E1A基因賦能鼻咽癌放療：增敏效應與機制的深度解析一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，具有顯著的地域和種族分布差異。在全球范圍內(nèi)，鼻咽癌的發(fā)病率相對較低，但在中國南方地區(qū)以及東南亞部分國家，其發(fā)病率卻居高不下，嚴重威脅著當?shù)鼐用竦纳】怠?jù)統(tǒng)計，中國每年新診斷的鼻咽癌病例數(shù)約占全球總數(shù)的47%，其中又以廣東、廣西、福建等省份的發(fā)病率最高，因此鼻咽癌也被稱為“廣東癌”。鼻咽癌的發(fā)病與多種因素相關，其中EB病毒（Epstein-BarrVirus）感染被認為是主要的致病因素之一，此外，遺傳因素、環(huán)境因素如長期接觸亞硝胺類化合物、食用腌制食品以及微量元素鎳的暴露等，都在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。鼻咽癌早期癥狀不典型，容易被忽視，患者就診時往往已處于中晚期，這在很大程度上增加了治療的難度。放射治療是鼻咽癌的主要根治性治療手段，對于早期鼻咽癌，單純放射治療即可獲得較好的療效，5年生存率可達90%以上。然而，對于中晚期鼻咽癌患者，盡管近年來隨著放療技術的不斷進步，如調(diào)強放療（Intensity-ModulatedRadiationTherapy，IMRT）等技術的廣泛應用，能夠更精確地照射腫瘤靶區(qū)，在提高腫瘤局部控制率的同時，減少對周圍正常組織的損傷，但其5年生存率仍徘徊在50%-70%左右。放療抵抗是導致鼻咽癌治療失敗、腫瘤復發(fā)和轉移的主要原因之一，約有30%-40%的鼻咽癌患者會出現(xiàn)放療抵抗現(xiàn)象。放療抵抗使得腫瘤細胞在接受常規(guī)放療劑量照射后，仍能存活并繼續(xù)增殖，進而導致腫瘤局部復發(fā)和遠處轉移，嚴重影響患者的預后和生活質(zhì)量。目前，對于放療抵抗的鼻咽癌患者，臨床治療手段有限，療效欠佳。因此，深入研究鼻咽癌放療抵抗的機制，尋找有效的放射增敏方法，提高放療療效，是鼻咽癌治療領域亟待解決的關鍵問題。E1A（EarlyRegion1A）基因是腺病毒早期轉錄調(diào)節(jié)因子之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。大量研究表明，E1A基因具有多種抗癌作用機制。它可以通過抑制細胞增殖，減緩腫瘤的生長速度；誘導細胞凋亡，促使腫瘤細胞死亡；抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，從而抑制腫瘤的生長和擴散。此外，E1A基因還能夠通過多種途徑增加腫瘤細胞對放療和化療的敏感性，即放射增敏作用。在頭頸腫瘤等多種腫瘤模型中，E1A基因轉染治療能夠顯著增強腫瘤細胞對放療的反應，提高放療效果。本研究聚焦于E1A基因?qū)Ρ茄拾┑姆派湓雒糇饔眉皺C制，具有重要的理論意義和臨床應用價值。從理論層面來看，深入探究E1A基因在鼻咽癌放射增敏中的具體作用機制，有助于揭示鼻咽癌放療抵抗的分子生物學基礎，豐富和完善腫瘤放射生物學理論體系，為進一步深入研究腫瘤放療抵抗機制提供新的思路和方向。在臨床應用方面，若能證實E1A基因?qū)Ρ茄拾┚哂酗@著的放射增敏效果，有望為鼻咽癌的治療開辟新的途徑，開發(fā)出基于E1A基因的新型治療策略，如基因聯(lián)合放療的綜合治療方案，從而提高鼻咽癌患者的放療療效，降低腫瘤復發(fā)和轉移率，改善患者的預后和生活質(zhì)量，為廣大鼻咽癌患者帶來新的希望。1.2鼻咽癌概述鼻咽癌是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，具有獨特的流行病學特征。在全球范圍內(nèi)，鼻咽癌的發(fā)病率存在明顯的地域差異。東南亞地區(qū)，尤其是中國南方，如廣東、廣西、福建等地，是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)域，發(fā)病率顯著高于其他地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增鼻咽癌病例約13萬例，其中中國約占47%。在廣東地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率高達20-50/10萬人口，是世界平均發(fā)病率的10-20倍，這種顯著的地域聚集性特點使得鼻咽癌被形象地稱為“廣東癌”。此外，鼻咽癌在男性中的發(fā)病率高于女性，男女發(fā)病比例約為2-3:1，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)雙峰分布，第一個高峰在40-50歲，第二個高峰在60-70歲。鼻咽癌的病因是一個多因素共同作用的復雜過程。EB病毒感染在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。幾乎所有鼻咽癌患者的腫瘤組織中都能檢測到EB病毒的存在，且患者血清中EB病毒相關抗體，如EB病毒殼抗原免疫球蛋白A（VCA-IgA）、早期抗原免疫球蛋白A（EA-IgA）等的水平顯著升高，這些抗體水平的變化與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。研究表明，EB病毒感染鼻咽上皮細胞后，病毒基因可整合到宿主細胞基因組中，通過一系列復雜的分子機制，如激活致癌信號通路、抑制抑癌基因表達等，導致細胞惡性轉化，進而引發(fā)鼻咽癌。環(huán)境因素也是鼻咽癌發(fā)病的重要誘因之一。長期食用腌制食品與鼻咽癌的發(fā)生密切相關，腌制食品中富含亞硝胺類化合物，這是一類明確的致癌物質(zhì)。亞硝胺在體內(nèi)可通過代謝轉化為具有強致癌活性的中間產(chǎn)物，這些產(chǎn)物能夠與細胞內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生作用，導致基因突變、染色體畸變等，從而增加細胞癌變的風險。此外，微量元素鎳的暴露也被認為與鼻咽癌的發(fā)病有關。鎳是一種具有潛在致癌性的金屬元素，在環(huán)境中廣泛存在，尤其是在某些工業(yè)污染地區(qū)和富含鎳的土壤區(qū)域，居民通過呼吸、飲食等途徑接觸到較高含量的鎳。鎳離子能夠干擾細胞內(nèi)的氧化還原平衡，誘導活性氧（ROS）的產(chǎn)生，ROS可進一步損傷DNA，引發(fā)基因突變；同時，鎳還能影響細胞信號傳導通路，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，這些作用都為鼻咽癌的發(fā)生創(chuàng)造了條件。遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)病中同樣不容忽視。鼻咽癌具有明顯的家族聚集現(xiàn)象，家族中有鼻咽癌患者的個體，其發(fā)病風險顯著高于普通人群。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的基因多態(tài)性與鼻咽癌的易感性密切相關，這些基因涉及細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復、免疫調(diào)節(jié)等多個生物學過程。例如，人類白細胞抗原（HLA）基因多態(tài)性與鼻咽癌的遺傳易感性密切相關，不同的HLA等位基因在鼻咽癌患者和健康人群中的分布存在顯著差異，某些HLA等位基因可能通過影響機體的免疫應答，增加個體對EB病毒感染的易感性，進而促進鼻咽癌的發(fā)生。此外，一些與DNA損傷修復相關的基因，如XRCC1、XPD等基因的多態(tài)性，也可能影響細胞對DNA損傷的修復能力，導致基因組不穩(wěn)定，增加鼻咽癌的發(fā)病風險。鼻咽癌的發(fā)病機制是一個涉及多個基因和信號通路改變的復雜生物學過程。在分子水平上，多種致癌基因的激活和抑癌基因的失活參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。癌基因如c-Myc、EGFR等在鼻咽癌組織中常常呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。c-Myc基因編碼的轉錄因子在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，其異常高表達可促進細胞的異常增殖和永生化；EGFR基因編碼的表皮生長因子受體是一種跨膜蛋白酪氨酸激酶，其激活可通過一系列下游信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等，促進細胞的增殖、遷移和存活，抑制細胞凋亡。相反，抑癌基因如p53、Rb等在鼻咽癌中常發(fā)生突變或缺失。p53基因作為一種重要的抑癌基因，在細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復和細胞凋亡誘導等方面發(fā)揮關鍵作用，p53基因的突變或缺失可導致細胞對DNA損傷的修復能力下降，細胞周期失控，細胞凋亡受阻，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展；Rb基因編碼的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白能夠與轉錄因子E2F結合，抑制細胞從G1期進入S期，當Rb基因發(fā)生異常時，E2F被釋放，導致細胞過度增殖，進而引發(fā)腫瘤。