對(duì)大鼠神經(jīng)功能產(chǎn)生明顯影響。從移植后3天開始，各移植組的mNSS評(píng)分均低于創(chuàng)傷模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠改善TBI大鼠的神經(jīng)功能。其中，腦內(nèi)移植組的mNSS評(píng)分降低最為明顯，與靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著時(shí)間的推移，各移植組大鼠的神經(jīng)功能持續(xù)改善。在移植后14天和28天，腦內(nèi)移植組的mNSS評(píng)分顯著低于靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組（P<0.01），且靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組之間也存在顯著性差異（P<0.05），頸外動(dòng)脈移植組的神經(jīng)功能恢復(fù)效果優(yōu)于靜脈移植組。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠mNSS評(píng)分的重復(fù)測(cè)量方差分析可知，移植途徑和時(shí)間之間存在顯著的交互作用（P<0.01），說(shuō)明不同移植途徑對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響隨時(shí)間變化而不同。進(jìn)一步簡(jiǎn)單效應(yīng)分析表明，在不同時(shí)間點(diǎn)，不同移植途徑對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響均具有顯著性差異（P<0.01）。（此處可插入mNSS評(píng)分隨時(shí)間變化的折線圖，圖編號(hào)對(duì)應(yīng)圖5，橫坐標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為mNSS評(píng)分，不同組用不同顏色線條表示）綜合以上結(jié)果，腦內(nèi)移植在促進(jìn)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)方面效果最為顯著，頸外動(dòng)脈移植的效果次之，靜脈移植的效果相對(duì)較弱。這可能是因?yàn)槟X內(nèi)移植能夠?qū)⒐撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞直接輸送至損傷部位，使其更有效地參與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程；頸外動(dòng)脈移植可使干細(xì)胞更直接地到達(dá)腦部，減少了在其他器官的截留；而靜脈移植的干細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)血液循環(huán)到達(dá)損傷部位，在肺部等器官的截留可能導(dǎo)致到達(dá)腦部的干細(xì)胞數(shù)量減少，從而影響了治療效果。4.3腦組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果移植后28天，對(duì)各組大鼠腦組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖6所示。假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰，排列緊密且規(guī)則，細(xì)胞間隙正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織壞死現(xiàn)象（圖6A）。創(chuàng)傷模型組大鼠腦組織損傷區(qū)域可見大量神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞核固縮、深染，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細(xì)胞間隙明顯增寬，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見膠質(zhì)細(xì)胞增生，損傷灶周圍組織水腫明顯（圖6B）。腦內(nèi)移植組大鼠腦組織損傷區(qū)域的病理改變明顯減輕，可見較多形態(tài)相對(duì)正常的神經(jīng)元，細(xì)胞核形態(tài)基本恢復(fù)正常，細(xì)胞排列相對(duì)有序，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生程度較輕，組織水腫也明顯減輕（圖6C）。靜脈移植組大鼠腦組織損傷區(qū)域仍可見部分神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞排列較紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，膠質(zhì)細(xì)胞增生較明顯，組織水腫有所減輕，但不如腦內(nèi)移植組效果顯著（圖6D）。頸外動(dòng)脈移植組大鼠腦組織損傷區(qū)域的病理改變較靜脈移植組有所改善，神經(jīng)元變性、壞死程度減輕，細(xì)胞核形態(tài)相對(duì)較好，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生程度也相對(duì)較輕，組織水腫進(jìn)一步減輕，但與腦內(nèi)移植組相比仍存在一定差距（圖6E）。（此處可插入各組大鼠腦組織HE染色圖片，圖編號(hào)對(duì)應(yīng)圖6，圖片從左至右依次為假手術(shù)組、創(chuàng)傷模型組、腦內(nèi)移植組、靜脈移植組、頸外動(dòng)脈移植組，圖片下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的組別，以直觀展示各組腦組織形態(tài)學(xué)變化）通過(guò)對(duì)各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化的觀察，進(jìn)一步表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織的病理?yè)p傷，其中腦內(nèi)移植對(duì)改善腦組織形態(tài)學(xué)的效果最為顯著，頸外動(dòng)脈移植和靜脈移植也有一定的改善作用，但程度相對(duì)較弱。這與神經(jīng)功能損傷評(píng)分的結(jié)果一致，說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不同移植途徑對(duì)腦組織的修復(fù)作用存在差異，腦內(nèi)移植更有利于促進(jìn)腦組織的修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。4.4神經(jīng)再生相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果通過(guò)免疫組化和Westernblot法檢測(cè)各組大鼠腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7、圖8所示。