微生物實(shí)驗(yàn)操作技能考核題引言微生物實(shí)驗(yàn)操作技能是微生物學(xué)研究、工業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的核心基礎(chǔ)，其規(guī)范性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、實(shí)驗(yàn)室生物安全及菌種資源的保存。建立科學(xué)的操作技能考核體系，不僅能客觀評(píng)估操作者的技能水平，更能通過(guò)考核引導(dǎo)規(guī)范操作習(xí)慣的形成。本文圍繞微生物實(shí)驗(yàn)的核心操作，設(shè)計(jì)了6類考核模塊，涵蓋無(wú)菌操作、分離純化、計(jì)數(shù)、形態(tài)觀察、培養(yǎng)基制備及菌種保藏，每模塊均明確考核目標(biāo)、操作要點(diǎn)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并提供考核實(shí)施建議，旨在為微生物實(shí)驗(yàn)技能考核提供可落地的參考方案。一、無(wú)菌操作技術(shù)考核題（核心基礎(chǔ)）1.1考核目標(biāo)掌握無(wú)菌操作的核心邏輯（避免雜菌污染），熟練完成接種環(huán)滅菌、取菌、接種的全流程，確保操作過(guò)程無(wú)外源微生物引入。1.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)接種環(huán)滅菌用酒精燈外焰灼燒接種環(huán)（從柄到尖端，來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)）外焰溫度最高（≥500℃），需燒至接種環(huán)發(fā)紅（徹底殺滅微生物）；避免灼燒棉塞冷卻滅菌后將接種環(huán)置于酒精燈旁冷卻3-5秒避免燙死待取菌種（冷卻不充分會(huì)導(dǎo)致菌苔焦化）取菌打開(kāi)試管塞，試管口在火焰上快速灼燒1圈；用接種環(huán)挑取少量菌苔試管口灼燒可殺滅管口雜菌；取菌量不宜過(guò)多（避免接種后菌落過(guò)密）接種將接種環(huán)上的菌輕劃至目標(biāo)培養(yǎng)基（如斜面），操作時(shí)試管口與培養(yǎng)皿蓋始終靠近火焰保持“火焰屏障”（火焰周圍10cm內(nèi)為無(wú)菌區(qū)）；避免菌液灑出結(jié)束滅菌接種完畢，再次灼燒接種環(huán)至發(fā)紅，放回支架防止殘留菌種污染環(huán)境或后續(xù)操作1.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則接種環(huán)滅菌20未用外焰（-10）；未燒至發(fā)紅（-5）；未轉(zhuǎn)動(dòng)接種環(huán)（-5）試管口處理20取菌前未灼燒試管口（-10）；取菌后未灼燒試管口（-10）冷卻操作15未冷卻直接取菌（-15）；冷卻時(shí)間不足（＜3秒，-5）接種過(guò)程25操作時(shí)離火焰＞10cm（-10）；菌液灑出（-10）；劃線劃破瓊脂（-5）結(jié)束滅菌20未再次灼燒接種環(huán)（-20）；灼燒不徹底（未發(fā)紅，-10）二、微生物分離與純化考核題（平板劃線法）2.1考核目標(biāo)掌握平板劃線分離單菌落的技術(shù)，能通過(guò)劃線操作將混合菌液分離為純培養(yǎng)（單菌落），為后續(xù)鑒定或保藏奠定基礎(chǔ)。2.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)倒平板將融化的培養(yǎng)基（45-50℃）倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿（每皿約15ml），輕輕晃動(dòng)使均勻溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)皿破裂；溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固過(guò)快，產(chǎn)生氣泡劃線用無(wú)菌接種環(huán)挑取菌液，在平板邊緣劃“第一區(qū)”（平行直線，約占平板1/4）；灼燒接種環(huán)冷卻后，從第一區(qū)末端劃“第二區(qū)”（重疊1-2條線）；重復(fù)至第四區(qū)每區(qū)劃線需“輕觸瓊脂”（避免劃破）；后區(qū)劃線不與前區(qū)完全重疊（保證稀釋效果）培養(yǎng)待培養(yǎng)基凝固后，倒置平板（皿蓋在下），37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)倒置可防止冷凝水掉落污染菌落；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌落融合2.