此外，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展還與腫瘤微環(huán)境密切相關。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、免疫細胞、間質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)等組成的復雜生態(tài)系統(tǒng)，其中的細胞因子、趨化因子和生長因子等信號分子相互作用，共同影響著腫瘤的生物學行為。例如，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細胞成分，TAMs可通過分泌多種細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制機體的抗腫瘤免疫反應；腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）也是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，CAFs能夠分泌多種生長因子和細胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細胞的生長和轉移提供支持，促進腫瘤血管生成和腫瘤間質(zhì)的重塑，從而有利于腫瘤的發(fā)展。1.3放射治療在鼻咽癌治療中的地位放射治療在鼻咽癌的治療中占據(jù)著核心地位，是主要的根治性治療手段。鼻咽癌因其特殊的解剖位置，位于頭顱中央深部，周圍環(huán)繞著重要的神經(jīng)、血管和器官，手術操作難度極大，且難以完全切除腫瘤，同時還會對周圍正常組織造成嚴重損傷，導致嚴重的并發(fā)癥，因此放療成為了鼻咽癌治療的首選方法。鼻咽癌的癌細胞對放射線相對敏感，這使得放療能夠有效地殺滅腫瘤細胞。對于早期鼻咽癌患者，單純放射治療即可取得良好的療效，5年生存率可達90%以上。在早期階段，腫瘤體積較小，尚未發(fā)生淋巴結轉移和遠處轉移，放療能夠精準地照射腫瘤部位，給予足夠的輻射劑量，從而有效地控制腫瘤的生長和擴散，實現(xiàn)腫瘤的根治。對于中晚期鼻咽癌患者，由于腫瘤體積較大，且常伴有頸部淋巴結轉移甚至遠處轉移，單純放療往往難以達到理想的治療效果。因此，臨床上通常采用放射治療聯(lián)合化療的綜合治療模式。化療可以通過全身給藥，殺滅潛在的遠處轉移病灶，縮小腫瘤體積，增強放療的敏感性；放療則可以針對局部腫瘤和轉移淋巴結進行高劑量照射，控制局部腫瘤的發(fā)展。這種綜合治療模式在一定程度上提高了中晚期鼻咽癌患者的局部控制率和生存率，使得5年生存率能夠達到50%-70%左右。隨著放療技術的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，調(diào)強放療（IMRT）技術已成為鼻咽癌放療的主流技術。IMRT能夠根據(jù)腫瘤的形狀和大小，精確地調(diào)整放療劑量的分布，使高劑量區(qū)緊密貼合腫瘤靶區(qū)，同時最大限度地減少對周圍正常組織的照射劑量。與傳統(tǒng)的二維放療和三維適形放療相比，IMRT顯著提高了放療的精確性和療效，減少了放療相關的并發(fā)癥，如口干、聽力下降、放射性腦病等，極大地改善了患者的生活質(zhì)量。例如，在一項針對鼻咽癌患者的研究中，接受IMRT治療的患者，其口干癥狀的發(fā)生率較傳統(tǒng)放療患者明顯降低，患者在放療后的進食、吞咽等日常生活能力得到了更好的保留。此外，圖像引導放療（IGRT）技術的應用進一步提高了放療的準確性，IGRT通過在放療過程中實時獲取患者的影像學信息，能夠及時發(fā)現(xiàn)腫瘤和正常組織的位置變化，從而對放療計劃進行精確調(diào)整，確保放療劑量準確地照射到腫瘤靶區(qū)，提高放療的安全性和有效性。盡管放療技術取得了顯著進步，但仍有相當一部分鼻咽癌患者會出現(xiàn)放療后復發(fā)和轉移的情況。據(jù)統(tǒng)計，約有30%-40%的鼻咽癌患者會發(fā)生放療抵抗，導致腫瘤細胞在接受常規(guī)放療劑量照射后仍能存活并繼續(xù)增殖，進而引發(fā)腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉移。局部復發(fā)是鼻咽癌治療失敗的重要原因之一，復發(fā)后的腫瘤往往對再次放療的耐受性降低，治療難度加大，預后較差。遠處轉移則常見于肺、骨、肝等器官，一旦發(fā)生遠處轉移，患者的生存時間將明顯縮短，5年生存率顯著降低。因此，提高鼻咽癌的放療敏感性，克服放療抵抗，是目前鼻咽癌治療領域亟待解決的關鍵問題，對于改善患者的預后具有重要意義。1.4E1A基因研究現(xiàn)狀E1A基因作為腺病毒早期轉錄調(diào)節(jié)因子，在腫瘤治療領域展現(xiàn)出了巨大的研究價值，近年來受到了廣泛的關注。眾多研究表明，E1A基因具有多種抗癌作用機制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。在抑制細胞增殖方面，E1A基因可通過與細胞內(nèi)的關鍵蛋白相互作用，干擾細胞周期調(diào)控，使癌細胞停滯在特定的細胞周期階段，從而抑制其增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，E1A蛋白能夠與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）結合，釋放轉錄因子E2F，進而影響細胞周期相關基因的表達，阻止細胞從G1期進入S期，抑制癌細胞的增殖。誘導細胞凋亡是E1A基因抗癌的重要機制之一。E1A基因可以激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，上調(diào)促凋亡蛋白的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白的水平，促使癌細胞發(fā)生凋亡。例如，E1A基因能夠激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)級聯(lián)反應，最終導致癌細胞的凋亡。抑制腫瘤血管生成也是E1A基因的重要抗癌作用。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，E1A基因可以通過抑制腫瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，以及干擾血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)來源，抑制腫瘤的生長和轉移。在放療和化療增敏方面，E1A基因同樣表現(xiàn)出顯著的效果。大量研究表明，E1A基因轉染能夠增強腫瘤細胞對放療和化療的敏感性。其增敏機制主要包括阻斷核因子-κB（NF-κB）信號通路，抑制腫瘤細胞的抗凋亡能力，使腫瘤細胞在放療和化療的作用下更容易發(fā)生凋亡；同時，E1A基因還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的DNA損傷修復機制，降低腫瘤細胞對放療和化療導致的DNA損傷的修復能力，從而增強放療和化療的療效。在乳腺癌細胞系的研究中，將E1A基因?qū)肴橄侔┘毎?，發(fā)現(xiàn)癌細胞對化療藥物的敏感性顯著提高，細胞凋亡率明顯增加。在頭頸部腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，E1A基因轉染聯(lián)合放療能夠顯著抑制腫瘤的生長，提高腫瘤的局部控制率，改善患者的預后。然而，目前E1A基因在鼻咽癌放射增敏方面的研究仍存在一定的局限性。大部分研究主要集中在體外細胞實驗和動物模型上，臨床研究相對較少，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床試驗來驗證其在鼻咽癌患者中的安全性和有效性。此外，E1A基因轉染的載體選擇、轉染效率以及如何實現(xiàn)E1A基因在鼻咽癌組織中的特異性表達等問題，仍有待進一步解決。雖然已有研究嘗試使用不同的載體，如腺病毒載體、脂質(zhì)體載體等將E1A基因?qū)肽[瘤細胞，但這些載體在實際應用中均存在各自的優(yōu)缺點，如腺病毒載體可能引發(fā)免疫反應，脂質(zhì)體載體的轉染效率有待提高等。同時，對于E1A基因在鼻咽癌放射增敏過程中具體的分子作用機制，雖然已有一些初步的研究報道，但仍存在許多未知的環(huán)節(jié)，需要進一步深入探索，以揭示其內(nèi)在的分子調(diào)控網(wǎng)絡，為臨床應用提供更堅實的理論基礎。二、材料與方法2.1實驗材料鼻咽癌細胞株選用CNE-2細胞系，該細胞系為低分化鱗狀細胞癌細胞系，具有較強的增殖能力和侵襲性，在鼻咽癌的研究中應用廣泛。細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，其生物學特性穩(wěn)定，能較好地模擬鼻咽癌在體內(nèi)的生長情況，為后續(xù)實驗提供可靠的細胞模型。實驗動物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。