152022-12-08發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I狼源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法本文件規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中狼源性成分實(shí)時(shí)熒光PCRGB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物3.1在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒3.2CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromiDNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicaEDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticaFAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescePCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactioTAMRA:羧基四甲基羅丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamTris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethan15.2引物對(duì)序列:5.3DNA提取試劑盒。5.4CTAB。5.6NaCl。5.7EDTA。5.8蛋白酶K溶液(20mg/mL)。5.10異丙醇。6.4核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.7單孔道微量移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100參照附錄A中提取樣品DNA的方法提取DNA2———c)陽性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道8.2結(jié)果判定型的擴(kuò)增曲線，可判定被檢樣品為陽性；再8.3結(jié)果表述8.3.2結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出狼檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定3A.1CTAB-提取緩沖液將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL后，定容至250mL，115℃高壓A.2CTAB-沉淀液稱0.2gCTAB,0.234gN稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15A.4.1稱取樣品0.5g～1g加入1.5mL～3.樣品膨脹，則可再多加CTAB,每次多1mL，最多A.4.24000rpm/min～5000r/min離心10A.4.4取上清600μL～650μL加入無菌EP管中，加A.4.6加入350μL氯仿，渦旋30min，12000rpm離心10in，12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500μL75%的乙醇洗滌A.4.9將沉淀溶于100μL滅菌水或TEbuffer或DEPC水4CCGTACTCTAGCTTACATAACTCAGGAAGGTGGGTACCTCACATTAGCCAAGAAGCCATTT