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則倒平板20培養(yǎng)基溫度＞50℃（-10）；倒平板時(shí)皿蓋打開(kāi)過(guò)大（＞45°，-5）；有氣泡（＞3個(gè)，-5）劃線操作40接種環(huán)未滅菌（-10）；每區(qū)劃線未銜接（-10）；劃破瓊脂（-10）；劃線過(guò)密（無(wú)間隙，-10）培養(yǎng)方法20未倒置平板（-20）；培養(yǎng)溫度≠37℃（-10）；培養(yǎng)時(shí)間＞24小時(shí)（-10）結(jié)果判斷20無(wú)單菌落（-20）；單菌落數(shù)量＜10個(gè)（-10）；有雜菌污染（-10）三、微生物計(jì)數(shù)考核題（稀釋涂布平板法）3.1考核目標(biāo)掌握活菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法（稀釋涂布平板法），能準(zhǔn)確計(jì)算菌液中的活菌濃度（CFU/ml），為發(fā)酵生產(chǎn)或藥效評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。3.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)梯度稀釋取1ml菌液加入9ml無(wú)菌生理鹽水（10?1稀釋），充分混勻；再取1ml10?1稀釋液加入9ml生理鹽水（10?2），重復(fù)至10??稀釋度每稀釋一次更換吸管（避免交叉污染）；混勻時(shí)用手輕彈試管（避免劇烈震蕩破壞細(xì)胞）涂布取0.1ml稀釋液（如10??、10??、10??），滴加至平板中央；用無(wú)菌涂布器（灼燒冷卻后）均勻涂布整個(gè)平板表面涂布器需冷卻（避免燙死細(xì)菌）；涂布時(shí)旋轉(zhuǎn)平板（保證均勻）計(jì)數(shù)培養(yǎng)后，選擇菌落數(shù)在____之間的平板計(jì)數(shù)；計(jì)算：CFU/ml=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10菌落數(shù)＜30或＞300的平板統(tǒng)計(jì)誤差大，需舍棄；同一稀釋度取2-3個(gè)平板的平均值3.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則梯度稀釋30稀釋倍數(shù)錯(cuò)誤（如10?1寫成10?2，-10）；未更換吸管（-10）；混勻不充分（-10）涂布操作25涂布器未滅菌（-10）；未冷卻（-10）；涂布不均勻（菌落集中在中央，-5）計(jì)數(shù)方法30選擇菌落數(shù)＜30或＞300的平板（-15）；計(jì)算錯(cuò)誤（如未乘10，-15）結(jié)果準(zhǔn)確性15與標(biāo)準(zhǔn)值誤差＞10%（-10）；誤差＞20%（-15）四、微生物形態(tài)觀察考核題（革蘭氏染色）4.1考核目標(biāo)掌握革蘭氏染色的原理（細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異）與操作流程，能準(zhǔn)確判斷細(xì)菌的革蘭氏陽(yáng)性（G?）或陰性（G?），為細(xì)菌鑒定提供關(guān)鍵依據(jù)。4.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)涂片取少量菌液（或菌苔），涂在載玻片中央（直徑約1cm）；自然干燥后，通過(guò)火焰2-3次固定涂片要薄（避免染色不均）；固定時(shí)載玻片背面接觸火焰（避免過(guò)熱破壞細(xì)胞）初染滴加結(jié)晶紫染液，覆蓋涂片，靜置1分鐘；水洗（用流水輕沖，避免沖掉涂片）初染是染色的基礎(chǔ)，時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致G?