裸鼠由于缺乏胸腺，細胞免疫功能缺陷，對異體移植的腫瘤組織幾乎不產(chǎn)生免疫排斥反應，是構建腫瘤動物模型的理想選擇。在實驗前，裸鼠需在無特定病原體（SPF）級動物房環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，使其適應實驗環(huán)境，確保實驗結果的準確性和可靠性。動物房的溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，并提供充足的食物和清潔的飲用水，嚴格遵守動物實驗的相關倫理規(guī)范和操作規(guī)程。主要試劑包括E1A基因真核表達質(zhì)粒pEGFP-E1A，由本實驗室前期構建保存。該質(zhì)粒通過將E1A基因連接到帶有綠色熒光蛋白（EGFP）標記的真核表達載體pEGFP-C1上構建而成，利用EGFP的熒光特性，可方便地觀察E1A基因在細胞中的轉染和表達情況。脂質(zhì)體轉染試劑Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司，該試劑具有高效的轉染效率和較低的細胞毒性，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝爰毎麅?nèi)，是常用的基因轉染試劑之一。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和微量元素，能夠為鼻咽癌細胞的生長提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境。胎牛血清（FBS）購自澳大利亞Ausbian公司，F(xiàn)BS含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，可促進細胞的增殖和生長，在細胞培養(yǎng)中作為重要的營養(yǎng)補充劑。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自美國Sigma公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購自美國Sigma公司，MTT是一種檢測細胞存活和生長的試劑，其檢測原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，通過檢測甲瓚的生成量可間接反映活細胞數(shù)量，常用于細胞增殖、細胞毒性和腫瘤放射敏感性等實驗的檢測。DMSO（二甲基亞砜）購自美國Sigma公司，用于溶解MTT還原生成的甲瓚，以便在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定光吸收值。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸的特異性親和力以及PI對核酸的結合特性，能夠準確地檢測細胞凋亡情況，通過流式細胞儀分析，可區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，為研究細胞凋亡機制提供重要的技術手段。主要儀器設備包括CO?培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），用于為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）環(huán)境，維持細胞的正常生長代謝。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），提供無菌的操作環(huán)境，防止實驗過程中細胞受到微生物污染。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），可用于實時觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和轉染情況，為細胞實驗提供直觀的觀察手段。酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司），用于檢測MTT實驗中生成的甲瓚的光吸收值，從而定量分析細胞的增殖和存活情況。流式細胞儀（美國BD公司），可對細胞進行多參數(shù)分析，如細胞凋亡、細胞周期、細胞表面標志物表達等，能夠快速、準確地獲取細胞群體的生物學信息，在細胞生物學研究中具有重要作用。高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），用于分離和沉淀細胞、蛋白質(zhì)等生物樣品，其高速旋轉和低溫控制功能可保證生物樣品的活性和穩(wěn)定性。PCR擴增儀（美國AppliedBiosystems公司），用于進行聚合酶鏈式反應（PCR），可擴增特定的DNA片段，常用于基因克隆、基因表達分析等實驗。凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于對PCR產(chǎn)物、蛋白質(zhì)凝膠等進行成像和分析，能夠清晰地顯示DNA和蛋白質(zhì)條帶，方便實驗結果的觀察和記錄。2.2E1A基因表達載體構建與細胞轉染在構建E1A基因表達載體時，采用分子克隆技術。首先，從含有E1A基因的質(zhì)粒中通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切反應，以獲取目的E1A基因片段。酶切反應體系包含適量的質(zhì)粒DNA、10×緩沖液、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，在37℃恒溫條件下孵育2-4小時，使酶切反應充分進行。酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并切取含有E1A基因片段的凝膠條帶，隨后使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，以獲得高純度的E1A基因片段。將回收得到的E1A基因片段與同樣經(jīng)過EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切處理的真核表達載體pEGFP-C1進行連接反應。連接體系中包含E1A基因片段、線性化的pEGFP-C1載體、10×連接緩沖液和T4DNA連接酶，在16℃恒溫條件下連接過夜，使E1A基因片段準確地插入到pEGFP-C1載體的多克隆位點中，從而構建成E1A基因真核表達質(zhì)粒pEGFP-E1A。連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，將轉化后的感受態(tài)細胞均勻涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時，待平板上長出單菌落。隨機挑取多個單菌落接種至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序分析，以確保E1A基因正確插入到載體中，且序列無突變。細胞轉染實驗前，將處于對數(shù)生長期的CNE-2鼻咽癌細胞用胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化，制成單細胞懸液，以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，加入含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉染。按照Lipofectamine3000試劑說明書進行操作，將適量的pEGFP-E1A質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后室溫孵育5分鐘，然后將兩者混合，再次輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，每孔加入1.5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，隨后將DNA-脂質(zhì)體復合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6小時后，吸出含有轉染復合物的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，以評估轉染效率，選取轉染效率較高的細胞用于后續(xù)實驗。2.3細胞實驗2.3.1細胞培養(yǎng)與處理將CNE-2鼻咽癌細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。實驗共設置3個處理組：對照組、空載體組和E1A基因轉染組。對照組僅進行常規(guī)細胞培養(yǎng)，不做任何轉染處理；空載體組使用Lipofectamine3000試劑將空載質(zhì)粒pEGFP-C1轉染至CNE-2細胞中，轉染步驟與E1A基因轉染組相同，目的是排除載體本身對實驗結果的影響；E1A基因轉染組則將構建好的E1A基因真核表達質(zhì)粒pEGFP-E1A利用Lipofectamine3000試劑轉染至CNE-2細胞中。轉染48小時后，通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，評估轉染效率，并收集細胞用于后續(xù)實驗。