1-磷酸鞘氨醇對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景血管新生與修復(fù)在維持人體正常生理功能和應(yīng)對疾病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells,EPCs）在其中扮演著極為重要的角色。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有自我更新和分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力。在胚胎發(fā)育階段，EPCs參與了血管的形成，從最初的中胚層分化而來，逐漸遷移并組裝成原始的血管網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)器官的發(fā)育和功能維持提供必要的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在成年個體中，當(dāng)血管受到損傷，如因動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管內(nèi)皮破損，或是在缺血性疾病如心肌梗死、腦梗死等情況下，骨髓中的EPCs會被動員，進(jìn)入血液循環(huán)，遷移至損傷部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與受損血管的修復(fù)，促進(jìn)新血管的生成，從而改善局部組織的血液供應(yīng)。因此，EPCs在血管相關(guān)疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力，有望成為一種有效的細(xì)胞治療手段。在對EPCs的研究中，無血清培養(yǎng)技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，它不含動物血清，避免了血清中可能存在的批間差異、病原體污染以及血清成分對細(xì)胞生長和功能研究的干擾。這使得研究人員能夠更準(zhǔn)確地控制培養(yǎng)條件，深入研究EPCs的生物學(xué)特性和功能。例如，在研究EPCs的分化機(jī)制時，無血清培養(yǎng)可以排除血清中未知生長因子的影響，更清晰地觀察特定誘導(dǎo)因素對EPCs分化的作用。同時，在生物制藥領(lǐng)域，無血清培養(yǎng)有利于目的蛋白的表達(dá)和分離純化，提高產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。然而，無血清培養(yǎng)也面臨著一些挑戰(zhàn)，其中最突出的問題是細(xì)胞凋亡的增加。在無血清狀態(tài)下，細(xì)胞缺乏血清中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、多種氨基酸和維生素等，這些物質(zhì)對于維持細(xì)胞的正常代謝、增殖和存活至關(guān)重要。缺乏這些物質(zhì)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的代謝失衡，激活細(xì)胞凋亡信號通路，使細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。這不僅影響了EPCs的數(shù)量和活性，也限制了無血清培養(yǎng)技術(shù)在EPCs研究和應(yīng)用中的進(jìn)一步發(fā)展。1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-Phosphate,S1P）作為一種具有生物活性的脂質(zhì)信號分子，近年來在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。S1P在細(xì)胞內(nèi)由鞘氨醇經(jīng)鞘氨醇激酶（SphingosineKinase,SPHK）催化生成，然后通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族及Spns2等轉(zhuǎn)運體釋放到細(xì)胞外。在細(xì)胞外，S1P可以與多種細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體（S1PReceptors,S1PRs）結(jié)合，激活下游的多條信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞的增殖、存活、遷移和分化等。已有研究表明，S1P在心血管系統(tǒng)中具有重要的保護(hù)作用，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖，增強血管的穩(wěn)定性。例如，在體外實驗中，給予血管內(nèi)皮細(xì)胞S1P刺激，可以顯著提高細(xì)胞的存活率，減少因氧化應(yīng)激等因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。在動物模型中，增加體內(nèi)S1P的水平可以促進(jìn)缺血組織的血管新生，改善組織的血液灌注。基于S1P在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的這些作用，以及EPCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞的密切關(guān)系，推測S1P可能對無血清狀態(tài)下的EPCs具有保護(hù)作用，能夠抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的活性和功能，但其具體作用及機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的保護(hù)作用及內(nèi)在機(jī)制，為解決無血清培養(yǎng)中EPCs凋亡問題提供新的理論依據(jù)和潛在的解決方案。具體研究目的包括：明確S1P對無血清狀態(tài)下EPCs凋亡的影響，通過實驗檢測不同濃度S1P處理下EPCs的凋亡率，觀察S1P是否能夠抑制細(xì)胞凋亡；確定S1P發(fā)揮保護(hù)作用的最佳濃度和作用時間，優(yōu)化S1P的應(yīng)用條件，為后續(xù)研究和實際應(yīng)用提供參數(shù)參考；揭示S1P保護(hù)EPCs的信號通路及分子機(jī)制，研究S1P與相關(guān)受體結(jié)合后激活的下游信號通路，以及通路中關(guān)鍵分子的變化，闡明S1P保護(hù)作用的內(nèi)在分子機(jī)制。從理論意義來看，本研究有助于深化對EPCs生物學(xué)特性的理解，尤其是在無血清培養(yǎng)這一特殊環(huán)境下細(xì)胞的生存機(jī)制。通過揭示S1P對EPCs的保護(hù)作用機(jī)制，能夠進(jìn)一步明晰細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論。這不僅為EPCs的研究開辟新的方向，也為其他類型細(xì)胞在類似培養(yǎng)條件下的研究提供借鑒，推動細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。在實際應(yīng)用方面，本研究成果具有廣闊的應(yīng)用前景。對于生物制藥行業(yè)，解決無血清培養(yǎng)中EPCs凋亡問題，能夠提高細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和效率，降低生產(chǎn)成本，有利于大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白、抗體等生物制品。在細(xì)胞治療領(lǐng)域，增強EPCs在無血清狀態(tài)下的存活能力，可提升其在缺血性疾病、心血管疾病等治療中的效果，為開發(fā)新型細(xì)胞治療策略提供有力支持。