DB15Quarantineprotocolfortrichuri2020-02-25發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給I動(dòng)物毛尾線蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物毛尾線蟲病病原的形態(tài)學(xué)鑒定法、普通PCR檢測(cè)法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物毛尾線蟲病病原及蟲卵的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)診斷。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。注：蟲體主要寄生于豬、牛、羊、駱駝等多種哺乳動(dòng)物。由毛尾線蟲引起的毛聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreactio用于擴(kuò)增位于已知序列之間脫氧核糖核酸（deoxyrib注：模板DNA經(jīng)過高溫變性成單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條互不DNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和DNA合成這一循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增，經(jīng)25～30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到106。實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timepolymerasechainre在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)位置模板進(jìn)行定量分析的方法。1每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語(yǔ)DNA：脫氧核糖核酸deoxyribonuleicaFAM：6-羧基熒光素6-carboxyfluorescTAMRA：6-羧基四甲基羅丹明6-carboxytetramethylrhoda5試劑和材料）：5.9無水乙醇。5.12dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymiditriphosphate，脫氧胸腺三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞（deoxyguanosinetriphospha），）：）：25’-AACGGCGGATCACTTGGC-3’5’-GTAGCGCCGACATGTTTGATC-3’5’-AACGGCGGATCACTTGGC-3’5’-GTAGCGCCGACATGTTTGATC-3’FAM-ACTTTGAACGCACATTGCAGCGTCGATC-TAM6.6冰箱（2℃~8℃和-20℃)。取新鮮糞便樣品2g放在小燒杯中，用鑷子或玻璃棒壓碎，加入10倍量的飽和食鹽水，攪拌混合，320mm～80mm范圍內(nèi)。尾部卷曲，有一根交合刺被包圍在交合刺蟲：體長(zhǎng)在35mm～70mm范圍內(nèi)，尾部較直。陰門開口于蟲體粗細(xì)交界處，根據(jù)種類不有小刺或結(jié)節(jié)。肛門位于蟲體最后端，蟲體形態(tài)參見附錄C中圖C未檢出典型蟲卵，且在剖檢時(shí)未檢到成蟲，即可判定陰性，報(bào)告為未檢出采用CTAB提取法或相關(guān)商品化試劑盒提取法，見附C=A×N×50/1000……………（1）N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。-5522-5-45-11-5-擴(kuò)增曲線，可以判斷樣品結(jié)果為陽(yáng)性，表述為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)毛尾線Ct≧40.0，可以判斷樣品結(jié)果為陰性，表述為實(shí)時(shí)熒光P9檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施檢測(cè)過程中的廢棄物，收集后在焚燒爐中焚6A.1CTAB提取法A.1.1樣品準(zhǔn)備A.2商品化試劑盒提取法7AACGGCGGATCACTTGGCTCGTAGGTCGTTGAAGAACGACGTGACACTCGAGAATT