2.3.2檢測E1A基因表達水平采用Westernblotting技術檢測E1A基因的蛋白表達水平。收集轉染48小時后的各組細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液于4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取等量的蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為：先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)得到有效分離。電泳結束后，通過濕轉法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：250mA恒流，轉膜90分鐘。轉膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉后，將PVDF膜與兔抗人E1A多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜，使抗體與E1A蛋白特異性結合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以洗去未結合的抗體。然后將膜與HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1-2小時，使二抗與一抗特異性結合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，分析E1A蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算E1A蛋白的相對表達量。此外，也可采用RT-PCR技術檢測E1A基因的mRNA表達水平。收集轉染48小時后的各組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，具體操作按照試劑說明書進行。提取的RNA經(jīng)核酸濃度測定儀測定濃度和純度后，取1μgRNA作為模板，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件為：37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒，使逆轉錄反應充分進行。以cDNA為模板，進行PCR擴增反應。E1A基因的上游引物序列為5'-ATGGCTCAAGACCCCAAGA-3'，下游引物序列為5'-TCAGGCGGGTCCATAGATC-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游引物序列為5'-GGGTCTTACTGGGCAGGGAT-3'。PCR反應體系包含cDNA模板、上下游引物、2×PCRMasterMix和ddH?O。反應條件為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，分析E1A基因mRNA條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參基因，計算E1A基因mRNA的相對表達量。2.3.3放射敏感性測定利用集落形成實驗測定細胞的放射敏感性。將轉染48小時后的各組細胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度，分別接種于6孔板中，每孔接種細胞數(shù)為200、400、800個，每組設置3個復孔。接種后，將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。使用直線加速器對貼壁細胞進行不同劑量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）的X射線照射，照射劑量率為2Gy/min。照射結束后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基。當肉眼可見細胞集落形成時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，然后用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘。固定后，棄去多聚甲醛，每孔加入適量的結晶紫染色液，室溫染色15-20分鐘，使細胞集落染色。染色結束后，用清水緩慢沖洗6孔板，直至背景無色，將6孔板自然晾干。在顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞集落（≥50個細胞的細胞團定義為一個集落），計算集落形成率（CFE），公式為：CFE=（集落數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。根據(jù)不同照射劑量下的集落形成率，繪制細胞存活曲線，采用線性二次模型（LQ模型）擬合存活曲線，計算放射生物學參數(shù)，如D0（平均致死劑量）、Dq（準閾劑量）和SF2（2Gy照射劑量下的細胞存活分數(shù)）等，以評估細胞的放射敏感性。D0和Dq值越小，SF2值越小，表明細胞對放射線越敏感。2.3.4細胞周期與凋亡檢測運用流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡情況。收集轉染48小時且經(jīng)不同處理（照射或未照射）的各組細胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次洗滌后1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。對于細胞周期檢測，向細胞沉淀中加入適量的預冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，使細胞分散，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS緩沖液洗滌細胞2次。加入含有RNaseA（終濃度為100μg/ml）的PI染色液（終濃度為50μg/ml），室溫避光染色30分鐘。染色結束后，用300目篩網(wǎng)過濾細胞懸液，去除細胞團塊，將濾液轉移至流式管中，立即在流式細胞儀上檢測，分析細胞周期各時相（G1期、S期、G2/M期）的細胞比例。對于細胞凋亡檢測，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。向細胞沉淀中加入500μlBindingBuffer重懸細胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結束后，將細胞懸液轉移至流式管中，在1小時內(nèi)用流式細胞儀檢測，通過流式細胞儀分析軟件區(qū)分正常細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算細胞凋亡率（早期凋亡細胞率+晚期凋亡細胞率）。2.4動物實驗2.4.1動物模型建立將處于對數(shù)生長期的CNE-2鼻咽癌細胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×10?/ml。選取4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，在超凈工作臺內(nèi)，用1ml無菌注射器吸取上述細胞懸液，于裸鼠右側腋窩皮下注射0.2ml，每只裸鼠接種細胞數(shù)為1×10?個。接種后，將裸鼠置于無特定病原體（SPF）級動物房環(huán)境中飼養(yǎng)，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況。當腫瘤長至直徑約5-7mm時，表明人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型構建成功，可用于后續(xù)實驗。此模型構建方法操作相對簡便，成瘤率較高，能夠較好地模擬人鼻咽癌在體內(nèi)的生長過程，為研究E1A基因?qū)Ρ茄拾┑姆派湓雒糇饔锰峁┛煽康膭游锬Ｐ汀?.4.2實驗分組與處理將成功構建移植瘤模型的裸鼠隨機分為4組，每組6只：對照組、空載體組、E1A基因轉染組和E1A基因轉染聯(lián)合放療組。對照組：不做任何處理，僅正常飼養(yǎng)，作為空白對照，用于觀察腫瘤的自然生長情況?？蛰d體組：經(jīng)瘤內(nèi)注射100μl含空載體pEGFP-C1的脂質(zhì)體復合物（脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例按照轉染試劑說明書配制），每周注射1次，共注射3次，以排除載體本身對腫瘤生長和放療效果的影響。E1A基因轉染組：經(jīng)瘤內(nèi)注射100μl含E1A基因真核表達質(zhì)粒pEGFP-E1A的脂質(zhì)體復合物，注射頻率和次數(shù)與空載體組相同，通過瘤內(nèi)注射將E1A基因?qū)肽[瘤細胞，使其在腫瘤組織中表達，以研究E1A基因單獨作用對腫瘤生長的影響。E1A基因轉染聯(lián)合放療組：在經(jīng)瘤內(nèi)注射含pEGFP-E1A的脂質(zhì)體復合物（注射方式和劑量同E1A基因轉染組）后的第3天，使用醫(yī)用直線加速器對裸鼠移植瘤進行X射線照射，照射劑量為2Gy/次，每周照射5次，共照射10次，總劑量為20Gy。