此外，本研究還有助于優(yōu)化組織工程中種子細(xì)胞的培養(yǎng)條件，促進(jìn)組織修復(fù)和再生，為臨床治療提供更有效的手段。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用多種實驗技術(shù)和分析方法，從細(xì)胞水平深入探究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的保護(hù)作用及機(jī)制。在細(xì)胞實驗方面，首先進(jìn)行大鼠骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。通過密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離單個核細(xì)胞，將其接種于含特定生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD133和VEGFR-2的表達(dá)，以鑒定EPCs；利用Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結(jié)合實驗，觀察細(xì)胞對乙酰化低密度脂蛋白的攝取和與荊豆凝集素的結(jié)合能力，進(jìn)一步確認(rèn)EPCs的特性。接著，研究無血清狀態(tài)下EPCs的凋亡情況及S1P的保護(hù)作用。將培養(yǎng)的EPCs分為對照組（無血清培養(yǎng)基處理）和不同濃度S1P處理組（分別給予不同濃度梯度的S1P處理）。在無血清培養(yǎng)不同時間點（如6h、12h、24h），采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，評估S1P對EPCs增殖的影響；運用Transwell小室實驗觀察細(xì)胞遷移能力的變化，分析S1P對EPCs遷移的作用。在機(jī)制探討部分，檢測S1P作用下EPCs內(nèi)相關(guān)信號通路分子的表達(dá)和活性變化。提取細(xì)胞總蛋白，采用Westernblot方法檢測PI3K/Akt、MAPK等信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，如p-Akt、p-ERK1/2等，以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)變化。為進(jìn)一步驗證信號通路的作用，使用相應(yīng)的信號通路抑制劑（如PI3K抑制劑LY294002、MEK抑制劑U0126）預(yù)處理EPCs，再給予S1P處理，觀察細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等指標(biāo)的變化，明確S1P保護(hù)EPCs的信號傳導(dǎo)途徑。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先獲取大鼠骨髓，通過密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，將其接種培養(yǎng)得到EPCs，并進(jìn)行鑒定。隨后，將EPCs分為對照組和S1P處理組，在無血清條件下培養(yǎng)，檢測細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等指標(biāo)，觀察S1P的保護(hù)作用。最后，針對S1P處理組細(xì)胞，檢測相關(guān)信號通路分子表達(dá)及活性變化，使用信號通路抑制劑進(jìn)行驗證，深入探究S1P保護(hù)EPCs的作用機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞獲取、培養(yǎng)、實驗處理到結(jié)果分析的各個步驟及相應(yīng)的檢測指標(biāo)和方法][此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞獲取、培養(yǎng)、實驗處理到結(jié)果分析的各個步驟及相應(yīng)的檢測指標(biāo)和方法]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞概述內(nèi)皮祖細(xì)胞（EndothelialProgenitorCells,EPCs）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管新生和組織修復(fù)等生理病理過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。1997年，Asahara等首次從人外周血中分離出EPCs，這一發(fā)現(xiàn)開啟了EPCs研究的新篇章。EPCs主要來源于骨髓，在胚胎發(fā)育過程中，由中胚層的成血管細(xì)胞分化而來。在成年個體中，當(dāng)機(jī)體受到生理或病理刺激，如缺血、炎癥等，骨髓中的EPCs會被動員進(jìn)入外周血液循環(huán)。研究表明，在心肌梗死小鼠模型中，心肌缺血區(qū)域會釋放多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（StromalCell-DerivedFactor-1,SDF-1）等，這些因子能夠刺激骨髓中的EPCs增殖、遷移，并進(jìn)入外周血，隨后遷移至缺血心肌部位，參與血管新生和心肌修復(fù)。EPCs具有獨特的表面標(biāo)志物，這些標(biāo)志物是鑒定和研究EPCs的重要依據(jù)。早期EPCs表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD133以及血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2，又稱KDR）。其中，CD34是一種高度糖基化的跨膜蛋白，主要表達(dá)于早期造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面；CD133是一種五跨膜糖蛋白，被認(rèn)為是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一；VEGFR-2則是VEGF的主要功能性受體，在EPCs的增殖、遷移和分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著EPCs的分化，其表面標(biāo)志物會發(fā)生動態(tài)變化。當(dāng)EPCs逐漸向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化時，CD133表達(dá)逐漸減少，而血管性血友病因子（vonWillebrandFactor,vWF）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PlateletEndothelialCellAdhesionMolecule-1,PECAM-1，即CD31）等內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)逐漸增加。vWF是一種由內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的大分子糖蛋白，參與止血和血栓形成過程；CD31是一種廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，在細(xì)胞間黏附和信號傳導(dǎo)中起重要作用。EPCs的分化過程是一個復(fù)雜而有序的調(diào)控過程，涉及多種細(xì)胞因子、信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。在體外培養(yǎng)條件下，將分離得到的單個核細(xì)胞接種于含VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF）等生長因子的培養(yