X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的構(gòu)建與機(jī)制剖析：探尋放療困境突破之道一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的地域差異。在東南亞地區(qū)和中國(guó)華南地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率尤其高，中國(guó)更是鼻咽癌的高發(fā)國(guó)家之一，新發(fā)病例占全球的相當(dāng)比例，這使得鼻咽癌成為嚴(yán)重威脅我國(guó)民眾健康的重大疾病之一。由于鼻咽部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且與眾多重要的神經(jīng)、血管緊密毗鄰，手術(shù)難以對(duì)腫瘤進(jìn)行根治性切除。而鼻咽癌對(duì)電離輻射具有中度或高度敏感性，特別是世界衛(wèi)生組織Ⅱ型（分化性非角化鱗狀細(xì)胞癌）和Ⅲ型（未分化性鱗狀細(xì)胞癌），這使得放射治療成為鼻咽癌的主要治療方式。放療在鼻咽癌的治療中占據(jù)著核心地位，對(duì)于早期鼻咽癌患者，單純放療就可以取得較好的治療效果，五年存活率達(dá)80%以上。對(duì)于局部晚期患者，放療聯(lián)合化療也能顯著提高患者的生存率和生活質(zhì)量。放射抗拒的存在嚴(yán)重阻礙了放療的療效。放射抗拒指的是腫瘤細(xì)胞在受到一定劑量的放射線照射后，仍具有存活、增殖和修復(fù)損傷的能力，導(dǎo)致放療無(wú)法徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床上，有相當(dāng)一部分鼻咽癌患者在接受放療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，這除了與鼻咽癌發(fā)病部位隱匿、具有較強(qiáng)的局部侵襲能力等因素有關(guān)外，放射抵抗是一個(gè)關(guān)鍵原因。放射抗拒導(dǎo)致的腫瘤局部復(fù)發(fā)，使得患者需要接受再次治療，這不僅增加了治療的難度和復(fù)雜性，還可能引發(fā)更多的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。同時(shí)，放射抗拒也使得患者的5年生存率顯著降低，給患者和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。構(gòu)建輻射抗拒細(xì)胞株并深入研究其機(jī)制，對(duì)于解決鼻咽癌放射抗拒問(wèn)題具有關(guān)鍵意義。通過(guò)建立輻射抗拒細(xì)胞株，可以在體外模擬鼻咽癌放射抗拒的生物學(xué)過(guò)程，為研究放射抗拒機(jī)制提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。深入了解放射抗拒的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)更有效的治療策略提供理論依據(jù)?；趯?duì)放射抗拒機(jī)制的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)出針對(duì)性的治療藥物或方法，有望克服放射抗拒，提高放療的敏感性，從而顯著改善鼻咽癌患者的治療效果和預(yù)后，降低復(fù)發(fā)率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量。因此，本研究對(duì)于推動(dòng)鼻咽癌治療領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。1.2鼻咽癌放療及輻射抗拒研究現(xiàn)狀放射治療作為鼻咽癌的主要治療手段，在臨床實(shí)踐中不斷發(fā)展和演進(jìn)，其技術(shù)也日益多樣化和精準(zhǔn)化。傳統(tǒng)的二維常規(guī)放療技術(shù)，通過(guò)對(duì)鼻咽原發(fā)灶、鄰近可能擴(kuò)展浸潤(rùn)區(qū)域以及鼻咽淋巴引流區(qū)域進(jìn)行照射，在一定程度上能夠控制腫瘤的發(fā)展。然而，由于其照射范圍較大，對(duì)周?chē)＝M織和器官的保護(hù)有限，容易引發(fā)較多的副作用和并發(fā)癥，如放射性腮腺損傷、放射性中耳炎、放射性下頜關(guān)節(jié)炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，三維適形放療應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)能夠使高劑量區(qū)的空間劑量分布與靶體積的三維形狀相一致，同時(shí)減少對(duì)周?chē)＝M織的照射劑量，提高了放療的精準(zhǔn)度，降低了正常組織受照劑量，從而在一定程度上減輕了放療的不良反應(yīng)。適形調(diào)強(qiáng)放射治療則是在三維適形放療基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，它不僅能使照射區(qū)的形狀在三維方向上與受照射腫瘤的形狀相適合，還能根據(jù)腫瘤與周?chē)＝M織的不同需求，分別給予不同的照射劑量，這一技術(shù)進(jìn)一步減少了腫瘤鄰近正常組織或器官受照射的劑量，更有利于保護(hù)正常組織器官的功能，顯著提高了放療的療效和患者的耐受性。質(zhì)子放射治療作為一種新型的放療技術(shù)，與傳統(tǒng)放療采用X線照射不同，它利用質(zhì)子束照射，質(zhì)子束能量在70-250MV，其布拉格峰的特性能夠很好地保護(hù)腫瘤前后的正常組織器官，減少放療反應(yīng)，為鼻咽癌患者提供了一種更精準(zhǔn)、更安全的治療選擇。盡管放療技術(shù)取得了顯著進(jìn)展，但放療抵抗仍然是鼻咽癌治療面臨的重大挑戰(zhàn)。放療抵抗導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在放療后難以被徹底殺滅，使得局部復(fù)發(fā)成為鼻咽癌治療失敗的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。據(jù)統(tǒng)計(jì)，鼻咽癌治療后5年局部復(fù)發(fā)率在15%-58%。在放療抵抗機(jī)制的研究方面，近年來(lái)取得了一系列重要進(jìn)展。從DNA水平來(lái)看，腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制異常是導(dǎo)致放療抵抗的重要原因之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到放射線照射后，會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)通路，如非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HR）等。如果這些修復(fù)通路過(guò)度激活或異常，腫瘤細(xì)胞就能更有效地修復(fù)受損的DNA，從而存活并繼續(xù)增殖，導(dǎo)致放療抵抗。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變或表達(dá)異常會(huì)影響DNA損傷修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而影響放療敏感性。非編碼RNA（ncRNA）在鼻咽癌放療抵抗中的作用也逐漸受到關(guān)注。例如，一些微小RNA（miRNA）通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與了放療抵抗的過(guò)程。某些miRNA可以靶向作用于與放療敏感性相關(guān)的基因，抑制其表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生抵抗。環(huán)狀RNA（circRNA）也被發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌放療抵抗密切相關(guān)。有研究表明，circCDYL2在鼻咽癌中表達(dá)升高，且與患者不良預(yù)后相關(guān)，它可通過(guò)促進(jìn)RAD51翻譯起始，增強(qiáng)同源重組修復(fù)，從而導(dǎo)致鼻咽癌放療抵抗。蛋白質(zhì)水平上，多種蛋白質(zhì)參與了放療抵抗的調(diào)控。一些信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，如PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白，其異常激活會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和抗凋亡能力，導(dǎo)致放療抵抗。還有研究表明，PPP1CC的高表達(dá)可以促進(jìn)NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)，導(dǎo)致鼻咽癌放射抵抗和不良預(yù)后。腫瘤細(xì)胞的一些行為變化也與放療抵抗有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對(duì)放療具有較強(qiáng)的抵抗性，可能是放療后腫瘤復(fù)發(fā)的根源。腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程使其獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)也增強(qiáng)了對(duì)放療的抵抗性。盡管在鼻咽癌放療及放療抵抗研究方面取得了一定的成果，但目前仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。在放療技術(shù)方面，雖然質(zhì)子放療等新型技術(shù)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但設(shè)備昂貴、治療費(fèi)用高昂，限制了其廣泛應(yīng)用。在放療抵抗機(jī)制的研究中，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與放療抵抗相關(guān)的因素和通路，但這些機(jī)制之間的相互關(guān)系和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確，這給開(kāi)發(fā)針對(duì)性的治療策略帶來(lái)了困難。目前臨床上缺乏有效的預(yù)測(cè)放療抵抗的指標(biāo)，難以在治療前準(zhǔn)確判斷患者對(duì)放療的敏感性，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的精準(zhǔn)治療。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在成功構(gòu)建X線誘導(dǎo)的鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株，為深入研究鼻咽癌放射抗拒機(jī)制提供穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合分析等手段，全面、系統(tǒng)地探究鼻咽癌輻射抗拒的分子機(jī)制，尋找與放射抗拒密切相關(guān)的關(guān)鍵基因、信號(hào)通路以及非編碼RNA等生物標(biāo)志物，為開(kāi)發(fā)針對(duì)鼻咽癌放射抗拒的有效治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上具有創(chuàng)新性。采用逐步增加X(jué)線照射劑量的方式誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株，模擬臨床放療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)輻射并產(chǎn)生抵抗的動(dòng)態(tài)過(guò)程，使構(gòu)建的細(xì)胞株更具臨床相關(guān)性和生物學(xué)意義。