菌染色過(guò)淺媒染滴加碘液，覆蓋涂片，靜置1分鐘；水洗碘液與結(jié)晶紫形成復(fù)合物（增強(qiáng)染色效果），時(shí)間不足會(huì)影響后續(xù)脫色脫色滴加95%乙醇，輕輕晃動(dòng)載玻片，直至無(wú)紫色流出（約30秒）；立即水洗脫色是關(guān)鍵（G?菌細(xì)胞壁厚，不易脫色；G?菌細(xì)胞壁薄，易脫色）；過(guò)度脫色會(huì)導(dǎo)致G?菌誤判為G?復(fù)染滴加番紅染液，覆蓋涂片，靜置2分鐘；水洗，干燥番紅為堿性染料，可染G?菌（紅色）；G?菌仍保持結(jié)晶紫的紫色鏡檢用低倍鏡找到視野，換油鏡（滴香柏油）觀察；調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至圖像清晰油鏡放大倍數(shù)高（100×），需用香柏油（折射率與玻璃一致）增強(qiáng)亮度4.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則涂片與固定20涂片太厚（-10）；未固定（-10）；固定過(guò)熱（載玻片發(fā)燙，-5）染色步驟40初染時(shí)間＜1分鐘（-10）；媒染時(shí)間＜1分鐘（-10）；脫色過(guò)度（＞40秒，-10）；復(fù)染時(shí)間＜2分鐘（-10）鏡檢操作25未用低倍鏡找視野（-10）；油鏡未滴香柏油（-10）；未清潔鏡頭（-5）結(jié)果判斷15判斷錯(cuò)誤（如G?菌判為G?，-15）；結(jié)果不清晰（-10）五、培養(yǎng)基制備與滅菌考核題5.1考核目標(biāo)掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）的制備流程，能正確使用高壓蒸汽滅菌鍋，確保培養(yǎng)基無(wú)菌且符合微生物生長(zhǎng)要求。5.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)配料按配方稱?。号Ｈ飧?g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g（固體培養(yǎng)基），加入1000ml蒸餾水牛肉膏需用玻璃棒挑?。ū苊庹吃诜Q量紙上）；瓊脂需最后加入（避免提前凝固）溶解加熱攪拌至所有成分完全溶解（牛肉膏需徹底分散）溶解不徹底會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基成分不均，影響微生物生長(zhǎng)調(diào)pH用NaOH（1mol/L）或HCl（1mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4（用pH試紙或酸度計(jì)檢測(cè)）pH過(guò)高或過(guò)低會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)（多數(shù)細(xì)菌最適pH為7.0-7.5）分裝將培養(yǎng)基分裝至試管（每管約5ml）或三角瓶（約占容積1/3），加棉塞（或硅膠塞）分裝量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致滅菌時(shí)溢出；棉塞需松緊適度（過(guò)松易污染，過(guò)緊影響通氣）滅菌高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）；滅菌后冷卻至室溫，倒置保存滅菌前需排盡冷空氣（否則溫度達(dá)不到121℃）；冷卻后倒置可防止冷凝水進(jìn)入培養(yǎng)基5.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則配料20稱量錯(cuò)誤（如牛肉膏稱取2g，-10）；瓊脂未最后加入（-10）溶解20溶解不徹底（有顆粒，-10）；加熱時(shí)未攪拌（-10）調(diào)pH20pH＜7.2或＞7.4（-10）；調(diào)節(jié)方法錯(cuò)誤（如用濃NaOH，-10）分裝20分裝量過(guò)多（試管＞1/2，-10）；棉塞過(guò)松或過(guò)緊（-10）滅菌操作15滅菌溫度≠121℃（-10）；未排盡冷空氣（-5）結(jié)果檢查5培養(yǎng)基有雜菌生長(zhǎng)（-5）；凝固不良（-5）六、菌種保藏考核題（斜面低溫保藏法）6.1考核目標(biāo)掌握常用菌種保藏方法（斜面低溫保藏），能延長(zhǎng)菌種存活時(shí)間（6-12個(gè)月），防止菌種退化或污染。