免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中NGF、BDNF陽(yáng)性染色較弱（圖7A、B），這是因?yàn)檎Ｉ頎顟B(tài)下，腦組織內(nèi)神經(jīng)再生相關(guān)因子維持在基礎(chǔ)表達(dá)水平，以滿足正常神經(jīng)功能需求。創(chuàng)傷模型組大鼠腦組織中NGF、BDNF陽(yáng)性染色略有增強(qiáng)（圖7C、D），可能是機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷的一種自我保護(hù)反應(yīng)，試圖通過(guò)上調(diào)這些因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，但這種內(nèi)源性的修復(fù)作用有限。腦內(nèi)移植組大鼠腦組織中NGF、BDNF陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，且分布較為廣泛，主要集中在損傷灶周圍區(qū)域（圖7E、F）。靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組大鼠腦組織中NGF、BDNF陽(yáng)性染色也有所增強(qiáng)，但強(qiáng)度低于腦內(nèi)移植組（圖7G-J）。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值，結(jié)果顯示，腦內(nèi)移植組的平均光密度值顯著高于創(chuàng)傷模型組、靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組（P<0.01），靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組的平均光密度值也顯著高于創(chuàng)傷模型組（P<0.05）。Westernblot結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷模型組大鼠腦組織中NGF、BDNF的相對(duì)表達(dá)量有所增加（圖8A、B），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腦內(nèi)移植組大鼠腦組織中NGF、BDNF的相對(duì)表達(dá)量顯著高于創(chuàng)傷模型組、靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組（P<0.01），以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算得出腦內(nèi)移植組NGF的相對(duì)表達(dá)量約為創(chuàng)傷模型組的2.5倍，BDNF的相對(duì)表達(dá)量約為創(chuàng)傷模型組的2.8倍。靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組大鼠腦組織中NGF、BDNF的相對(duì)表達(dá)量也高于創(chuàng)傷模型組（P<0.05），且頸外動(dòng)脈移植組的相對(duì)表達(dá)量高于靜脈移植組（P<0.05）。（此處可插入免疫組化和Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖片，圖編號(hào)依次對(duì)應(yīng)圖7、圖8，免疫組化圖片展示假手術(shù)組、創(chuàng)傷模型組、腦內(nèi)移植組、靜脈移植組、頸外動(dòng)脈移植組NGF、BDNF染色情況；Westernblot圖片展示不同組NGF、BDNF蛋白條帶，下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的組別和蛋白名稱，以直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果）綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠上調(diào)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織中神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)，其中腦內(nèi)移植對(duì)NGF、BDNF表達(dá)的促進(jìn)作用最為顯著，頸外動(dòng)脈移植次之，靜脈移植相對(duì)較弱。這進(jìn)一步說(shuō)明不同移植途徑對(duì)促進(jìn)神經(jīng)再生的效果存在差異，腦內(nèi)移植更有利于通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)。4.5干細(xì)胞在體內(nèi)的分布與分化結(jié)果通過(guò)激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，觀察移植后28天各組大鼠腦組織中BMSCs的分布與分化情況，結(jié)果如圖9所示。在腦內(nèi)移植組，可見大量綠色熒光標(biāo)記的BMSCs聚集在損傷灶周圍（圖9A），且部分BMSCs與紅色熒光標(biāo)記的NSE或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞共定位（圖9B、C），表明這些BMSCs分化為了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在靜脈移植組，腦組織中也可檢測(cè)到少量綠色熒光標(biāo)記的BMSCs，但分布較為分散，主要集中在血管周圍（圖9D），與NSE或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的共定位現(xiàn)象較少（圖9E、F）。頸外動(dòng)脈移植組中，BMSCs在腦組織中的分布相對(duì)較多，且在損傷灶周邊區(qū)域也有一定數(shù)量的聚集（圖9G），與NSE或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的共定位情況較靜脈移植組更為明顯（圖9H、I）。對(duì)各組BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，腦內(nèi)移植組BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例顯著高于靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組（P<0.01），頸外動(dòng)脈移植組的分化比例高于靜脈移植組（P<0.05）。