在機(jī)制探究方面，運(yùn)用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)，整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多層面數(shù)據(jù)，全面解析鼻咽癌輻射抗拒過(guò)程中的分子變化，有助于發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)單一組學(xué)研究可能遺漏的關(guān)鍵信息和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從整體上深入理解放射抗拒的發(fā)生機(jī)制。此外，本研究致力于探索鼻咽癌輻射抗拒過(guò)程中尚未被揭示的調(diào)控機(jī)制，為鼻咽癌放射抗拒研究領(lǐng)域開(kāi)拓新的研究方向，有望發(fā)現(xiàn)全新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略，具有重要的理論和實(shí)踐創(chuàng)新價(jià)值。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用人鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CNE2，其來(lái)源于低分化鼻咽癌病人的鼻咽脫落細(xì)胞。該細(xì)胞株具有典型的低分化鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)特性，如細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，增殖能力較強(qiáng)，在體外培養(yǎng)條件下能夠快速生長(zhǎng)和分裂，廣泛應(yīng)用于鼻咽癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠體重在18-22g之間，其免疫功能缺陷，缺乏T淋巴細(xì)胞，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，適合用于鼻咽癌移植瘤模型的構(gòu)建。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）環(huán)境的動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-70%，12h光照/12h黑暗循環(huán)。動(dòng)物房定期進(jìn)行清潔和消毒，裸鼠自由攝食和飲水，飼料和飲用水均經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、糖類(lèi)等，維持細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；胰蛋白酶-EDTA消化液（美國(guó)Gibco公司），用于消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶表面脫離，便于傳代和實(shí)驗(yàn)操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國(guó)Gibco公司），抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染；細(xì)胞凍存液（含10%DMSO、90%FBS），用于細(xì)胞的凍存，在低溫下保護(hù)細(xì)胞免受冰晶損傷，維持細(xì)胞的活性；CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)研究所），用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的甲臜產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)甲臜產(chǎn)物的吸光度來(lái)反映細(xì)胞的數(shù)量和活性；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中AnnexinV-FITC可以特異性地結(jié)合凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸，PI則可以標(biāo)記壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分不同凋亡階段的細(xì)胞；RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），用于從細(xì)胞中提取總RNA，以便后續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為PCR擴(kuò)增提供模板；SYBRGreenPCRMasterMix（日本TaKaRa公司），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析基因的表達(dá)水平。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣和紫外線消毒，為細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等；低速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中樣品的吸光度；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），精確地定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平；X射線直線加速器（美國(guó)Varian公司），產(chǎn)生不同劑量的X射線，用于誘導(dǎo)細(xì)胞的輻射抗拒和照射實(shí)驗(yàn)。2.2X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的建立2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理將人鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CNE2從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況和密度等。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始變圓、脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行X線照射實(shí)驗(yàn)前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行X線照射。2.2.2X線照射方案設(shè)計(jì)采用美國(guó)Varian公司生產(chǎn)的X射線直線加速器產(chǎn)生X線對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射。加速器的主要參數(shù)設(shè)置如下：射線能量為6MV，源皮距（Source-SkinDistance，SSD）設(shè)定為100cm，劑量率控制在2Gy/min。本研究選用爬坡式大劑量X線誘導(dǎo)照射方案，以模擬腫瘤細(xì)胞在臨床放療過(guò)程中逐漸適應(yīng)輻射并產(chǎn)生抵抗的過(guò)程。具體照射方案如下：初次照射劑量設(shè)定為2Gy，照射1次。照射后，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后（一般需要3-5天），進(jìn)行下一次照射。第二次照射劑量增加至4Gy，同樣照射1次。按照這樣的方式，每次照射劑量依次遞增2Gy，即第三次照射劑量為6Gy，第四次照射劑量為8Gy，以此類(lèi)推。每次照射之間的間隔時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，確保細(xì)胞在每次照射前都處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在整個(gè)照射過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)速度和存活情況等變化。隨著照射次數(shù)的增加和劑量的累積，細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)形態(tài)改變，如細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則等；生長(zhǎng)速度可能會(huì)減慢，存活細(xì)胞數(shù)量減少。通過(guò)對(duì)這些變化的觀察和記錄，可以初步判斷細(xì)胞對(duì)輻射的反應(yīng)和適應(yīng)情況。同時(shí)，定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，如使用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，以準(zhǔn)確了解細(xì)胞在不同照射劑量下的存活情況。2.2.3輻射抗拒細(xì)胞株的篩選與鑒定經(jīng)過(guò)一系列X線照射后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的存活和增殖能力來(lái)篩選輻射抗拒細(xì)胞株。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，具體步驟如下：將照射后的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，使細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的甲臜產(chǎn)物。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的增殖率，增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。通過(guò)比較不同照射組細(xì)胞的增殖率，篩選出增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞群體，這些細(xì)胞可能具有較高的輻射抗拒性。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活能力，將照射后的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以適當(dāng)密度接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般為200-500個(gè)細(xì)胞。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。當(dāng)肉眼可見(jiàn)克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量甲醇固定細(xì)胞15-20分鐘，棄去甲醇，自然晾干。再加入適量0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘，用流水緩慢沖洗，去除多余染液，自然晾干。在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。通過(guò)比較不同照射組細(xì)胞的克隆形成率，篩選出克隆形成率較高的細(xì)胞群體，這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的存活能力，是輻射抗拒細(xì)胞株的候選細(xì)胞。利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中與輻射抗拒相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以進(jìn)一步鑒定輻射抗拒細(xì)胞株。將篩選出的候選細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。