ICS65.020.30CCSB43DB502023-09-15發(fā)布DB50/T1460—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：重慶市畜牧科學院、重慶市畜牧技術推廣總站、四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院。本文件主要起草人：龍熙、潘紅梅、朱燕、郭宗義、張亮、周旗、任素碧、涂志、柴捷、易霞。DB50/T1460—20231地方豬耳緣成纖維細胞制備與凍存技術規(guī)范本文件規(guī)定了地方豬耳緣成纖維細胞制備和凍存的試驗材料、儀器設備、采樣要求、樣品采集、樣品處理、分離培養(yǎng)和凍存的要求。本文件適用于地方豬耳緣成纖維細胞制備和凍存。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T3075畜禽養(yǎng)殖場消毒技術3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1耳緣成纖維細胞earmarginfibroblasts取自豬耳緣部位的組織，通過分離培養(yǎng)，獲得的成纖維細胞。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DMEM：杜氏培養(yǎng)基（Dulbecco'smodifiedeaglemedium）DPBS：杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）5試驗材料、儀器設備5.1主要儀器設備及耗材5.1.1儀器設備。低溫保存箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、低速離心機、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、顯微鏡、移液槍等。5.1.2消毒用品。75%酒精、碘伏。5.1.3防護用品。防護服、口罩、無菌帽、橡膠手套等。5.1.4實驗用具。耳缺鉗、剪刀、鑷子、刀片、細胞培養(yǎng)皿（瓶）、離心管、酒精燈、巴斯德吸管等。2DB50/T1460—20235.2實驗用水及相關溶液5.2.1實驗用水。應符合GB/T6682中4.2二級水要求。5.2.2樣品培養(yǎng)及保存液。樣品培養(yǎng)及保存液配制方法見附錄A。6采樣要求6.1采樣豬只應為健康活體。瀕危豬種可在死亡后24h內(nèi)采樣。6.2采樣用具應無菌。6.3采樣人員安全防護應符合NY/T541的要求。6.4采樣場所消毒應按照NY/T3075執(zhí)行。7樣品采集7.1選擇耳緣避開大血管的較薄部位消毒，用耳缺鉗取長寬5mm～6mm的樣品。7.2清理樣品上較長毛發(fā)后，轉(zhuǎn)移至加有75%酒精的離心管中，搖晃震蕩30s。取出樣品，用DPBS將樣品上的酒精沖洗干凈，再移至加有DMEM的離心管中，封口、標記，放入低溫保存箱。7.3在采樣登記表（見附錄B）上登記。7.4采樣結(jié)束，樣品即送實驗室。7.5廢棄物應無害化處理。8樣品處理8.1在超凈工作臺中，將樣品轉(zhuǎn)移至加有75%酒精的離心管中震蕩搖晃30s，用DPBS清洗，去除毛發(fā)和表皮，再用DPBS將樣品清洗干凈。8.2將經(jīng)8.1處理的樣品置于75%酒精中浸泡消毒30s，再用DPBS清洗干凈。9分離培養(yǎng)9.1原代細胞9.1.1將樣品剪成小于1mm3的碎塊，用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)皿（瓶）中，使其均勻分布于皿（瓶）底。9.1.2將培養(yǎng)皿（瓶）倒置，放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h～6h，每2h觀察1次。9.1.3樣品塊貼壁后，往培養(yǎng)皿（瓶）中加入4mL預熱至37℃的DMEM，12h后觀察是否污染，若有污染丟棄或二次清洗。9.1.4每隔1d觀察細胞遷出及其生長狀況。9.1.5標記細胞處理方式和細胞狀態(tài)，記錄細胞分離培養(yǎng)日志（見附錄C）。9.2傳代細胞9.2.1在顯微鏡下觀察原代細胞的匯合度，達到70%～90%時，進行傳代培養(yǎng)。9.2.2超凈臺中剔除9.2.1培養(yǎng)皿（瓶）中的樣品塊，用DPBS清洗細胞2～3次，棄廢液。向培養(yǎng)皿（瓶）中加入1mL胰酶，放入培養(yǎng)箱中消化3min，取出培養(yǎng)皿（瓶），用顯微鏡觀察細胞的脫壁DB50/T1460—20233情況，待細胞變圓并大部分脫壁后，立即加入2mLDMEM終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，留細胞沉淀。9.2.3加入DMEM重懸細胞，取細胞懸液均勻接種于2個細胞培養(yǎng)皿（瓶）中，標記為P1代細胞，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換1次DMEM。9.2.4細胞匯合度為70%～90%時，進行下一次傳代。9.2.5標記細胞處理方式和細胞狀態(tài)，記錄細胞分離培養(yǎng)日志（見附錄C）。10凍存10.1棄去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，用預熱至37℃的DPBS洗滌細胞1～2次。重復本文件9.2.210.2棄去細胞培養(yǎng)液，加入20℃~25℃的冷凍液，使細胞重懸浮，調(diào)整細胞密度為1~5×106個/mL。凍存管分裝，標記細胞來源、代次與凍存日期。10.3將分裝好的細胞凍存管放入程序降溫盒，-80℃冰箱中冷凍8h～16h，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期儲存。10.4做好凍存記錄。DB50/T1460—20234（規(guī)范性）樣品培養(yǎng)及保存液配制方法A.1單個樣品保存液配制10mLDMEM+500μL胎牛血清+1mL100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素，混勻后過濾除菌（0.22μm不得高壓滅菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超過21d。A.2DPBS配制8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.15g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，同時溶解于1LddH2O中。過濾除菌（0.22μm）或高壓滅菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超過21d。A.3DMEM（+10%胎牛血清+1×抗生素）配制500mLDMEM+56mL胎牛血清+5.6mL100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素，混勻后過濾除菌（0.22μm），不得高壓滅菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超過21d。A.4細胞冷凍液配制70mLDMEM+20mL胎牛血清+10mLDMSO，混勻后過濾除菌（0.22μm），不得高