ICS65.020.30CCSB43Technicalregulationsfortheproductionoffrozensemeninequine前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備 5采精 26精液品質(zhì)檢查 27精液處理 28精液冷凍 29凍精檢測 2 3 3 3附錄A（資料性）稀釋液的配制 4附錄B（資料性）細(xì)管凍精的編號 5本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天?？h畜牧技術(shù)推廣站提出。本文件由中國馬業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：天祝藏族自治縣畜牧技術(shù)推廣站、山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院、山東省馬業(yè)協(xié)會、天祝藏族自治縣萬良走馬養(yǎng)殖場、天祝藏族自治縣多隆走馬保種選育營銷場。本文件主要起草人：祁萬禎、李鋒紅、馬秀山、馬立霞、張宇豪、趙珊珊、羅文學(xué)、王勝、李開輝、劉敏敏、蒲曉明、陳宗芳、馬玉珍、張光斌、張永輝、李妍蓮、李熙成、王占存、王占斌。本文件為首次發(fā)布。1T/CNHIA20—2025馬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了馬冷凍精液生產(chǎn)過程及對實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備、采精、精液檢查與處理、精液冷凍、凍精檢測、包裝、凍精貯存及運(yùn)輸?shù)募夹g(shù)要求。本文件適用于馬冷凍精液的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器T/CNHIA19馬人工授精技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1稀釋液semendiluent保護(hù)精子延長其存活時間及增加精液容量的液體。3.2種公馬stallion具有該品種的典型體型外貌，生長發(fā)育良好，身體健康，無遺傳疾病，符合該品種對種公馬的認(rèn)定要求，并獲得品種認(rèn)定及登記機(jī)構(gòu)的種公馬證書。4實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備4.1一次性耗材采精前1h將一次性無菌耗材放入38℃無菌恒溫干燥箱備用。4.2器械消毒采精筒（假陰道）每次使用前后，應(yīng)使用流動的清水沖洗干凈，用潔凈紗布擦干后，再用75%酒精消毒后自然晾干。玻璃、金屬器械應(yīng)依次使用75%酒精消毒、生理鹽水浸泡并多次沖洗后，置于烘干箱150℃高溫烘干。玻璃器皿使用前先用自來水浸泡，再用加有中性洗滌劑的溫?zé)崛芤核⑾磧纱魏鬀_洗干凈，最后用蒸餾水沖洗2次，洗凈后的玻璃器皿應(yīng)光亮、內(nèi)壁無水滴附著。洗凈的玻璃器皿送入電熱干燥箱，加熱至160℃后恒溫60min,然后溫度調(diào)至38℃?zhèn)溆?。凡與精液、馬生殖器（道）直接接觸的其他器械（耗材）應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒后使用。4.3儀器設(shè)備采精前1h，恒溫水浴鍋水溫設(shè)置為38℃；顯微鏡載物板溫度調(diào)至38℃。4.4配制稀釋液稀釋液的配制方法參見附錄A。4.5實(shí)驗(yàn)室采精前2h，擦拭操作臺，清潔實(shí)驗(yàn)室地面，后用紫外線消毒燈45min。25采精采精按照T/CNHIA19中第4章和第5章確立的程序進(jìn)行操作。6精液品質(zhì)檢查精液品質(zhì)檢查按照T/CNHIA19中第6章規(guī)定的要求進(jìn)行操作。7精液處理7.1離心鮮精用特大容量離心機(jī)離心濃縮，根據(jù)種公馬年齡選擇轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速隨種公馬年齡增加而降低一般以600g～800g離心10min,用細(xì)管除去上清液，除去離心杯底部混有雜質(zhì)的精液，保留純精液。7.2精子密度取0.1mL過濾后的純精液，加入2.4mL生理鹽水，混勻后，使用精液密度測定儀測定并記錄。7.3稀釋使用精液密度測定儀測出所加稀釋液總量，或計算得到所加稀釋液總量，所加稀釋液總量=原精液量*原精液密度*精子活力）/（目標(biāo)冷凍密度/解凍后精子活力）］-原精液量*20%。