（此處可插入激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)圖片，圖編號(hào)對(duì)應(yīng)圖9，圖片從左至右依次為腦內(nèi)移植組BMSCs分布、腦內(nèi)移植組BMSCs分化為神經(jīng)元、腦內(nèi)移植組BMSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、靜脈移植組BMSCs分布、靜脈移植組BMSCs分化為神經(jīng)元、靜脈移植組BMSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、頸外動(dòng)脈移植組BMSCs分布、頸外動(dòng)脈移植組BMSCs分化為神經(jīng)元、頸外動(dòng)脈移植組BMSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，圖片下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)的組別和檢測(cè)指標(biāo)，以直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果）上述結(jié)果表明，不同移植途徑下BMSCs在TBI大鼠腦組織內(nèi)的分布與分化存在顯著差異。腦內(nèi)移植能夠使BMSCs直接到達(dá)損傷部位并大量聚集，更有利于其分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程；頸外動(dòng)脈移植次之，雖然BMSCs在腦組織中的分布和分化情況優(yōu)于靜脈移植，但仍不及腦內(nèi)移植；靜脈移植由于BMSCs在肺部等器官的截留，到達(dá)腦部的細(xì)胞數(shù)量較少，且分布分散，導(dǎo)致其在腦組織內(nèi)的分化效率較低。五、分析與討論5.1不同移植途徑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠功能恢復(fù)的作用差異本研究結(jié)果表明，不同移植途徑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用存在顯著差異。腦內(nèi)移植組在促進(jìn)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)方面效果最為顯著，頸外動(dòng)脈移植組次之，靜脈移植組相對(duì)較弱。腦內(nèi)移植能夠?qū)⒐撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）直接輸送至損傷部位，使其能夠迅速參與神經(jīng)修復(fù)過(guò)程。BMSCs在損傷灶周圍聚集，可直接與受損的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，提供更直接的營(yíng)養(yǎng)支持和修復(fù)信號(hào)。同時(shí)，腦內(nèi)移植減少了BMSCs在血液循環(huán)中的損耗，避免了在肺部等器官的截留，從而提高了到達(dá)損傷部位的細(xì)胞數(shù)量和活性。研究表明，直接將干細(xì)胞移植到損傷部位，可使干細(xì)胞在局部微環(huán)境中更好地發(fā)揮分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)等作用，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)。頸外動(dòng)脈移植可使BMSCs更直接地到達(dá)腦部，相較于靜脈移植，減少了在其他器官的截留，增加了到達(dá)損傷部位的干細(xì)胞數(shù)量。頸外動(dòng)脈是供應(yīng)腦部血液的重要血管之一，通過(guò)頸外動(dòng)脈注射BMSCs，可使細(xì)胞隨著血流快速到達(dá)腦部，提高了干細(xì)胞在腦內(nèi)的分布效率。相關(guān)研究指出，經(jīng)動(dòng)脈途徑移植干細(xì)胞，能夠提高干細(xì)胞在靶器官的聚集程度，增強(qiáng)治療效果。在本研究中，頸外動(dòng)脈移植組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)效果優(yōu)于靜脈移植組，進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。靜脈移植雖然操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小，但BMSCs需要經(jīng)過(guò)血液循環(huán)到達(dá)損傷部位，在肺部等器官的截留可能導(dǎo)致到達(dá)腦部的干細(xì)胞數(shù)量減少，從而影響了治療效果。有研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射干細(xì)胞后，大部分細(xì)胞會(huì)在肺部被截留，僅有少量細(xì)胞能夠到達(dá)損傷部位。此外，血液循環(huán)中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等也可能對(duì)BMSCs的活性和功能產(chǎn)生影響，降低其治療效果。在本研究中，靜脈移植組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)效果相對(duì)較弱，可能與上述因素有關(guān)。5.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植能夠促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠的神經(jīng)再生，其機(jī)制可能與分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、分化為神經(jīng)細(xì)胞以及調(diào)節(jié)微環(huán)境等因素密切相關(guān)。BMSCs具有分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的能力，這在促進(jìn)神經(jīng)再生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本研究中，通過(guò)免疫組化和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植后，TBI大鼠腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)顯著上調(diào)。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)神經(jīng)元的突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)和延伸，從而促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。BDNF可以與神經(jīng)元表面的TrkB受體結(jié)合，激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)。NGF能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，對(duì)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生具有積極作用。