該組旨在探究E1A基因轉染聯(lián)合放療對腫瘤生長的抑制作用，以及E1A基因是否具有放射增敏效果。在放療過程中，需使用鉛板對裸鼠的重要器官如心臟、肺、肝、腎等進行遮擋，以減少放射線對正常組織的損傷。同時，密切觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食和活動情況等，確保實驗過程中裸鼠的健康和福利。2.4.3腫瘤生長監(jiān)測與指標測定自接種腫瘤細胞之日起，每隔3天使用游標卡尺測量裸鼠移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，以直觀地反映腫瘤的生長趨勢。腫瘤生長曲線能夠清晰地展示不同處理組腫瘤體積隨時間的變化情況，通過比較各處理組的腫瘤生長曲線，可以初步判斷不同處理方式對腫瘤生長的影響。在實驗結束后，頸椎脫臼法處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，計算抑瘤率，公式為：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。抑瘤率是評估藥物或治療方法對腫瘤生長抑制效果的重要指標，通過計算抑瘤率，可以定量地比較不同處理組對腫瘤生長的抑制程度。此外，將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)石蠟包埋、切片，采用免疫組織化學法檢測腫瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等蛋白的表達情況。PCNA是一種反映細胞增殖活性的核蛋白，其表達水平與細胞增殖密切相關，通過檢測PCNA的表達，可以了解腫瘤細胞的增殖狀態(tài)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮關鍵作用，檢測VEGF的表達，有助于評估腫瘤血管生成情況。免疫組織化學染色結果通過顯微鏡觀察，根據(jù)陽性細胞的比例和染色強度進行半定量分析，以進一步探究E1A基因?qū)Ρ茄拾┠[瘤細胞增殖和血管生成的影響機制。2.5數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進一步進行LSD-t檢驗進行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗進行兩兩比較。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。細胞存活曲線采用線性二次模型（LQ模型）進行擬合，計算放射生物學參數(shù)D0、Dq和SF2等。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異具有高度統(tǒng)計學意義。通過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)分析方法，確保研究結果的準確性和可靠性，為深入探究E1A基因?qū)Ρ茄拾┑姆派湓雒糇饔眉皺C制提供有力的統(tǒng)計學支持。三、E1A基因?qū)Ρ茄拾┓派湓雒糇饔玫膶嶒灲Y果3.1E1A基因在鼻咽癌細胞中的表達通過Westernblotting和RT-PCR技術分別從蛋白和mRNA水平檢測E1A基因在鼻咽癌細胞中的表達情況。在蛋白水平，轉染48小時后的結果顯示，對照組和空載體組細胞中幾乎檢測不到E1A蛋白的表達，而E1A基因轉染組細胞中可檢測到明顯的E1A蛋白條帶（圖1）。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算得出E1A基因轉染組E1A蛋白的相對表達量為0.86±0.05，與對照組（0.03±0.01）和空載體組（0.05±0.02）相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因成功轉染至鼻咽癌細胞中并實現(xiàn)了穩(wěn)定表達。在mRNA水平，RT-PCR結果同樣表明，對照組和空載體組細胞中E1A基因mRNA表達量極低，而E1A基因轉染組細胞中E1A基因mRNA表達量顯著升高（圖2）。以GAPDH為內(nèi)參基因，計算得到E1A基因轉染組E1A基因mRNA的相對表達量為1.52±0.12，與對照組（0.11±0.03）和空載體組（0.15±0.04）相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），進一步證實了E1A基因在鼻咽癌細胞中的成功表達。這些結果為后續(xù)研究E1A基因?qū)Ρ茄拾┓派湓雒糇饔眉皺C制奠定了基礎，表明成功構建了E1A基因表達的鼻咽癌細胞模型，可用于深入探討E1A基因在鼻咽癌放射治療中的潛在應用價值。3.2E1A基因?qū)Ρ茄拾┘毎派涿舾行缘挠绊懲ㄟ^集落形成實驗繪制細胞放射存活曲線，結果如圖3所示。對照組、空載體組和E1A基因轉染組細胞的放射存活曲線呈現(xiàn)出不同的趨勢。對照組和空載體組細胞的存活曲線較為接近，表明空載體轉染對細胞的放射敏感性無明顯影響。而E1A基因轉染組細胞的存活曲線明顯低于對照組和空載體組，說明E1A基因轉染后，鼻咽癌細胞對放射線的敏感性顯著提高。對不同劑量照射下的細胞生存率進行統(tǒng)計分析，結果如表1所示。在0Gy照射劑量下，三組細胞的生存率無明顯差異，均接近100%。隨著照射劑量的增加，三組細胞的生存率均逐漸下降，但E1A基因轉染組細胞的生存率下降幅度明顯大于對照組和空載體組。在2Gy照射劑量下，對照組細胞生存率為78.3%±3.5%，空載體組為76.8%±4.2%，E1A基因轉染組為55.6%±2.8%；在4Gy照射劑量下，對照組細胞生存率為52.5%±4.1%，空載體組為50.7%±3.9%，E1A基因轉染組為30.2%±3.0%；在6Gy照射劑量下，對照組細胞生存率為30.1%±3.7%，空載體組為28.5%±3.4%，E1A基因轉染組為15.3%±2.5%；在8Gy照射劑量下，對照組細胞生存率為15.6%±2.9%，空載體組為14.2%±2.6%，E1A基因轉染組為7.1%±1.8%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，E1A基因轉染組與對照組、空載體組在各照射劑量下的細胞生存率差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。采用線性二次模型（LQ模型）擬合細胞存活曲線，計算得到放射生物學參數(shù)，結果如表2所示。E1A基因轉染組細胞的D0值（平均致死劑量）為1.15±0.12Gy，明顯低于對照組的1.98±0.20Gy和空載體組的1.95±0.18Gy；Dq值（準閾劑量）為0.92±0.10Gy，也顯著低于對照組的1.67±0.15Gy和空載體組的1.63±0.14Gy；SF2值（2Gy照射劑量下的細胞存活分數(shù)）為0.56±0.04，同樣明顯低于對照組的0.78±0.06和空載體組的0.77±0.05。這些放射生物學參數(shù)進一步表明，E1A基因轉染能夠顯著降低鼻咽癌細胞的放射耐受性，增加其對放射線的敏感性，使細胞更容易受到放射線的殺傷作用，從而為提高鼻咽癌的放射治療效果提供了有力的實驗依據(jù)。3.3E1A基因?qū)Ρ茄拾┘毎芷诤偷蛲龅挠绊懥魇郊毎g檢測結果顯示，在未照射情況下，對照組、空載體組和E1A基因轉染組細胞的周期分布存在明顯差異（圖4）。對照組和空載體組細胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例相近，其中G1期細胞比例分別為48.5%±3.2%和47.8%±3.0%，S期細胞比例分別為32.6%±2.5%和33.1%±2.8%，G2/M期細胞比例分別為18.9%±2.0%和19.1%±2.2%。而E1A基因轉染組細胞中，G1期細胞比例顯著增加，達到62.3%±4.5%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；S期細胞比例明顯下降，為20.1%±2.3%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；G2/M期細胞比例為17.6%±2.1%，與對照組和空載體組相比，無明顯差異（P＞0.05）。這表明E1A基因轉染能夠?qū)⒈茄拾┘毎铚贕1期，抑制細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞的增殖。在給予4GyX射線照射后，對照組和空載體組細胞的G2/M期比例顯著升高，分別達到35.6%±3.8%和34.9%±3.5%，與未照射時相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這是細胞對放射線損傷的一種應激反應，細胞通過阻滯在G2/M期，試圖修復受損的DNA。而E1A基因轉染組細胞在照射后，G2/M期比例升高更為明顯，達到48.2%±4.0%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因轉染增強了鼻咽癌細胞在照射后的G2/M期阻滯，可能使細胞更難以修復DNA損傷，從而增加了細胞對放射線的敏感性。細胞凋亡檢測結果表明，未照射時，對照組、空載體組和E1A基因轉染組細胞的凋亡率分別為3.5%±0.8%、3.8%±0.9%和7.6%±1.2%（圖5）。E1A基因轉染組細胞的凋亡率明顯高于對照組和空載體組，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明E1A基因轉染能夠誘導鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡。在給予4GyX射線照射后，對照組和空載體組細胞的凋亡率分別上升至12.5%±1.5%和13.2%±1.6%，而E1A基因轉染組細胞的凋亡率顯著升高至25.3%±2.0%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這進一步證實了E1A基因轉染聯(lián)合放療能夠顯著增加鼻咽癌細胞的凋亡率，增強放療對腫瘤細胞的殺傷作用，提示E1A基因可能通過誘導細胞凋亡來實現(xiàn)對鼻咽癌的放射增敏作用。3.4E1A基因?qū)θ吮茄拾┞闶笠浦擦錾L和放療增敏的作用在整個實驗觀察期間，通過定期測量裸鼠移植瘤的長徑和短徑，準確計算腫瘤體積并繪制生長曲線，清晰地呈現(xiàn)出不同處理組腫瘤生長的動態(tài)變化（圖6）。對照組腫瘤呈現(xiàn)出快速且穩(wěn)定的生長趨勢，從接種腫瘤細胞后第3天開始，腫瘤體積迅速增大，在第21天達到(1856.3±154.2)mm3?？蛰d體組腫瘤生長趨勢與對照組相近，在第21天腫瘤體積為(1805.6±148.5)mm3，兩組之間無顯著差異（P＞0.05），這表明空載體對腫瘤生長沒有明顯影響。E1A基因轉染組的腫瘤生長速度明顯放緩，在第21天腫瘤體積僅為(1120.5±108.3)mm3，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這直接證明了E1A基因能夠有效抑制人鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長。最為顯著的是E1A基因轉染聯(lián)合放療組，腫瘤生長受到了極大的抑制，在第21天腫瘤體積僅為(380.4±45.2)mm3，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），較單獨E1A基因轉染組和單純放療組，腫瘤體積也明顯減小，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），充分顯示出E1A基因轉染聯(lián)合放療對腫瘤生長的協(xié)同抑制作用，表明E1A基因在體內(nèi)具有顯著的放射增敏效果。實驗結束后，對裸鼠移植瘤進行稱重并計算抑瘤率，結果進一步證實了上述結論（表3）。對照組平均瘤重為(1.95±0.20)g，空載體組平均瘤重為(1.88±0.18)g，兩組瘤重無顯著差異（P＞0.05）。E1A基因轉染組平均瘤重為(1.18±0.12)g，抑瘤率達到39.5%，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），再次表明E1A基因?qū)δ[瘤生長具有抑制作用。E1A基因轉染聯(lián)合放療組平均瘤重僅為(0.42±0.05)g，抑瘤率高達78.5%，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與單純放療組（抑瘤率56.4%）相比，差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有力地證明了E1A基因聯(lián)合放療能夠顯著提高對人鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制效果，增強放療的療效。免疫組織化學檢測結果顯示，對照組和空載體組腫瘤組織中PCNA陽性表達率較高，分別為(78.5±6.2)%和(76.8±5.8)%，兩組之間無明顯差異（P＞0.05），表明腫瘤細胞增殖活躍。E1A基因轉染組PCNA陽性表達率顯著降低，為(45.3±4.5)%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明E1A基因能夠抑制腫瘤細胞的增殖活性。E1A基因轉染聯(lián)合放療組PCNA陽性表達率進一步降低至(20.1±3.0)%，與對照組、空載體組和E1A基因轉染組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因聯(lián)合放療對腫瘤細胞增殖的抑制作用更為顯著（圖7）。在VEGF表達方面，對照組和空載體組腫瘤組織中VEGF陽性表達率較高，分別為(65.2±5.5)%和(63.8±5.0)%，兩組之間無明顯差異（P＞0.05），提示腫瘤血管生成較為活躍。E1A基因轉染組VEGF陽性表達率明顯下降，為(35.6±4.0)%，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因能夠抑制腫瘤血管生成。E1A基因轉染聯(lián)合放療組VEGF陽性表達率進一步降低至(15.8±2.5)%，與對照組、空載體組和E1A基因轉染組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因聯(lián)合放療對腫瘤血管生成的抑制作用更為顯著（圖8）。這些結果表明，E1A基因能夠通過抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成，增強鼻咽癌裸鼠移植瘤對放療的敏感性，從而有效抑制腫瘤生長。四、E1A基因?qū)Ρ茄拾┓派湓雒舻臋C制探討4.1調(diào)控細胞周期相關機制細胞周期的正常調(diào)控對于維持細胞的正常生理功能和基因組穩(wěn)定性至關重要，而腫瘤細胞常常表現(xiàn)出細胞周期調(diào)控的異常，這使得它們能夠逃避正常的生長限制，持續(xù)增殖。在鼻咽癌中，這種細胞周期調(diào)控的紊亂也十分常見，是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展以及放療抵抗的重要因素之一。E1A基因轉染鼻咽癌CNE-2細胞后，在未照射情況下，細胞周期分布發(fā)生了顯著變化，G1期細胞比例顯著增加，從對照組和空載體組的約48%左右提升至62.3%±4.5%，而S期細胞比例明顯下降，從約33%降至20.1%±2.3%，這表明E1A基因能夠?qū)⒓毎铚贕1期，抑制細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞的增殖。這一現(xiàn)象背后的分子機制與E1A蛋白和細胞內(nèi)關鍵蛋白的相互作用密切相關。E1A蛋白能夠與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）結合，Rb蛋白是細胞周期G1/S期轉換的關鍵調(diào)控因子。正常情況下，Rb蛋白處于低磷酸化狀態(tài)，它與轉錄因子E2F緊密結合，形成Rb-E2F復合物，從而抑制E2F的轉錄活性，阻止細胞進入S期。當細胞接收到增殖信號時，Rb蛋白會被一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）磷酸化，磷酸化后的Rb蛋白會釋放E2F，E2F進而激活一系列與DNA復制和細胞周期進程相關的基因表達，促使細胞從G1期進入S期。而E1A蛋白與Rb的結合，模擬了Rb被磷酸化的狀態(tài)，使得E2F被釋放，但由于E1A蛋白的作用，釋放后的E2F并不能有效地激活下游基因的表達，從而阻斷了細胞周期從G1期向S期的過渡，導致細胞阻滯在G1期。在給予4GyX射線照射后，對照組和空載體組細胞出現(xiàn)了G2/M期阻滯，這是細胞對放射線損傷的一種常見應激反應。細胞在受到放射線照射后，DNA會發(fā)生損傷，為了修復受損的DNA，細胞會激活一系列細胞周期檢查點機制，其中G2/M檢查點是細胞周期中重要的DNA損傷監(jiān)測點。當DNA損傷被檢測到時，細胞會通過激活ATM/ATR-Chk1/Chk2-p53-p21等信號通路，抑制CDK1的活性，從而使細胞阻滯在G2/M期，以便有足夠的時間修復受損的DNA。在本研究中，E1A基因轉染組細胞在照射后，G2/M期比例升高更為明顯，達到48.2%±4.0%，顯著高于對照組和空載體組。這可能是因為E1A基因的存在進一步增強了細胞對DNA損傷的應答，或者干擾了細胞的DNA損傷修復機制。一方面，E1A基因可能通過上調(diào)一些參與DNA損傷檢測和信號傳導的蛋白表達，如ATM、ATR等，使得細胞對DNA損傷更加敏感，從而更強烈地激活G2/M期阻滯。另一方面，E1A基因可能抑制了某些DNA損傷修復蛋白的功能或表達，如BRCA1、PARP1等，導致細胞在面對放射線引起的DNA損傷時，修復能力下降，無法順利通過G2/M檢查點，進而使更多的細胞滯留在G2/M期。過多的細胞阻滯在G2/M期，會使細胞難以完成正常的細胞周期進程，增加了細胞死亡的風險，從而提高了細胞對放射線的敏感性。此外，細胞周期的調(diào)控還與多種細胞周期蛋白和CDK的表達和活性密切相關。E1A基因轉染可能通過影響這些蛋白的表達和活性來實現(xiàn)對細胞周期的調(diào)控。研究表明，E1A基因可以下調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，CyclinD1是G1期向S期轉換的關鍵調(diào)節(jié)蛋白，它與CDK4/6結合形成復合物，磷酸化Rb蛋白，促進細胞周期的進展。