實驗一植物染色體壓片法第1頁，共36頁。二、實驗原理有絲分裂是體細(xì)胞分裂的主要方式，一般發(fā)生在植物根尖或莖尖的分生組織中。在有絲分裂時，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有很大的變化，但以細(xì)胞核內(nèi)染色體的變化最為明顯，而且是有規(guī)律地進(jìn)行。各種生物染色體在數(shù)目上和形態(tài)上是相對恒定的，并隨科屬種的不同而具有一定的特征。洋蔥體細(xì)胞中有8對共16條染色體，在有絲分裂過程中，每個染色體能復(fù)制一份，然后分配到兩個子細(xì)胞中，所以兩個子細(xì)胞與母細(xì)胞所含的染色體在數(shù)目、形態(tài)和性質(zhì)上都是相同的。在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，人們常常需要了解某一物種的染色體數(shù)目，而最有效的方法就是觀察細(xì)胞有絲分裂的中期，這樣能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。第2頁，共36頁。三、實驗用品（一）材料大蒜（Aillumsativum）、洋蔥（Aillumcepa、2n=16）根尖或蠶豆（Viciafaba、2n=12）根尖（二）器材顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖針、刀片、試劑瓶、指管（或小培養(yǎng)皿）、冰箱、培養(yǎng)箱、吸水紙。（三）試劑70%乙醇、45%冰醋酸、對二氯苯飽和水溶液、0.2%秋水仙素溶液、卡諾氏固定液（甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份）、改良苯酚品紅染色液、鹽酸酒精離析液（濃鹽酸：95%乙醇=1：1）、叔丁醇、二甲苯、95%乙醇、尤派膠或中性樹膠。第3頁，共36頁。四、實驗方法和說明（一）生根用刀片將洋蔥的老根削去露出鱗基，然后將鱗基置于盛水的小燒杯上，放在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待根長到2cm左右時，在上午九時切下根尖進(jìn)行下一步處理。植物細(xì)胞分裂周期的長短不盡相同，通常在十到幾十小時之間，溫度明顯地影咱分裂周期，對于一個不太熟悉的實驗材料，最好在特定溫度下生根，掌握有絲分裂高峰期，以使得到更多的處于有絲分裂中期的細(xì)胞。第4頁，共36頁。第5頁，共36頁。（二）預(yù)處理

把根尖放到對二氯苯飽和水溶液，或0.02％秋水仙素溶液中，浸泡處理3—4小時。預(yù)處理是為了有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數(shù)，一般在固定之前應(yīng)用理化因素進(jìn)行預(yù)處理，這樣可以改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制或破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散等。通常是在分裂高峰前，把根尖浸泡到藥劑中處理3～4小時以上。第6頁，共36頁。①低溫預(yù)處理：低溫處理可以引起染色體的縮短并可獲得較多的中期分裂相，而且此法無須使用任何藥物，安全性高。但不同的植物所需的預(yù)處理溫度是有差異的，如小麥的處理溫度為1～5℃，水稻和玉米則需6～8℃，剪下的根尖置于盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，放入冰箱中低溫預(yù)處理20～40h。第7頁，共36頁。②秋水仙素（colchicine）：是從百合科植物秋水仙的種子和鱗莖中提取的一種生物堿。它的分子式為C22H25NO6。純的秋水仙素為針狀結(jié)晶，一般商品秋水仙素為淡黃色粉末。熔點為155℃，味苦。易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，但在熱水中溶解度較低，不易溶于苯和乙醚。秋水仙素毒性極強(qiáng)，可以導(dǎo)致眼睛暫時失明和使中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹而導(dǎo)致呼吸困難。在使用過程中要特別注意安全，同時要做好藥品的管理工作。一般認(rèn)為秋水仙素對紡綞絲有麻痹和毒害作用，也有人認(rèn)為秋水仙素通過抑制ATP的機(jī)制從而破壞紡綞絲的形成及活動。處理后的染色體收縮較直，有利于對染色體結(jié)構(gòu)的研究。秋水仙素水溶液的作用效果與其濃度成正比，濃度越高，作用效果越強(qiáng)。通常用0.05%～0.2%的秋水仙溶液處理2～4h。第8頁，共36頁。③飽和對二氯苯（p-Dichlorobenzene）：其分子式為C6H4Cl2，無色結(jié)晶，具有特殊的臭味，常溫下可升華。易溶于乙醇、乙醚、苯等有機(jī)溶劑，難溶于水，易燃而且有毒。由于對二氯苯難溶于水，所以一般用它的飽和水溶液，它的作用效果與秋水仙素相似，但價格卻低得多，便于廣泛使用。室溫下處理3～5h，此法特別適于染色體小而多的植物，計數(shù)染色體制片效果最好。第9頁，共36頁。④8-羥基喹啉（8-Hydroxyquinolin）：其分子式為C9H7NO，為白色結(jié)晶或粉末，溶于酒精而難溶于水。8-羥基喹啉的作用機(jī)制，一般認(rèn)為它首先引起細(xì)胞質(zhì)粘度的改變，結(jié)果導(dǎo)致紡綞體的活動受阻。所用濃度范圍是0.002～0.004M之間，特別適用于具有較大染色體的植物。它的優(yōu)點是經(jīng)它處理后，可使中期染色體在赤道面上保持其相應(yīng)的排列位置，另一優(yōu)點是處理后的縊痕區(qū)較為清晰。下表為不同材料采用不同預(yù)處理方法獲得的效果，供參考。第10頁，共36頁。植物名稱染色體數(shù)(2n）