應(yīng)逐級等溫稀釋，稀釋過程中不應(yīng)將稀釋液快速倒入精液中，避免劇烈震蕩。將34℃的第一稀釋液緩慢加入精液中搖勻，所加量=所加稀釋液總量+精液量）/2］-精液量，將稀釋管放入盛有34℃蒸餾水的燒杯中后再放置于4℃低溫柜中降溫，與此同時將第二稀釋液也放入4℃低溫柜中降溫。平衡2h，當(dāng)降溫至10℃時加入第二稀釋液，所加第二稀釋液的量=所加稀釋液總量-所加第一稀釋液的量。加入第二稀釋液后，在4℃低溫柜中再平衡30min以上，隨后在低溫柜中用分裝一體機(jī)分裝至細(xì)管中，分裝后可進(jìn)行冷凍。7.4編號分裝后的精液應(yīng)進(jìn)行編號，參見附錄B。8精液冷凍8.1全自動冷凍儀操作開啟液氮罐閥門將冷凍儀降溫至4℃,將擺放有凍精細(xì)管的架子迅速放入冷凍儀，蓋嚴(yán)蓋子，按預(yù)先設(shè)定好的程序自動完成冷凍過程。8.2冷凍曲線冷凍的最佳溫度曲線為將細(xì)管精液從4℃降至-35℃,5℃/min，保持15min，-35℃降至-196℃,60℃/min，達(dá)到冷凍狀態(tài)。8.3液氮罐液氮生物容器（液氮罐）應(yīng)符合GB/T5458。8.4收集保存冷凍完成后，打開冷凍容器蓋子，凍精按編號投入到不同提筒中。9凍精檢測9.1解凍3T/CNHIA20—2025用鑷子取出凍精細(xì)管迅速浸入38℃~40℃水浴鍋中并晃動，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠。剪去封口端，滴10μL精液于血細(xì)胞計數(shù)板上進(jìn)行鏡檢。9.2顯微鏡檢查使用顯微鏡檢查或精子質(zhì)量分析系統(tǒng)進(jìn)行測定。解凍后，精液精子活力≥0.4，精子畸形率≤20%，精子頂體完整率≥80%，不合格者應(yīng)廢棄。9.3檢測備案每匹公馬每批次凍精均應(yīng)檢測備案。10包裝凍精包裝應(yīng)在-140℃以下的環(huán)境中進(jìn)行，同馬同一批次包裝到一起，包裝好的凍精入貯存庫。11貯存儲存凍精的液氮罐應(yīng)設(shè)專人保管，每天定時檢查液氮量，并做好記錄，保證凍精始終浸在液氮中。液氮罐應(yīng)置于陰涼通風(fēng)處，每年至少清洗一次并更換新鮮液氮。包裝好的凍精由一個液氮罐轉(zhuǎn)移到另一液氮罐時，凍精在液氮罐外停留時間不得超過3s。取存凍精后應(yīng)蓋好液氮罐塞。在取放蓋塞時，垂直輕拿輕放。移動液氮罐時應(yīng)提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動，不應(yīng)在地上拖行。凍精運(yùn)輸應(yīng)有專人專車負(fù)責(zé)，避免液氮罐發(fā)生碰撞和強(qiáng)烈振動，保證凍精始終浸在液氮中。4（資料性）稀釋液的配制A.1蒸餾水的制備用蒸餾器燒制，嚴(yán)格按照儀器的說明書進(jìn)行操作。A.2電子天平的使用電子天平放置在平穩(wěn)的工作臺上，保持清潔干燥，使用前接通電源，調(diào)整校準(zhǔn)，稱量時方托盤去皮稱量。A.3藥品的取用及保存化學(xué)藥品取用時用專用藥勺，取用后將瓶口蓋嚴(yán)，并妥善保存。A.4卵黃的取用雞蛋來源于無疫病的雞場或農(nóng)家柴雞雞蛋，雞蛋新鮮完整干凈，用75%酒精棉球?qū)Φ皻け砻孢M(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)盡后，用蛋清分離器取出完整的蛋黃，用一次性注射器穿過卵黃膜抽取卵黃。A.5第一稀釋液的配制A.5.1配方配方見表A.1。表A.1第一稀釋液配方（100mL）A.5.2配制按第一稀釋液的配方精確稱取葡萄糖25g、果糖10g、檸檬酸鈉1.5g于400mL水中，充分溶解后，煮沸消毒。待液體冷卻至室溫后加入95mL卵黃，M1995mL，青霉素50萬IU，鏈霉素50萬IU，完成第一稀釋液配制。A.6第二稀釋液的配制取第一稀釋液95mL，加5mL甘油即可。5T/CNHIA20—2025（資料性）細(xì)管凍精的編號B.1組成部分細(xì)管凍精的標(biāo)記由二十一到二十三位數(shù)、分四部分組成，排列順序如下：a)第一部分：公司代號四位數(shù)，公司名稱或育種站字碼代號縮寫；b)第二部分：品種代號二至四位數(shù)，以馬匹品種為依據(jù)；c)第三部分：凍精生產(chǎn)日期六位數(shù)，按年月日各兩位數(shù)次序排列；d)第四部分：公馬號九位數(shù)，取該公馬護(hù)照上身份號碼。B.2編號每兩部分之間空兩字節(jié)。字母代