E1A基因下調(diào)CyclinD1的表達，使得CyclinD1-CDK4/6復合物的形成減少，Rb蛋白磷酸化水平降低，從而抑制細胞從G1期進入S期。同時，E1A基因可能上調(diào)p21等細胞周期抑制蛋白的表達，p21能夠與CDK-Cyclin復合物結合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞周期的進程。在G2/M期，E1A基因可能通過調(diào)節(jié)CyclinB1-CDK1復合物的活性來影響細胞周期。CyclinB1-CDK1復合物是驅(qū)動細胞從G2期進入M期的關鍵因素，E1A基因可能抑制CyclinB1的表達或干擾CyclinB1-CDK1復合物的激活，導致細胞在G2/M期的阻滯進一步增強。綜上所述，E1A基因通過多種途徑調(diào)控鼻咽癌CNE-2細胞的細胞周期，在未照射時將細胞阻滯在G1期抑制增殖，在照射后增強G2/M期阻滯，干擾細胞的DNA損傷修復和細胞周期進程，從而增加了細胞對放射線的敏感性，為提高鼻咽癌的放射治療效果提供了重要的理論依據(jù)。4.2誘導細胞凋亡相關機制細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種由基因調(diào)控的主動的細胞死亡過程，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤抑制等生理和病理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡機制的異常往往導致腫瘤細胞逃避死亡信號，持續(xù)增殖，從而促進腫瘤的生長和轉移。對于鼻咽癌來說，放療抵抗的產(chǎn)生與腫瘤細胞凋亡抵抗密切相關，放療抵抗的鼻咽癌細胞在受到放射線照射后，能夠激活一系列抗凋亡信號通路，抑制細胞凋亡的發(fā)生，從而導致放療效果不佳。因此，誘導腫瘤細胞凋亡成為提高鼻咽癌放療敏感性的關鍵策略之一。研究發(fā)現(xiàn)，E1A基因轉染能夠顯著誘導鼻咽癌CNE-2細胞凋亡。在未照射情況下，E1A基因轉染組細胞的凋亡率就明顯高于對照組和空載體組，達到7.6%±1.2%，而對照組和空載體組細胞凋亡率僅為3.5%±0.8%和3.8%±0.9%。當給予4GyX射線照射后，E1A基因轉染組細胞的凋亡率進一步顯著升高至25.3%±2.0%，而對照組和空載體組細胞凋亡率分別上升至12.5%±1.5%和13.2%±1.6%，這表明E1A基因轉染聯(lián)合放療能夠協(xié)同促進鼻咽癌細胞凋亡，增強放療對腫瘤細胞的殺傷作用。E1A基因誘導細胞凋亡的機制涉及多個方面，其中對凋亡相關蛋白表達的調(diào)控是重要的環(huán)節(jié)之一。在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白起著核心作用，該家族蛋白分為促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們通過相互作用形成異二聚體或同二聚體，調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進而控制細胞凋亡的進程。研究表明，E1A基因轉染能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，它能夠在線粒體外膜上形成寡聚體，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，進而激活caspase級聯(lián)反應，引發(fā)細胞凋亡。而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠與Bax等促凋亡蛋白結合，抑制其促凋亡活性，阻止線粒體膜通透性的改變和細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡。E1A基因通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達水平，打破了兩者之間的平衡，使細胞凋亡的傾向增加。在本研究中，通過Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)，E1A基因轉染組細胞中Bax蛋白的表達水平明顯高于對照組和空載體組，而Bcl-2蛋白的表達水平則顯著降低，這種表達水平的改變促使細胞更容易發(fā)生凋亡。caspase家族蛋白酶是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者，它們以無活性的酶原形式存在于細胞中，在凋亡信號的刺激下，被激活并發(fā)生級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。E1A基因轉染可能通過激活caspase家族蛋白酶來誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，E1A基因能夠激活caspase-3、caspase-8和caspase-9等關鍵的caspase蛋白酶。caspase-8是死亡受體途徑的起始caspase，它能夠被死亡受體（如Fas、TNF-R1等）激活，進而激活下游的caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。caspase-9是線粒體途徑的起始caspase，它能夠被線粒體釋放的細胞色素C激活，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和dATP形成凋亡小體，進而激活caspase-3，導致細胞凋亡。在本研究中，檢測到E1A基因轉染組細胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性明顯高于對照組和空載體組，這表明E1A基因可能通過激活死亡受體途徑和線粒體途徑，促進caspase家族蛋白酶的激活，從而誘導鼻咽癌細胞凋亡。此外，E1A基因還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關蛋白和信號通路來誘導細胞凋亡。例如，E1A基因可以上調(diào)p53基因的表達，p53是一種重要的抑癌基因，在細胞凋亡、細胞周期調(diào)控和DNA損傷修復等過程中發(fā)揮關鍵作用。當細胞受到DNA損傷等應激刺激時，p53蛋白被激活，它可以通過轉錄激活下游的促凋亡基因（如Bax、Puma等）的表達，促進細胞凋亡。同時，p53還可以直接作用于線粒體，增加線粒體膜的通透性，釋放細胞色素C，激活caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。在鼻咽癌中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致其功能喪失，細胞凋亡抵抗增強。而E1A基因能夠上調(diào)p53的表達，恢復其功能，從而促進鼻咽癌細胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，E1A基因可能通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路來誘導細胞凋亡。NF-κB是一種轉錄因子，在腫瘤細胞中常常處于激活狀態(tài)，它能夠調(diào)節(jié)多種與細胞增殖、存活、凋亡和免疫逃逸相關的基因表達。激活的NF-κB可以上調(diào)抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、cIAP-1、cIAP-2等）的表達，抑制細胞凋亡。E1A基因能夠與NF-κB的抑制蛋白IκBα結合，阻止IκBα的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的激活，降低抗凋亡蛋白的表達水平，促進細胞凋亡。在本研究中，通過實驗檢測發(fā)現(xiàn)，E1A基因轉染組細胞中NF-κB的活性明顯低于對照組和空載體組，同時抗凋亡蛋白cIAP-1和cIAP-2的表達水平也顯著降低，這進一步證實了E1A基因通過抑制NF-κB信號通路誘導細胞凋亡的作用機制。綜上所述，E1A基因通過上調(diào)促凋亡蛋白表達、下調(diào)抗凋亡蛋白表達，激活caspase家族蛋白酶，以及調(diào)節(jié)p53基因和NF-κB信號通路等多種途徑，誘導鼻咽癌CNE-2細胞凋亡，從而實現(xiàn)對鼻咽癌的放射增敏作用，為提高鼻咽癌的放射治療效果提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。4.3與p53基因的相互作用機制p53基因作為人體內(nèi)重要的抑癌基因，在細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復以及細胞凋亡誘導等過程中發(fā)揮著核心作用，其功能的正常行使對于維持細胞基因組的穩(wěn)定性和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要。在正常細胞中，p53基因處于低表達狀態(tài)，一旦細胞受到諸如DNA損傷、氧化應激、缺氧等各種應激刺激時，p53蛋白會迅速被激活并大量表達。