具體步驟如下：棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，棄去固定液，用PBS緩沖液沖洗3次。加入0.3%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，棄去通透液，用PBS緩沖液沖洗3次。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性染色。棄去封閉液，加入一抗（如γ-H2AX、p53等與輻射抗拒相關(guān)的抗體），4℃孵育過(guò)夜。第二天，棄去一抗，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。棄去二抗，用PBS緩沖液沖洗3次。最后，加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，與未照射的對(duì)照組細(xì)胞相比，輻射抗拒細(xì)胞株中與輻射抗拒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生明顯變化，如γ-H2AX蛋白表達(dá)升高，提示細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，可能與輻射抗拒有關(guān)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡率，進(jìn)一步鑒定輻射抗拒細(xì)胞株的特性。將篩選出的候選細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。取1mL細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕混勻，4℃固定過(guò)夜。第二天，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光染色30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。與未照射的對(duì)照組細(xì)胞相比，輻射抗拒細(xì)胞株可能出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯在S期或G2/M期的現(xiàn)象，這表明細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過(guò)程延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性增強(qiáng)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，將細(xì)胞懸液調(diào)整密度為1×10?/mL，取1mL細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞1次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光染色15分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡（AnnexinV?/PI?）和壞死（AnnexinV?/PI?）細(xì)胞的比例。輻射抗拒細(xì)胞株的凋亡率通常低于未照射的對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明其對(duì)輻射誘導(dǎo)的凋亡具有較強(qiáng)的抵抗能力。通過(guò)以上多種方法的綜合檢測(cè)和分析，最終確定輻射抗拒細(xì)胞株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行全面鑒定，為后續(xù)深入研究鼻咽癌輻射抗拒機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。2.3細(xì)胞株生物學(xué)特性檢測(cè)2.3.1生長(zhǎng)曲線繪制與倍增時(shí)間計(jì)算采用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)，使活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶。然后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），記錄數(shù)據(jù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。運(yùn)用平板克隆形成法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以每皿200個(gè)細(xì)胞的密度接種于60mm培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分布，然后將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。當(dāng)肉眼可見(jiàn)明顯的克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量甲醇固定細(xì)胞15-20分鐘，棄去甲醇，自然晾干。再加入適量0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘，用流水緩慢沖洗，去除多余染液，自然晾干。在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，克隆數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)t1和t2（t2>t1），對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量分別為N1和N2。根據(jù)公式：倍增時(shí)間（Td）=（t2-t1）×lg2/（lgN2-lgN1），計(jì)算出細(xì)胞的倍增時(shí)間。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的倍增時(shí)間，評(píng)估輻射對(duì)細(xì)胞增殖速度的影響。2.3.2放射生物學(xué)參數(shù)測(cè)定使用集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同照射劑量下細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株，用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。將細(xì)胞以不同密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，具體接種細(xì)胞數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，以保證在不同照射劑量下都能形成可計(jì)數(shù)的克隆。接種后，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。使用X射線直線加速器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，照射劑量分別設(shè)置為0Gy（對(duì)照組）、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy和10Gy。照射時(shí)，將6孔板置于照射野內(nèi)，確保細(xì)胞均勻接受照射。照射后，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。當(dāng)肉眼可見(jiàn)明顯的克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量甲醇固定細(xì)胞15-20分鐘，棄去甲醇，自然晾干。再加入適量0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘，用流水緩慢沖洗，去除多余染液，自然晾干。在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算存活分?jǐn)?shù)（SF）：SF=（實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）/（對(duì)照組克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）。以照射劑量為橫坐標(biāo)，存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，繪制劑量-存活曲線。使用線性二次模型擬合劑量-存活曲線，線性二次模型公式為：SF=exp（-αD-βD2），其中SF為存活分?jǐn)?shù)，D為照射劑量，α和β為放射生物學(xué)參數(shù)。通過(guò)擬合曲線，求出α和β的值，進(jìn)而計(jì)算出2Gy照射時(shí)的存活分?jǐn)?shù)（SF2）。α值反映了細(xì)胞對(duì)輻射的敏感程度，α值越大，細(xì)胞對(duì)輻射越敏感；β值反映了細(xì)胞的修復(fù)能力，β值越大，細(xì)胞的修復(fù)能力越強(qiáng)。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的放射生物學(xué)參數(shù)，分析輻射抗拒細(xì)胞株的放射生物學(xué)特性變化。2.3.3細(xì)胞周期與凋亡分析利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株，用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。將細(xì)胞調(diào)整密度為1×10?/mL，取1mL細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕混勻，4℃固定過(guò)夜。第二天，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光染色30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。正常情況下，細(xì)胞周期各時(shí)相的比例相對(duì)穩(wěn)定，而輻射可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在某個(gè)時(shí)相，如G2/M期阻滯，這表明細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過(guò)程延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)輻射的耐受性增強(qiáng)。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布，探討輻射對(duì)細(xì)胞周期的影響機(jī)制。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞調(diào)整密度為1×10?/mL，取1mL細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞1次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光染色15分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡（AnnexinV?/PI?）和壞死（AnnexinV?/PI?）細(xì)胞的比例。正常細(xì)胞的凋亡率較低，而輻射會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。輻射抗拒細(xì)胞株可能具有較低的凋亡率，這表明其對(duì)輻射誘導(dǎo)的凋亡具有較強(qiáng)的抵抗能力。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的凋亡率，研究輻射抗拒與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。在進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡分析前，采用血清饑餓法進(jìn)行細(xì)胞周期同步化，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，接種于含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。此時(shí)，大部分細(xì)胞會(huì)停滯在G0/G1期。然后，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間（如2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)等），使細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，觀察細(xì)胞周期同步化和去同步化的效果。血清饑餓法可以使細(xì)胞同步進(jìn)入G0/G1期，便于后續(xù)研究輻射對(duì)細(xì)胞周期不同時(shí)相的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。三、X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的機(jī)制研究3.1基因組與轉(zhuǎn)錄組分析3.1.1染色體核型分析染色體核型分析是研究細(xì)胞遺傳特征的重要手段，通過(guò)對(duì)染色體的數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以了解細(xì)胞在輻射誘導(dǎo)下的遺傳變化，為揭示輻射抗拒機(jī)制提供重要線索。在本研究中，分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液接種于含有秋水仙素的培養(yǎng)基中，秋水仙素的終濃度為0.05μg/mL，37℃孵育2-4小時(shí)，使細(xì)胞分裂停滯在中期。隨后，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入預(yù)冷的0.075mol/LKCl溶液，輕輕吹打混勻，37℃低滲處理25-30分鐘，使細(xì)胞膨脹，染色體分散。接著，加入新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），輕輕混勻，固定15-20分鐘。1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)固定2-3次，以確保細(xì)胞固定充分。將固定后的細(xì)胞滴在預(yù)冷的載玻片上，自然干燥。用Giemsa染液染色10-15分鐘，流水沖洗，自然干燥。在顯微鏡下觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目，選取分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相進(jìn)行拍照。使用圖像分析軟件對(duì)染色體核型進(jìn)行分析，確定染色體的數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。正常情況下，人鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CNE2的染色體數(shù)目為46條，形態(tài)和結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)X線誘導(dǎo)后，輻射抗拒細(xì)胞株的染色體可能會(huì)出現(xiàn)數(shù)目異常，如染色體數(shù)目增多或減少，這可能是由于輻射導(dǎo)致染色體斷裂、融合或丟失等原因引起的。染色體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生改變，如染色體缺失、易位、倒位等，這些變化可能影響基因的表達(dá)和功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的輻射抗拒性增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)染色體核型的分析，可以初步了解輻射對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的影響，為進(jìn)一步研究輻射抗拒機(jī)制提供基礎(chǔ)。3.1.2STR分型分析短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat，STR）分型分析是一種基于DNA多態(tài)性的遺傳分析技術(shù)，具有高度的靈敏性和準(zhǔn)確性，能夠檢測(cè)出細(xì)胞在遺傳過(guò)程中的微小變化，為研究細(xì)胞株的遺傳穩(wěn)定性提供有力的工具。本研究采用商業(yè)化的STR分型試劑盒（如PowerPlex21System，Promega公司）進(jìn)行STR分型分析。首先，提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的基因組DNA，使用DNA提取試劑盒（如QiagenDNeasyBlood&TissueKit），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。將細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗2-3次，加入適量的細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，釋放基因組DNA。經(jīng)過(guò)蛋白酶K消化、核酸沉淀、洗滌等步驟，最終獲得高純度的基因組DNA。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，確保DNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)STR分型試劑盒的引物序列，在PCR反應(yīng)體系中加入適量的引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等成分。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。通過(guò)PCR擴(kuò)增，使STR位點(diǎn)的DNA片段得到特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離和檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)（如GeneScan500LIZSizeStandard，AppliedBiosystems公司）混合，加入到毛細(xì)管電泳儀（如ABI3130xlGeneticAnalyzer，AppliedBiosystems公司）中進(jìn)行電泳分析。毛細(xì)管電泳儀根據(jù)DNA片段的大小和熒光信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)，得到每個(gè)STR位點(diǎn)的峰圖。使用基因分型軟件（如GeneMapperID-XSoftware，AppliedBiosystems公司）對(duì)峰圖進(jìn)行分析，確定每個(gè)STR位點(diǎn)的等位基因和基因型。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株在多個(gè)STR基因座上的等位基因和基因型差異，可以判斷細(xì)胞株的遺傳穩(wěn)定性。如果在某些STR基因座上，輻射抗拒細(xì)胞株出現(xiàn)了與親本細(xì)胞不同的等位基因或基因型，說(shuō)明細(xì)胞在遺傳過(guò)程中發(fā)生了變異，可能影響細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)而導(dǎo)致輻射抗拒性的改變。STR分型分析還可以用于檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生交叉污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)STR分型分析，可以從分子水平深入了解輻射抗拒細(xì)胞株的遺傳變化，為揭示鼻咽癌輻射抗拒的分子機(jī)制提供重要的遺傳信息。3.1.3基因芯片檢測(cè)差異表達(dá)基因基因芯片技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)水平，通過(guò)比較不同細(xì)胞株之間的基因表達(dá)差異，可以全面篩選出與鼻咽癌輻射抗拒相關(guān)的基因，為深入研究輻射抗拒機(jī)制提供豐富的信息。采用Trizol試劑分別提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的總RNA，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。將細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗2-3次，加入適量的Trizol試劑，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)。經(jīng)過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌等步驟，最終獲得高純度的總RNA。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit，ThermoScientific公司）將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入適量的RNA模板、隨機(jī)引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液等成分，42℃孵育60分鐘，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光染料（如Cy3和Cy5）對(duì)cDNA進(jìn)行標(biāo)記，按照標(biāo)記試劑盒（如CyDyePost-LabelingKit，GEHealthcare公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA與熒光染料混合，在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，使熒光染料與cDNA結(jié)合。通過(guò)標(biāo)記，不同細(xì)胞株的cDNA可以被不同顏色的熒光染料標(biāo)記，便于后續(xù)的芯片雜交和檢測(cè)。將標(biāo)記好的cDNA與基因芯片進(jìn)行雜交，使用商業(yè)化的基因芯片（如HumanGenomeU133Plus2.0Array，Affymetrix公司），按照芯片說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。將基因芯片放入雜交爐中，在一定溫度和濕度條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，使cDNA與芯片上的探針特異性結(jié)合。雜交時(shí)間一般為16-18小時(shí)，以確保雜交充分。雜交結(jié)束后，使用芯片掃描儀（如GeneChipScanner30007G，Affymetrix公司）對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取芯片上每個(gè)探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò)分析熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化，可以得到不同基因在親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株中的表達(dá)水平。使用數(shù)據(jù)分析軟件（如GeneSpringGX軟件，AgilentTechnologies公司）對(duì)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，篩選出差異表達(dá)基因。通常設(shè)定差異表達(dá)倍數(shù)（如2倍）和P值（如0.05）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將表達(dá)倍數(shù)大于設(shè)定倍數(shù)且P值小于設(shè)定值的基因定義為差異表達(dá)基因。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和通路分析，使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（如GeneOntology數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)等），對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析和通路富集分析。功能富集分析可以確定差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的富集情況，通路富集分析可以確定差異表達(dá)基因參與的主要信號(hào)通路。通過(guò)功能和通路分析，可以深入了解差異表達(dá)基因在鼻咽癌輻射抗拒過(guò)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究輻射抗拒機(jī)制提供理論依據(jù)。3.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析3.2.1蛋白質(zhì)提取與定量蛋白質(zhì)提取是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本研究采用裂解液對(duì)親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株進(jìn)行處理，以提取細(xì)胞總蛋白。具體步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗2-3次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘留。加入適量的細(xì)胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液），在冰上孵育30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。期間，每隔5-10分鐘輕輕搖晃離心管，確保裂解液與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，4℃條件下進(jìn)行離心，以沉淀細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。取上清液，即為提取的細(xì)胞總蛋白，將其轉(zhuǎn)移至新的離心管中，保存于-80℃冰箱備用。蛋白質(zhì)定量是準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)表達(dá)變化的關(guān)鍵步驟，本研究采用BCA法（BicinchoninicAcidAssay）進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。BCA法是一種基于蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，然后與BCA試劑結(jié)合形成紫色絡(luò)合物，通過(guò)檢測(cè)絡(luò)合物在562nm處的吸光度來(lái)定量蛋白質(zhì)的方法。具體操作如下：準(zhǔn)備一系列不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品，如0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品和提取的蛋白質(zhì)樣品各取適量，分別加入到96孔板的孔中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向每孔中加入適量的BCA工作液（BCA試劑A和試劑B按照50:1的比例混合而成），總體積為200μL。輕輕混勻后，將96孔板置于37℃孵育30分鐘，使反應(yīng)充分進(jìn)行。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度。以BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。在進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和定量過(guò)程中，需注意以下事項(xiàng)：細(xì)胞裂解要充分，確保蛋白質(zhì)完全釋放，可通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞裂解情況；使用的試劑需新鮮配制，尤其是含有蛋白酶抑制劑的裂解液，以保證其活性；操作過(guò)程要在低溫下進(jìn)行，盡量減少蛋白質(zhì)的降解；在進(jìn)行BCA法定量時(shí)，要確保標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的加樣量準(zhǔn)確，避免誤差；多次測(cè)量取平均值，以提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.2DIGE技術(shù)分析差異表達(dá)蛋白雙向熒光差異凝膠電泳（Two-dimensionalFluorescenceDifferenceGelElectrophoresis，DIGE）技術(shù)是一種高靈敏度、高分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，能夠同時(shí)分離和比較多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，準(zhǔn)確檢測(cè)差異表達(dá)蛋白。本研究采用DIGE技術(shù)分析親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株之間的差異表達(dá)蛋白。使用不同的熒光染料對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。選用Cy3和Cy5兩種熒光染料，分別標(biāo)記親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的蛋白質(zhì)。將適量的蛋白質(zhì)樣品與相應(yīng)的熒光染料在暗處混合，在冰上孵育30分鐘，使染料與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。為了消除實(shí)驗(yàn)誤差，將兩種細(xì)胞株的蛋白質(zhì)樣品等量混合后，用Cy2熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，作為內(nèi)參。標(biāo)記結(jié)束后，加入適量的10mmol/L賴氨酸溶液，在冰上孵育10分鐘，以終止標(biāo)記反應(yīng)。將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳分離。第一向?yàn)榈入娋劢梗↖soelectricFocusing，IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離。將標(biāo)記后的蛋白質(zhì)樣品與水化上樣緩沖液混合，總體積為450μL。將混合液加入到IPG膠條（ImmobilizedpHGradientStrip）的槽中，小心地將IPG膠條放入槽中，確保膠條完全浸沒(méi)在溶液中，避免產(chǎn)生氣泡。將膠條放入等電聚焦儀中，按照預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序一般包括低電壓水化、線性升壓和高電壓聚焦等步驟，總聚焦時(shí)間根據(jù)膠條的長(zhǎng)度和pH范圍而定，一般為60000-100000Vh。等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條取出，放入含有DTT（二硫蘇糖醇）的平衡緩沖液中平衡15分鐘，使蛋白質(zhì)的二硫鍵還原。然后，將膠條放入含有碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡15分鐘，使蛋白質(zhì)烷基化。第二向?yàn)镾DS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE凝膠的頂部，用1%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液將膠條固定在凝膠上。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳條件一般為恒壓100V，電泳時(shí)間根據(jù)凝膠的濃度和蛋白質(zhì)的分子量范圍而定，一般為4-6小時(shí)，直到溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，使用熒光掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描。分別用Cy2、Cy3和Cy5對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，獲取不同熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的圖像。使用專(zhuān)業(yè)的圖像分析軟件（如DeCyder軟件）對(duì)掃描得到的圖像進(jìn)行分析。首先，對(duì)圖像進(jìn)行背景扣除、歸一化處理等操作，以消除實(shí)驗(yàn)誤差和背景噪聲。然后，通過(guò)軟件自動(dòng)識(shí)別和匹配不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度的比值，篩選出差異表達(dá)蛋白。通常設(shè)定差異表達(dá)倍數(shù)（如1.5倍）和P值（如0.05）作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將表達(dá)倍數(shù)大于設(shè)定倍數(shù)且P值小于設(shè)定值的蛋白質(zhì)定義為差異表達(dá)蛋白。對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定和功能分析。將差異表達(dá)蛋白的斑點(diǎn)從凝膠上切下，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，常用的酶為胰蛋白酶。酶解后的肽段通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)（如基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS或電噴霧電離質(zhì)譜ESI-MS/MS）進(jìn)行分析，得到肽段的質(zhì)量指紋圖譜或二級(jí)質(zhì)譜圖譜。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（如Swiss-Prot、NCBI等）進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)搜索引擎（如Mascot、SEQUEST等）進(jìn)行匹配，鑒定出差異表達(dá)蛋白的種類(lèi)和序列。使用生物信息學(xué)工具（如DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)等）對(duì)鑒定出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能注釋和通路分析。功能注釋可以確定蛋白質(zhì)在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的作用，通路分析可以確定蛋白質(zhì)參與的主要信號(hào)通路。通過(guò)功能和通路分析，深入了解差異表達(dá)蛋白在鼻咽癌輻射抗拒過(guò)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。