熒光光譜在蛋白質研究中應用第一頁，共42頁。一、基本原理

1、熒光的產生第二頁，共42頁。2、熒光的壽命：10-8―10-4s3、磷光的壽命：10-4―102s4、紫外的壽命：10-15s

紫外觀察不到的過程，其它兩種光譜可以觀察到，如生色團及其環(huán)境的變化。5、由于它是發(fā)射光譜，所以靈敏度很高。6、磷光

第三頁，共42頁。二、儀器結構與主要光譜參量1、儀器結構第四頁，共42頁。2、主要光譜參量（1）吸收譜、熒光激發(fā)光譜、及熒光發(fā)射光譜

N-甲基咔唑在環(huán)己烷第五頁，共42頁。第六頁，共42頁。第七頁，共42頁。（2）熒光壽命去掉激發(fā)光后，分子的熒光強度(I0)將到1/e

I0所需要的時間，用表示，=1/k。如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，熒光壽命稱為F,它與kF（熒光發(fā)射速率常數(shù)）成反比，F(xiàn)可以給出有關分子結構和動力學方面的信息。（3）量子產率表示物質發(fā)射熒光的效率，用表示。發(fā)射熒光分子在全部退激分子中所占比例。第八頁，共42頁。（4）熒光強度

F(I)=kP0C三、影響熒光的因素1、熒光與化合物的結構（1）躍遷類型*能發(fā)出較強的熒光，所以*是產生熒光的主要類型，主要是由于？。（2）共軛效應增大熒光物質的，從而使更多分子處于激發(fā)態(tài)，有利于熒光的發(fā)射。（3）剛性結構與共平面效應（4）取代基效應給電子基團如：-OH,-NH2,-OCH3,通過p-共軛，增強熒光.

吸電子基團如：-NO2,-COOH,降低熒光.第九頁，共42頁。第十頁，共42頁。（5）溶劑的影響

極性增加，發(fā)生紅移。（1-氨基-8-萘磺酸酯），從辛醇乙二醇，紅移且強度降低。第十一頁，共42頁。（6）熒光淬滅因素

a.碰撞淬滅

b.能量轉移

c.氧的淬滅作用

d.自淬滅

e.光照第十二頁，共42頁。四、熒光在蛋白質研究中的應用1、蛋白質的內源熒光

主要來自Trp,Tyr,Phe,相對強度比為100:9:0.5.對于含有Trp,蛋白質主要表現(xiàn)Trp的特征,最大發(fā)射在320-350nm之間.如果只有Tyr和Phe,蛋白質主要表現(xiàn)Tyr的特征,最大發(fā)射波長在304nm之間.應用:第十三頁，共42頁。反應計量比的測定第十四頁，共42頁。反應動力學第十五頁，共42頁。2.Ca2+對phospho-calsequestrin蛋白的影響

熒光增強且藍移表明:Trp的微環(huán)境從極性表面轉移到疏水內部.Appl.Phys.2000,B71,755-763第十六頁，共42頁。3.Zn2+對氨基?；傅挠绊?

熒光降低且紅移,Trp從疏水內部向外部移動.第十七頁，共42頁。4.外源熒光的應用第十八頁，共42頁。5、共振能量轉移第十九頁，共42頁。熒光共振能量（FRET）轉移及應用輻射能量轉移

熒光分子發(fā)射的熒光為某一物質分子吸收，前者（能量給予體,D）的熒光減弱或猝滅，后者（能量接受體,A）被激發(fā)：

D*D+ｈνA+ｈνA*

第二十頁，共42頁。非輻射能量轉移

根據(jù)作用機理的不同，非輻射能量轉移分為共振能量轉移和交換能量轉移.

共振能量轉移即熒光共振能量轉移，機理是通過分子的偶極－偶極耦合作用進行能量轉移，分子間有一定的距離。能量傳遞距離甚至可達7.0——10.0nm,也稱為長距離能量轉移.第二十一頁，共42頁。給予體和接受體的共振能量轉移能級圖第二十二頁，共42頁。能量轉移效率

RO又叫Fr?ster半徑（單位?），在給予體和接受體分子間的距離等于RO時，能量轉移和給予體的衰變幾率相等.FDA為受體存在時供體的熒光強度;FD供體單獨存在時的熒光強度第二十三頁，共42頁。RO值的計算

A1/2表示當有50％的能量轉移效率（即激發(fā)態(tài)給予體的50％由熒光共振能量轉移去活化）.第二十四頁，共42頁。熒光共振能量轉移的基本條件給予體和接受體分子必須靠近（一般是1-10nm），即在遠大于碰撞半徑（r）的距離上發(fā)生。接受體的吸收光譜必須與給予體的熒光發(fā)射光譜重疊。給予體和接受體分子的偶極轉移空間定向必須近似平行。能量轉移效率與介質的粘度變化無關。最可能的熒光共振能量轉移是單重態(tài)-單重態(tài)和三重態(tài)-單重態(tài)能量轉移過程第二十五頁，共42頁。給予體和接受體對給予體接受體Ro(?)熒光素四甲基羅丹明55IAEDANS1熒光素46EDANS2DABCYL333熒光素熒光素44BODIPYFL4BODIPYFL57BODIPYFL四甲基羅丹明