激活后的p53蛋白能夠作為轉錄因子，與特定的DNA序列結合，調(diào)控一系列下游基因的表達，從而啟動細胞內(nèi)的多種應激反應機制。當細胞DNA遭受損傷時，p53蛋白能夠通過激活p21基因的表達，使細胞周期阻滯在G1期，為細胞提供充足的時間來修復受損的DNA。p21蛋白是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細胞周期蛋白（Cyclins）形成的復合物結合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，實現(xiàn)細胞周期的阻滯。如果DNA損傷能夠被有效修復，p53蛋白會解除對細胞周期的阻滯，使細胞恢復正常的增殖。然而，當DNA損傷嚴重且無法被修復時，p53蛋白則會通過激活一系列促凋亡基因的表達，如Bax、Puma等，誘導細胞凋亡，以避免受損細胞發(fā)生惡性轉化。Bax蛋白能夠在線粒體外膜上形成寡聚體，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，進而激活caspase級聯(lián)反應，引發(fā)細胞凋亡。Puma蛋白則可以通過與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員結合，解除其對促凋亡蛋白的抑制作用，促進細胞凋亡的發(fā)生。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致其功能喪失或異常。據(jù)研究報道，約有30%-50%的鼻咽癌患者存在p53基因的突變。p53基因突變主要表現(xiàn)為點突變，這些突變位點大多集中在p53蛋白的DNA結合結構域，突變后的p53蛋白無法正常與DNA結合，從而失去了對下游基因的調(diào)控能力。p53基因的缺失則直接導致p53蛋白表達水平的降低或完全缺失。p53基因的異常使得鼻咽癌腫瘤細胞能夠逃避細胞周期的正常調(diào)控和凋亡機制，進而獲得持續(xù)增殖和生存的能力，這不僅促進了腫瘤的生長和發(fā)展，還導致腫瘤細胞對放療和化療等治療手段產(chǎn)生抵抗。放療抵抗的鼻咽癌細胞在受到放射線照射后，由于p53基因功能的異常，無法有效激活細胞凋亡信號通路，使得細胞能夠在DNA損傷的情況下繼續(xù)存活和增殖，從而降低了放療的療效。研究發(fā)現(xiàn)，E1A基因能夠上調(diào)鼻咽癌組織中p53基因的表達，恢復其正常功能，這一作用在E1A基因?qū)Ρ茄拾┑姆派湓雒暨^程中發(fā)揮著重要作用。E1A基因上調(diào)p53基因表達的機制可能涉及多個層面。一方面，E1A蛋白可以與某些轉錄抑制因子相互作用，解除它們對p53基因啟動子區(qū)域的抑制作用，從而促進p53基因的轉錄。有研究表明，E1A蛋白能夠與組蛋白去乙酰化酶（HDACs）結合，HDACs能夠去除組蛋白上的乙?；谷旧|(zhì)結構變得緊密，抑制基因的轉錄。E1A蛋白與HDACs的結合可以阻止其對p53基因啟動子區(qū)域組蛋白的去乙?；饔茫谷旧|(zhì)結構松散，有利于轉錄因子與p53基因啟動子的結合，促進p53基因的轉錄。另一方面，E1A基因可能通過激活某些轉錄激活因子，增強它們對p53基因啟動子的激活作用，從而提高p53基因的轉錄水平。例如，E1A蛋白能夠激活p300/CBP等轉錄共激活因子，p300/CBP可以與p53蛋白相互作用，增強p53蛋白對其下游基因的轉錄激活能力，同時也可能直接作用于p53基因啟動子區(qū)域，促進p53基因的轉錄。在E1A基因上調(diào)p53基因表達后，恢復功能的p53蛋白通過一系列途徑增強了鼻咽癌細胞對放療的敏感性。在細胞周期調(diào)控方面，上調(diào)表達的p53蛋白可以進一步增強E1A基因?qū)毎芷诘恼{(diào)控作用。在未照射情況下，p53蛋白通過激活p21基因的表達，協(xié)同E1A基因?qū)⒏嗟募毎铚贕1期，抑制細胞的增殖，使細胞對放射線的敏感性增加。在受到放射線照射后，p53蛋白能夠激活G2/M期檢查點相關蛋白的表達，如Chk1、Chk2等，進一步增強細胞在G2/M期的阻滯，使細胞更難以修復受損的DNA，增加了細胞死亡的風險，從而提高了細胞對放射線的敏感性。在誘導細胞凋亡方面，p53蛋白與E1A基因相互協(xié)同，共同促進細胞凋亡的發(fā)生。p53蛋白通過激活促凋亡基因Bax和Puma等的表達，與E1A基因上調(diào)Bax表達以及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達的作用相互協(xié)同，進一步打破了Bcl-2家族蛋白之間的平衡，促使線粒體膜通透性增加，釋放更多的細胞色素C等凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應，引發(fā)細胞凋亡。同時，p53蛋白還可以直接作用于線粒體，增加線粒體膜的通透性，與E1A基因誘導細胞凋亡的線粒體途徑相互配合，增強了放療對鼻咽癌細胞的殺傷作用。此外，p53蛋白可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關信號通路，如死亡受體途徑等，與E1A基因共同促進細胞凋亡，從而實現(xiàn)對鼻咽癌的放射增敏作用。綜上所述，E1A基因通過上調(diào)p53基因的表達，恢復其在鼻咽癌中的正常功能，在細胞周期調(diào)控和誘導細胞凋亡等方面與p53基因相互協(xié)同，共同增加了鼻咽癌細胞對放療的敏感性，為提高鼻咽癌的放射治療效果提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。4.4抑制腫瘤血管生成機制腫瘤的生長和轉移高度依賴于充足的血液供應，腫瘤血管生成在其中起著至關重要的作用。腫瘤細胞通過分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等，刺激周圍的血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成，從而形成新生血管，為腫瘤細胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時帶走代謝廢物，促進腫瘤的生長、浸潤和轉移。在鼻咽癌中，腫瘤血管生成同樣活躍，是導致腫瘤進展和放療抵抗的重要因素之一。放療抵抗的鼻咽癌細胞能夠通過上調(diào)血管生成因子的表達，促進腫瘤血管的生成，增加腫瘤的血供，從而降低放療對腫瘤細胞的殺傷效果。因此，抑制腫瘤血管生成成為提高鼻咽癌放療敏感性的重要策略之一。研究發(fā)現(xiàn)，E1A基因能夠顯著抑制鼻咽癌的腫瘤血管生成，從而提高其對放療的敏感性。在人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型中，免疫組織化學檢測結果顯示，對照組和空載體組腫瘤組織中VEGF陽性表達率較高，分別為(65.2±5.5)%和(63.8±5.0)%，微血管密度也較高，表明腫瘤血管生成較為活躍。而E1A基因轉染組VEGF陽性表達率明顯下降，為(35.6±4.0)%，微血管密度也顯著降低，與對照組和空載體組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明E1A基因能夠有效抑制腫瘤血管生成。E1A基因轉染聯(lián)合放療組VEGF陽性表達率進一步降低至(15.8±2.5)%，微血管密度也降至最低，與對照組、空載體組和E1A基因轉染組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明E1A基因聯(lián)合放療對腫瘤血管生成的抑制作用更為顯著。E1A基因抑制腫瘤血管生成的機制主要涉及對VEGF表達的調(diào)控以及對血管內(nèi)皮細胞生物學行為的影響。在對VEGF表達的調(diào)控方面，E1A基因可能通過多種途徑抑制VEGF基因的轉錄和翻譯。一方面，E1A蛋白可以與某些轉錄因子相互作用，抑制它們與VEGF基因啟動子區(qū)域的結合，從而減少VEGF基因的轉錄。有研究表明，E1A蛋白能夠與激活蛋白-1（AP-1）結合，AP-1是一種與VEGF基因轉錄激活密切相關的轉錄因子，E1A蛋白與AP-1的結合可以阻止AP-1對VEGF基因啟動子的激活作用，降低VEGF基因的轉錄水平。另一方面，E1A基因可能通過調(diào)節(jié)微小RNA（miRNA）的表達來間接調(diào)控VEGF的表達。miRNA是一類非編碼RNA，能夠通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA，如miR-126等，能夠直接靶向VEGFmRNA，抑制其翻譯過程。E1A基因可能上調(diào)miR-126等miRNA的表達，從而降低VEGF蛋白的表達水平。在本研究中，通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，E1A基因轉染組細胞中miR-126的表達水平明顯高于對照組和空載體組，而VEGFmRNA的表達水平則顯著降低，進一步證實了E1A基因通過調(diào)節(jié)miRNA表達來抑制VEGF表達的作用機制。E1A基因還可能通過影響血管內(nèi)皮細胞的生物學行為來抑制腫瘤血管生成。腫瘤血管生成過程中，血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成是關鍵步驟。E1A基因轉染可能抑