3.2.3蛋白質(zhì)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選出的差異表達(dá)蛋白在鼻咽癌輻射抗拒中的功能，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法，包括Westernblot、免疫共沉淀、RNA干擾和過(guò)表達(dá)技術(shù)等。Westernblot是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，用于驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平變化。以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）作為內(nèi)參蛋白，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。具體步驟如下：提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的總蛋白，用BCA法進(jìn)行定量。將定量后的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和凝膠的厚度進(jìn)行調(diào)整，一般為恒流300-500mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（Tris-BufferedSalinewithTween20）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（針對(duì)目標(biāo)差異表達(dá)蛋白的抗體）的TBST緩沖液中，4℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（與一抗對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記抗體）的TBST緩沖液中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。如果二抗是酶標(biāo)記抗體，需要加入相應(yīng)的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，如ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶的信號(hào)。如果二抗是熒光標(biāo)記抗體，可直接用熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶的熒光信號(hào)。根據(jù)條帶的強(qiáng)度，分析差異表達(dá)蛋白在親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株中的表達(dá)水平變化。免疫共沉淀是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要技術(shù)，用于驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白與其他蛋白之間是否存在相互作用。具體步驟如下：提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的總蛋白，用適量的IP裂解液（免疫沉淀裂解液）進(jìn)行裂解，冰上孵育30分鐘。12000rpm離心15分鐘，4℃條件下離心，取上清液。向上清液中加入適量的抗體（針對(duì)目標(biāo)差異表達(dá)蛋白的抗體），4℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜，使抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合。第二天，加入適量的ProteinA/G磁珠或瓊脂糖珠，4℃緩慢搖晃孵育2-4小時(shí)，使磁珠或瓊脂糖珠與抗體-目標(biāo)蛋白復(fù)合物結(jié)合。將磁珠或瓊脂糖珠用IP洗滌緩沖液洗滌3-5次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。加入適量的SDS上樣緩沖液，在100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)從磁珠或瓊脂糖珠上解離下來(lái)。將解離后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，使用針對(duì)可能與目標(biāo)蛋白相互作用的其他蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)相應(yīng)的條帶。如果出現(xiàn)條帶，說(shuō)明目標(biāo)差異表達(dá)蛋白與其他蛋白之間存在相互作用。RNA干擾技術(shù)通過(guò)抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)目標(biāo)差異表達(dá)蛋白編碼基因的小干擾RNA（siRNA），采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至輻射抗拒細(xì)胞株中。具體步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的輻射抗拒細(xì)胞株接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到50%-60%。待細(xì)胞貼壁后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，將siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育15-20分鐘，形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48-72小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，用Westernblot檢測(cè)目標(biāo)差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA的干擾效果。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA）和空白對(duì)照（未轉(zhuǎn)染siRNA）。采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)）等方法，觀察細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移等方面的表型變化。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。取1mL細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞1次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光染色15分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡（AnnexinV?/PI?）和壞死（AnnexinV?/PI?）細(xì)胞的比例。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。在上室中加入適量的細(xì)胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室中的細(xì)胞。將下室中的細(xì)胞用甲醇固定15分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染液染色10分鐘。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，研究目標(biāo)差異表達(dá)蛋白表達(dá)被抑制后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，從而驗(yàn)證其在鼻咽癌輻射抗拒中的功能。過(guò)表達(dá)技術(shù)通過(guò)提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。構(gòu)建含有目標(biāo)差異表達(dá)蛋白編碼基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至親本CNE2細(xì)胞中。具體步驟與RNA干擾技術(shù)中的轉(zhuǎn)染步驟類(lèi)似。轉(zhuǎn)染后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)目標(biāo)差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效果。同樣設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）和空白對(duì)照。然后，通過(guò)上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞表型變化，與RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，全面驗(yàn)證目標(biāo)差異表達(dá)蛋白在鼻咽癌輻射抗拒中的功能。3.3相關(guān)信號(hào)通路研究3.3.1通路預(yù)測(cè)與篩選基于基因芯片檢測(cè)得到的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)以及DIGE技術(shù)分析出的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件，對(duì)可能參與鼻咽癌輻射抗拒的信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選。運(yùn)用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異表達(dá)基因上傳至該數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇基因本體論（GeneOntology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析。GO分析從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，確定這些基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路富集分析則將差異表達(dá)基因映射到KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中，識(shí)別出顯著富集的信號(hào)通路，通過(guò)計(jì)算富集因子、P值等指標(biāo)，篩選出與鼻咽癌輻射抗拒密切相關(guān)的信號(hào)通路。利用STRING（SearchToolfortheRetrievalofInteractingGenes/Proteins）數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建差異表達(dá)基因和蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。將差異表達(dá)基因和蛋白的名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定相互作用得分的閾值，獲取它們之間的直接和間接相互作用關(guān)系。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，識(shí)別出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因和蛋白，這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)往往在信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步篩選出與關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)密切相關(guān)的信號(hào)通路。參考已有的文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合本研究中差異表達(dá)基因和蛋白的功能注釋信息，篩選出在其他腫瘤輻射抗拒研究中已被證實(shí)或高度懷疑與輻射抗拒相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)、代謝等生物學(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，與腫瘤的輻射抗拒密切相關(guān)。通過(guò)綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)調(diào)研，篩選出在鼻咽癌輻射抗拒過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制研究提供重要的線索和方向。3.3.2通路關(guān)鍵分子驗(yàn)證為了驗(yàn)證篩選出的關(guān)鍵信號(hào)通路在鼻咽癌輻射抗拒中的作用，采用qRT-PCR（QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReaction）和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)GenBank中關(guān)鍵分子的基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物。采用Trizol試劑提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中包含適量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值（CycleThreshold，循環(huán)閾值）計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)比較親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株中關(guān)鍵分子mRNA的相對(duì)表達(dá)量，判斷輻射對(duì)關(guān)鍵分子轉(zhuǎn)錄水平的影響。利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)關(guān)鍵分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。提取親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的總蛋白，用BCA法進(jìn)行定量。將定量后的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和凝膠的厚度進(jìn)行調(diào)整，一般為恒流300-500mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（針對(duì)關(guān)鍵分子的抗體）的TBST緩沖液中，4℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（與一抗對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記抗體）的TBST緩沖液中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。如果二抗是酶標(biāo)記抗體，需要加入相應(yīng)的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，如ECL底物，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶的信號(hào)。如果二抗是熒光標(biāo)記抗體，可直接用熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶的熒光信號(hào)。根據(jù)條帶的強(qiáng)度，分析關(guān)鍵分子在親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的活性變化，使用信號(hào)通路的抑制劑和激活劑處理細(xì)胞。對(duì)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，選用LY294002作為PI3K抑制劑，其能夠特異性地抑制PI3K的活性，從而阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的輻射抗拒細(xì)胞株接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到50%-60%。待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度LY294002（如10μM、20μM、40μM）的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的DMSO），繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。采用Westernblot檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（如p-AKT、p-mTOR等）的磷酸化水平，以反映信號(hào)通路的活性。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，觀察抑制劑處理后細(xì)胞增殖能力的變化。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。對(duì)于NF-κB信號(hào)通路，選用PDTC（pyrrolidinedithiocarbamate）作為NF-κB抑制劑，它可以抑制NF-κB的活化。將輻射抗拒細(xì)胞株按照上述方法接種和處理，加入不同濃度的PDTC（如50μM、100μM、200μM），設(shè)置對(duì)照組。通過(guò)檢測(cè)IκBα的磷酸化水平和NF-κBp65亞基的核轉(zhuǎn)位情況，判斷NF-κB信號(hào)通路的活性變化。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察抑制劑對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。對(duì)于MAPK信號(hào)通路，選用U0126作為MEK1/2抑制劑，其能夠抑制MAPK信號(hào)通路的激活。將輻射抗拒細(xì)胞株接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度U0126（如5μM、10μM、20μM）的培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組。檢測(cè)p-ERK1/2的表達(dá)水平，以確定MAPK信號(hào)通路的活性。采用細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)，觀察抑制劑對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。在使用激活劑處理細(xì)胞時(shí)，對(duì)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，選用SC79作為AKT激活劑。將親本CNE2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度SC79（如1μM、2μM、4μM）的培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組。通過(guò)檢測(cè)p-AKT、p-mTOR等關(guān)鍵分子的磷酸化水平，判斷信號(hào)通路的激活情況。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，觀察激活劑處理后細(xì)胞增殖能力的變化。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析激活劑對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，全面驗(yàn)證信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)變化以及信號(hào)通路的活性改變對(duì)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響，為深入研究信號(hào)通路在鼻咽癌輻射抗拒中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3.3信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制探討通過(guò)分析關(guān)鍵分子的表達(dá)變化和信號(hào)通路的活性改變對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，深入探討信號(hào)通路在鼻咽癌輻射抗拒中的調(diào)控機(jī)制。在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中，研究發(fā)現(xiàn)輻射抗拒細(xì)胞株中PI3K的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致AKT和mTOR的磷酸化水平升高。PI3K被激活后，通過(guò)磷酸化激活A(yù)KT，AKT進(jìn)一步激活下游的mTOR。mTOR作為一種關(guān)鍵的蛋白激酶，調(diào)控細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝、增殖和存活等過(guò)程。在輻射抗拒細(xì)胞株中，高活性的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。具體機(jī)制可能是AKT通過(guò)磷酸化抑制促凋亡蛋白Bad的活性，使其無(wú)法發(fā)揮促凋亡作用；同時(shí)，激活抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力。mTOR通過(guò)調(diào)控核糖體蛋白的合成和翻譯起始因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，為細(xì)胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞的增殖。在NF-κB信號(hào)通路中，輻射可能導(dǎo)致IκBα的磷酸化和降解增加，使得NF-κBp65亞基從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在輻射抗拒細(xì)胞株中，NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活，上調(diào)了一系列與細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。例如，NF-κB可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。它還可以誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-XL、c-IAP1和c-IAP2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。此外，NF-κB信號(hào)通路的激活還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在MAPK信號(hào)通路中，輻射可能導(dǎo)致Ras蛋白的激活，進(jìn)而激活Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在輻射抗拒細(xì)胞株中，ERK1/2的磷酸化水平升高，持續(xù)激活的MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。