BMSCs分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)旁分泌作用，為受損的神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持，改善損傷局部的微環(huán)境，吸引內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞遷移至損傷部位，促進(jìn)其增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生。分化為神經(jīng)細(xì)胞也是BMSCs促進(jìn)神經(jīng)再生的重要機(jī)制之一。激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，部分移植的BMSCs能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在TBI的病理微環(huán)境中，BMSCs受到損傷部位釋放的細(xì)胞因子、趨化因子等信號(hào)分子的誘導(dǎo)，啟動(dòng)向神經(jīng)細(xì)胞分化的程序。分化后的神經(jīng)元能夠整合到受損的神經(jīng)回路中，替代受損的神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)功能；分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，能夠?yàn)樯窠?jīng)元提供支持和保護(hù)，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的形成，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度。雖然BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率相對(duì)較低，但這些新生的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于重建受損的神經(jīng)組織和恢復(fù)神經(jīng)功能具有重要意義。BMSCs還能夠調(diào)節(jié)損傷局部的微環(huán)境，為神經(jīng)再生創(chuàng)造有利條件。TBI后，損傷局部會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血腦屏障破壞等病理改變，這些因素不利于神經(jīng)再生。BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能夠抑制炎癥細(xì)胞的活化和增殖，減少炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，同時(shí)促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-4、IL-10等，調(diào)節(jié)免疫平衡，減輕炎癥損傷。BMSCs還可以通過(guò)分泌抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，減輕氧化應(yīng)激損傷。此外，BMSCs能夠促進(jìn)血管生成，改善損傷部位的血液供應(yīng)，為神經(jīng)再生提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。研究表明，BMSCs可以分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新的血管。通過(guò)調(diào)節(jié)微環(huán)境，BMSCs能夠改善損傷局部的病理狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化和遷移，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。5.3研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化意義與潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果為創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的臨床治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療策略，具有顯著的臨床轉(zhuǎn)化意義與潛在應(yīng)用價(jià)值。從臨床轉(zhuǎn)化意義來(lái)看，本研究明確了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）不同移植途徑對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響差異，為臨床醫(yī)生選擇合適的移植途徑提供了關(guān)鍵參考。腦內(nèi)移植在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生方面效果最佳，這提示在臨床實(shí)踐中，對(duì)于病情允許且符合手術(shù)指征的TBI患者，腦內(nèi)移植BMSCs可能是一種有效的治療選擇。通過(guò)將BMSCs直接輸送至損傷部位，能夠提高治療的精準(zhǔn)性和有效性，有望改善患者的神經(jīng)功能預(yù)后，減少后遺癥的發(fā)生。頸外動(dòng)脈移植和靜脈移植也具有一定的治療效果，且頸外動(dòng)脈移植效果優(yōu)于靜脈移植。這兩種移植途徑相對(duì)腦內(nèi)移植創(chuàng)傷較小，對(duì)于一些無(wú)法耐受腦內(nèi)移植手術(shù)的患者，頸外動(dòng)脈移植或靜脈移植可能是可行的替代方案。臨床醫(yī)生可以根據(jù)患者的具體病情、身體狀況和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等因素，綜合評(píng)估后選擇最適合患者的移植途徑，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。在潛在應(yīng)用價(jià)值方面，BMSCs移植治療TBI具有廣闊的前景。BMSCs來(lái)源廣泛、易于獲取、免疫原性低等特性，使其在臨床應(yīng)用中具有很大的優(yōu)勢(shì)。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，BMSCs移植治療TBI有望成為一種常規(guī)的治療手段。BMSCs移植治療TBI還可以與其他治療方法相結(jié)合，如藥物治療、康復(fù)訓(xùn)練等，形成綜合治療方案，進(jìn)一步提高治療效果。在藥物治療方面，BMSCs移植可以增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)藥物的療效，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)；在康復(fù)訓(xùn)練方面，BMSCs移植可以為康復(fù)訓(xùn)練提供更好的基礎(chǔ)，提高康復(fù)訓(xùn)練的效果，加速患者的康復(fù)進(jìn)程。然而，BMSCs移植治療TBI在臨床應(yīng)用中也可能面臨一些問題。干細(xì)胞的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化問題是需要解決的關(guān)鍵問題之一。