6.2操作流程與關(guān)鍵要點(diǎn)步驟操作細(xì)節(jié)關(guān)鍵要點(diǎn)斜面制備將融化的培養(yǎng)基倒入試管（每管約5ml），傾斜放置（斜面長(zhǎng)度約為試管的1/2），凝固后滅菌斜面長(zhǎng)度適中（過(guò)短不利于接種，過(guò)長(zhǎng)易污染）；滅菌后需檢查斜面是否平整接種用無(wú)菌接種環(huán)挑取**單菌落**，在斜面培養(yǎng)基上劃“Z”字線；37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)必須挑取單菌落（保證菌種純度）；培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（避免菌落老化）保藏培養(yǎng)后，用石蠟密封試管口（或用無(wú)菌膠塞），放入4℃冰箱（冷藏層）石蠟密封可防止培養(yǎng)基干燥；4℃可降低菌種代謝速率（延長(zhǎng)存活時(shí)間）定期檢查每3個(gè)月取出斜面，接種至新鮮培養(yǎng)基，觀察生長(zhǎng)情況防止菌種死亡或污染（如發(fā)現(xiàn)雜菌，需重新分離純化）6.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（100分）評(píng)分項(xiàng)目分值扣分細(xì)則斜面制備20斜面長(zhǎng)度＜1/3或＞2/3（-10）；滅菌不徹底（-10）接種操作30未挑取單菌落（-10）；劃線不規(guī)范（-10）；培養(yǎng)時(shí)間＞24小時(shí)（-10）保藏處理30未密封（-10）；保藏溫度≠4℃（-10）；未定期檢查（-10）結(jié)果評(píng)估20菌種死亡（-20）；雜菌污染（-15）；存活時(shí)間＜6個(gè)月（-10）七、考核實(shí)施建議7.1考核前準(zhǔn)備器材與試劑：提前準(zhǔn)備好酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)皿、高壓滅菌鍋等器材，以及牛肉膏、蛋白胨、結(jié)晶紫等試劑（確保在有效期內(nèi)）。菌種選擇：選用模式菌種（如大腸桿菌（G?）、金黃色葡萄球菌（G?）），避免使用pathogenic菌種（保障安全）。方案告知：提前3天向考生發(fā)放考核大綱（包括考核模塊、評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、時(shí)間限制），讓考生有針對(duì)性地準(zhǔn)備。7.2考核中注意事項(xiàng)時(shí)間限制：每個(gè)考核模塊設(shè)定合理時(shí)間（如無(wú)菌操作10分鐘、平板劃線15分鐘），避免拖延。安全監(jiān)督：監(jiān)考人員需全程監(jiān)督（如酒精燈使用、高壓滅菌鍋操作），防止火災(zāi)或爆炸事故。操作記錄：要求考生填寫《操作記錄表》（如稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間、染色結(jié)果），作為評(píng)分的輔助依據(jù)。7.3考核后反饋結(jié)果公示：考核結(jié)束后24小時(shí)內(nèi)，公示評(píng)分結(jié)果（包括每個(gè)模塊的得分、扣分點(diǎn)）。問(wèn)題分析：針對(duì)常見(jiàn)錯(cuò)誤（如無(wú)菌操作不規(guī)范、脫色過(guò)度），組織專題講解（如播放操作視頻、現(xiàn)場(chǎng)演示）。技能提升：為得分較低的考生提供針對(duì)性訓(xùn)練（如加強(qiáng)無(wú)菌操作練習(xí)、提高顯微鏡使用技能）。結(jié)語(yǔ)微生物實(shí)驗(yàn)操作技能考核是培養(yǎng)合格微生物學(xué)工作者的重要環(huán)節(jié)。通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)（覆蓋核心操作）、標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)分（具體可操作）、全程化反饋（指導(dǎo)改進(jìn)），能有效提升操作者的技能水平，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性