四甲基羅丹明CY5531-氯蒽苝411-氯蒽紅熒烯381-氰蒽紅熒烯84菲熒光素35*三苯胺葉綠素54*N,N-二甲胺9-甲蒽24**三重態(tài)-單重態(tài)能量轉移；1.5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸;第二十六頁，共42頁。四甲基羅丹明碘乙酰胺第二十七頁，共42頁。菁染料Cy5第二十八頁，共42頁。

5-((((2-IODOACETYL)AMINO)ETHYL)AMINO)

NAPHTHALENE-1-SULFONICACID,IAEDANS

5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸

第二十九頁，共42頁。Msx(Msx-homeodomain)Themsxhomeodomainproteinisadownstreamtranscriptionfactorofthebonemorphogeneticprotein(BMP)-4signalandakeyregulatorforneuraltissuedifferentiation.

接受體分子是,標記蛋白質中6，10，27位置的半胱氨酸；給予5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸（IAEDANS）體是蛋白質分子中48位置的色氨酸（Trp-48）,能量轉移發(fā)生在AEDANS和Trp-48之間，據(jù)此計算在蛋白質中6，10，27位置到48位置的距離分別約是1.9，2.3和1.6nm.第三十頁，共42頁。研究α型和突變體π型胞漿

谷胱甘肽轉移酶的區(qū)別

通過用1-苯胺基－8－萘磺酸（ANS）為接受體標記胞漿谷胱甘肽轉移酶的非催化位點，以胞漿谷胱甘肽轉移酶中的催化位點色氨酸（Trp）殘基為給予體，利用FRET研究人類α型和突變體π型胞漿谷光甘肽轉移酶的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)，α型中給予體-接受體間距離2.2nm,π型中距離1.82nm。第三十一頁，共42頁。

ApplicationofFRETtotheGroEL–GroESChaperoninReaction,GroEL(EL315C+IAEDANS)EL513-D,GroES(ES98C+F5M)ES98-AMETHODS

24,278–288(2001)第三十二頁，共42頁。第三十三頁，共42頁。6、綠色熒光蛋白

綠色熒光蛋白空間結構(GreenFluorescenceProtein):1962年在水母中分離得到。它由11個

-折疊圍繞成一個-折疊桶，結構中唯一的一個-螺旋在桶的中間。Thematureproteinresistsmanyproteasesandisstableupto65

CandpH5to11,in1%sodiumdodecylsulfateor6Mguanidiniamchloride.FluorescentisoptimalatpH7.2to8.0.ItrequiresonlyUVorbluelightandoxygenforfluorescencewithoutanycofactorsorsubstrates.第三十四頁，共42頁。

-螺旋包括一個氨基酸三聯(lián)體：residues65-67,Thr-Tyr-Gly，被埋在疏水的蛋白質中間可以防止氧以及溶劑對熒光的淬滅。a圖為GFP;b是一種從珊瑚中發(fā)現(xiàn)的紅色熒光蛋白DsRed。第三十五頁，共42頁。第三十六頁，共42頁。

GFPhasanumberofamazingpropertiesthatenableitsuseforinvivoimaging.Firstly,GFPcanbeexpressedinavarietyofcells,whereitbecomesspontaneouslyfluorescentwithouttheaidofacofactor.Secondly,GFPcanbefusedtoahostproteintocreateafusionproteinthatusuallyretainsboththefluorescenceoftheGFPandthebiochemicalfunctionoftheoriginalhost.Thirdly,fusionproteinscanbetargetedtospecificorganelles,suchasthenucleusorendoplasmicreticulum,byaddinganappropriatesignalingpeptide.Finally,andmostimportantly,mutagenesisofGFPhasproducedmanymutantswithvaryingspectralpropertiesthatcanbeusedasdonorsandacceptorsofFRET.第三十七頁，共42頁。

Activationofintracellularproteasessuchascaspaseisanimportanteventinprogrammedcelldeath.Ithasbeendemonstratedthattumornecrosisfactor(TNF),Fasligandandchemotherapeuticdrugs,areabletoinduceapoptosisbyactivatingcaspase.

Caspaseactivationandproteolyticcleavageofspecifictargetproteinsrepresentsanintegralstepinthepathwayleadingtotheapoptoticdeathofcells.Analysisofcaspaseactivityinintactcells,however,hasbeengenerallylimitedtothemeasurementofend-pointbiochemicalandmorphologicalmarkersofapoptosis.

SubstratesofgroupIIcaspaseshareaconsensusrecognitionandcleavageaminoacidsequence:DXXD.Detectionofcaspaseactivationinlivecellswillgreatlyfacilitatemonitoringoftheapoptosisprocessinlivecells.第三十八頁，共42頁。Inanefforttodevelopastrategywithwhichtomonitorcaspas