不同來(lái)源、不同制備方法的BMSCs可能在細(xì)胞活性、分化能力、免疫原性等方面存在差異，這會(huì)影響治療效果的穩(wěn)定性和安全性。因此，建立統(tǒng)一的干細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和制備規(guī)范，確保干細(xì)胞的質(zhì)量和安全性，是實(shí)現(xiàn)BMSCs移植臨床應(yīng)用的重要前提。移植后的長(zhǎng)期安全性和有效性也是需要關(guān)注的問題。雖然本研究在短期內(nèi)觀察到了BMSCs移植對(duì)TBI大鼠的治療效果，但移植后的長(zhǎng)期效果和安全性仍需進(jìn)一步研究。例如，移植的BMSCs是否會(huì)在體內(nèi)發(fā)生惡變、是否會(huì)引起免疫反應(yīng)等，都需要進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪和監(jiān)測(cè)。干細(xì)胞移植的成本較高，也限制了其臨床應(yīng)用的普及。因此，降低干細(xì)胞移植的成本，提高其性價(jià)比，也是推動(dòng)BMSCs移植臨床應(yīng)用的重要任務(wù)。盡管存在這些問題，但本研究結(jié)果為BMSCs移植治療TBI的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入開展，BMSCs移植有望為TBI患者帶來(lái)更好的治療效果和生活質(zhì)量。5.4研究的局限性與未來(lái)研究方向本研究在探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）不同移植途徑對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究的樣本量相對(duì)較小，僅選用了120只SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。較小的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性增加，降低研究結(jié)論的可靠性和普適性。在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心、大樣本的研究，以更準(zhǔn)確地評(píng)估不同移植途徑的效果差異，提高研究結(jié)果的可信度。其次，本研究的觀察時(shí)間相對(duì)較短，僅觀察到移植后28天的情況。然而，BMSCs移植后的長(zhǎng)期效果和安全性，如細(xì)胞的長(zhǎng)期存活、分化穩(wěn)定性、是否會(huì)引起遠(yuǎn)期并發(fā)癥等，仍有待進(jìn)一步研究。未來(lái)的研究應(yīng)延長(zhǎng)觀察時(shí)間，對(duì)移植后的大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，觀察BMSCs在體內(nèi)的長(zhǎng)期作用和潛在風(fēng)險(xiǎn)，為臨床應(yīng)用提供更全面的安全性和有效性數(shù)據(jù)。此外，本研究?jī)H對(duì)比了腦內(nèi)移植、靜脈移植和頸外動(dòng)脈移植三種途徑，未對(duì)其他可能的移植途徑（如動(dòng)脈內(nèi)注射、鼻腔給藥等）進(jìn)行研究。不同的移植途徑可能會(huì)對(duì)BMSCs的歸巢、存活和分化產(chǎn)生不同的影響，從而影響治療效果。在未來(lái)的研究中，應(yīng)進(jìn)一步探索其他移植途徑，全面評(píng)估不同移植途徑的優(yōu)缺點(diǎn)，為臨床選擇最佳移植途徑提供更多的參考依據(jù)。本研究在機(jī)制探討方面雖然取得了一定進(jìn)展，但仍不夠深入。BMSCs促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的具體分子機(jī)制和信號(hào)通路尚未完全明確，不同移植途徑對(duì)這些機(jī)制的影響也有待進(jìn)一步研究。未來(lái)可運(yùn)用基因編輯技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等先進(jìn)技術(shù)手段，深入研究BMSCs在不同移植途徑下的作用機(jī)制，揭示其關(guān)鍵分子靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為優(yōu)化治療方案提供理論支持。未來(lái)的研究還可以考慮將BMSCs與其他治療方法（如藥物治療、康復(fù)訓(xùn)練、神經(jīng)調(diào)控技術(shù)等）相結(jié)合，形成綜合治療方案。藥物治療可以增強(qiáng)BMSCs的治療效果，康復(fù)訓(xùn)練可以促進(jìn)神經(jīng)功能的進(jìn)一步恢復(fù)，神經(jīng)調(diào)控技術(shù)可以調(diào)節(jié)大腦的功能活動(dòng)，這些方法與BMSCs移植相結(jié)合，有望產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步提高TBI的治療效果。還可以探索BMSCs的預(yù)處理方法，如基因修飾、細(xì)胞因子預(yù)處理等，以增強(qiáng)其治療效果和靶向性。通過(guò)對(duì)BMSCs進(jìn)行預(yù)處理，可以提高其在損傷部位的存活、歸巢和分化能力，增強(qiáng)其分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的能力，從而提高治療效果。六、結(jié)論6.1研究主要發(fā)現(xiàn)總結(jié)本研究通過(guò)對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠模型進(jìn)行不同途徑的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植，深入探究了不同移植途徑對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的影響，主要發(fā)現(xiàn)如下：不同移植途徑對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)影響顯著：在神經(jīng)功能損傷評(píng)分方面，腦內(nèi)移植組在移植后3天開始，神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）降低最為明顯，與靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著時(shí)間推移至14天和28天，腦內(nèi)移植組的mNSS評(píng)分顯著低于靜脈移植組和頸外動(dòng)脈移植組（P<0.01），且頸外動(dòng)脈移植組的神經(jīng)功能恢復(fù)效果優(yōu)于靜脈移植組（P<0.05）。這表明腦內(nèi)移植在促進(jìn)TBI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)方面效果最佳，頸外動(dòng)脈移植次之，靜脈移植相對(duì)較弱。腦組織形態(tài)學(xué)變