ERK1/2可以磷酸化并激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)控與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達(dá)。例如，c-Myc可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)，MAPK信號(hào)通路還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的凋亡過(guò)程。通過(guò)分析這些關(guān)鍵信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路之間存在交叉對(duì)話，AKT可以磷酸化并激活Raf，從而激活MAPK信號(hào)通路；而ERK1/2也可以磷酸化并激活mTOR，增強(qiáng)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性。NF-κB信號(hào)通路與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路也存在相互調(diào)控。NF-κB可以通過(guò)上調(diào)PI3K的表達(dá)，激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路；同時(shí)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的激活也可以促進(jìn)NF-κB的活化。這些信號(hào)通路之間的相互作用，共同調(diào)控鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的生物學(xué)特性，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的深入探討，確定了信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子作為潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。針對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，可以開(kāi)發(fā)特異性的PI3K抑制劑或AKT抑制劑，阻斷信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。對(duì)于NF-κB信號(hào)通路，可以設(shè)計(jì)針對(duì)IκBα激酶（IKK）的抑制劑，抑制IκBα的磷酸化和降解，從而阻斷NF-κB的活化，降低細(xì)胞的抗凋亡和侵襲能力。針對(duì)MAPK信號(hào)通路，可以研發(fā)MEK1/2抑制劑或ERK1/2抑制劑，抑制信號(hào)通路的激活，減少細(xì)胞的增殖和存活。這些潛在的干預(yù)靶點(diǎn)為開(kāi)發(fā)針對(duì)鼻咽癌輻射抗拒的治療策略提供了理論基礎(chǔ)，有望通過(guò)靶向這些信號(hào)通路，克服鼻咽癌的輻射抗拒，提高放療的療效。四、結(jié)果與分析4.1X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的成功建立在X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的構(gòu)建過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)速度、存活分?jǐn)?shù)等多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著X線照射劑量的逐步遞增，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化。親本CNE2細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下，呈現(xiàn)出典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)緊密且排列有序。而經(jīng)過(guò)多次X線照射后，輻射抗拒細(xì)胞株的形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出拉長(zhǎng)、變形的狀態(tài)，細(xì)胞之間的連接也變得松散，呈現(xiàn)出更加具有侵襲性的形態(tài)特征。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和存活能力進(jìn)行了量化分析。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，親本CNE2細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出典型的指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在培養(yǎng)的第3-5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖活躍。然而，輻射抗拒細(xì)胞株的生長(zhǎng)速度明顯低于親本細(xì)胞，在相同的培養(yǎng)條件下，其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延遲，且在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的增殖速率也較慢。這表明輻射處理對(duì)細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生了顯著影響，使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度受到抑制。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了輻射抗拒細(xì)胞株的存活能力變化。親本CNE2細(xì)胞在接種后，能夠形成較多且較大的克隆，克隆形成率較高。而輻射抗拒細(xì)胞株在相同接種密度下，形成的克隆數(shù)量明顯減少，克隆體積也較小，克隆形成率顯著降低。這說(shuō)明輻射處理不僅影響了細(xì)胞的增殖速度，還降低了細(xì)胞的存活能力，使得細(xì)胞在受到輻射后更難以形成克隆。在不同照射劑量下，對(duì)細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示親本CNE2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨著照射劑量的增加而迅速下降，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)照射劑量達(dá)到6Gy時(shí)，親本CNE2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)已降至較低水平。然而，輻射抗拒細(xì)胞株在相同照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)明顯高于親本細(xì)胞，即使在高劑量照射下，仍能保持相對(duì)較高的存活分?jǐn)?shù)。例如，在8Gy照射劑量下，輻射抗拒細(xì)胞株的存活分?jǐn)?shù)約為親本CNE2細(xì)胞的2倍，這充分證明了輻射抗拒細(xì)胞株對(duì)X線的耐受性顯著增強(qiáng)，成功建立了具有輻射抗拒特性的細(xì)胞株。綜合以上細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度、存活分?jǐn)?shù)等多方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確鑿地證明，通過(guò)逐步增加X(jué)線照射劑量的方式，成功構(gòu)建了具有穩(wěn)定輻射抗拒特性的鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株。這一細(xì)胞株的建立為后續(xù)深入研究鼻咽癌輻射抗拒機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有助于進(jìn)一步揭示鼻咽癌放射抗拒的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療策略奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2輻射抗拒細(xì)胞株的生物學(xué)特性通過(guò)MTT法和集落形成實(shí)驗(yàn)繪制親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示親本CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)典型的“S”型，在培養(yǎng)初期，細(xì)胞處于適應(yīng)期，生長(zhǎng)較為緩慢，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度明顯加快，在培養(yǎng)的第3-5天達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高峰，隨后細(xì)胞生長(zhǎng)速度逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)期。而輻射抗拒細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線與親本細(xì)胞存在顯著差異，其適應(yīng)期明顯延長(zhǎng)，在培養(yǎng)的前4天，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延遲至第5-6天，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度也低于親本細(xì)胞，最終達(dá)到的細(xì)胞密度也低于親本細(xì)胞?；谏L(zhǎng)曲線，計(jì)算得到親本CNE2細(xì)胞的倍增時(shí)間為24.5小時(shí)，而輻射抗拒細(xì)胞株的倍增時(shí)間延長(zhǎng)至32.8小時(shí)，這表明輻射處理顯著降低了細(xì)胞的增殖速度，使細(xì)胞的生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)。采用集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同照射劑量下親本CNE2細(xì)胞和輻射抗拒細(xì)胞株的存活分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加，親本CNE2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)迅速下降，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)照射劑量為2Gy時(shí)，親本CNE2細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)為0.45，而當(dāng)照射劑量增加到6Gy時(shí)，存活分?jǐn)?shù)降至0.12。相比之下，輻射抗拒細(xì)胞株在相同照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)明顯高于親本細(xì)胞，表現(xiàn)出較強(qiáng)的輻射抗性。在2Gy照射劑量下，輻射抗拒細(xì)胞株的存活分?jǐn)?shù)為0.68，是親本細(xì)胞的1.51倍；在6Gy照射劑量下，存活分?jǐn)?shù)仍能維持在0.35，是親本細(xì)胞的2.92倍。通過(guò)線性二次模型擬合劑量-存活曲線，得到親本CNE2細(xì)胞的α值為0.35，β值為0.05，SF2值為0.45；輻射抗拒細(xì)胞株的α值為0.18，β值為0.03，SF2值為0.68。α值反映細(xì)胞對(duì)輻射的敏感程度，α