處理因素

處理時間

溫度

效果*

小麥

42

0.2%秋水仙素水溶液

9:00-11:00

25℃

+++

小麥

42

對二氯苯飽和水溶液

10:00-14:00

室溫

+++

小麥

42

1～4℃冰箱

20-24小時

1～4℃

+++

小黑麥

56

對二氯苯飽和水溶液

10:00-14:00

室溫

+++

豌豆

14

對二氯苯飽和水溶液

10:00-11:30

室溫

+++

煙草

48

對二氯苯飽和水溶液

8:30-11:30

室溫

+++

蠶豆

12

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

20:00-23:00

室溫

+++

蠶豆

12

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

14:30-17:30

8℃

+++

洋蔥

16

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

7:30-11:30

15℃

+++

茄子

24

0.002M8-羥基喹啉

9:00-13:00

15℃

+++

大麥

14

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

8:00-11:00

25℃

++*+++優(yōu)++良。第11頁，共36頁。（三）固定

固定時，將根尖投入固定液中室溫處理3～24小時。材料若不及時用，可經(jīng)過90%酒精和70%酒精浸洗一次，再換入新的70%酒精中，置于冰箱內(nèi)0～4℃保存?zhèn)溆?。?jīng)過較長時間保存的材料，在進(jìn)行觀察前可用固定液再處理一次，效果較好。通常采用的固定液是卡諾氏固定液。固定的目的是借助于物理的或化學(xué)藥劑的作用，迅速透入組織和細(xì)胞將之殺死；并使其結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上盡可能保持生活時的完整和真實狀態(tài)，同時更易于著色，可以較清楚的顯現(xiàn)細(xì)胞在生活是不易看清的結(jié)構(gòu)。第12頁，共36頁。第13頁，共36頁。（四）解離

將固定后（或保存后）的根尖分裝到指管內(nèi)，用清水洗幾次，吸干水，加入鹽酸酒精離析液，在室溫下水解10～20分鐘，解離成功的根尖，分生組織發(fā)白，伸長區(qū)已呈半透明，似爛狀。解離后的根尖用水輕洗2～3次，以利于著色。解離的目的是使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解，細(xì)胞壁軟化或部分分解，使細(xì)胞和染色體容易分散壓平，解離方法有酸解法和酶解法。第14頁，共36頁。第15頁，共36頁。第16頁，共36頁。（五）水洗經(jīng)解離的材料用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次。目的是沖去材料中的酸以利于染色。第17頁，共36頁。（六）染色

將解離后的根尖放在潔凈的載玻片上，切取其根尖分生組織（約1mm左右），剁成碎末，滴加改良苯酚品紅染色液染色10-15分鐘左右。改良苯酚品紅染液：是近年來觀察植物染色體時新使用的比較理想的染色劑，優(yōu)點較多，使用方便。配法順序如下：原液A：取3克堿性品紅溶于100毫升70%酒精中，此液可以長期保存。原液B：取A液10毫升加入90毫升5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周內(nèi)使用)。原液C：取B液55毫升加入6毫升的冰醋酸和6毫升38%的甲醛(可長期保存)。染色液：取C液10-20毫升，加入90-80毫升45%醋酸和1.5克山梨醇。放置2周后使用，染色效果顯著，可普遍用于植物組織的壓片法和涂片法，使用2-3年不變質(zhì)。山梨醇為助滲劑，兼有穩(wěn)定染色液的作用。如果沒有山梨醇，也能染色，但效果稍差。改良苯酚品紅染色液對果蠅唾液腺染色體的染色效果與醋酸染洋紅染色液的染色效果是相同的。而且用改良苯酚品紅染色液還能提高工效，簡易節(jié)約的優(yōu)點。第18頁，共36頁。第19頁，共36頁。第20頁，共36頁。第21頁，共36頁。（九）永久裝片把壓好的玻片標(biāo)本，放在冰箱冷藏箱里凍結(jié)。然后用刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，用電吹風(fēng)把玻片吹干后，滴上油派膠加上蓋玻片封片，或經(jīng)二甲苯透明后，滴中性樹膠，加蓋玻片封片，做成永久封片。第22頁，共36頁。五、作業(yè)1．繪有絲分裂中期或后期細(xì)胞圖像。2．在你觀察的細(xì)胞分裂過程中，哪些分裂時期最多？3．根據(jù)你的實驗情況總結(jié)出制備好一張優(yōu)良的細(xì)胞分裂標(biāo)本應(yīng)注意哪些問題?第23頁，共36頁。第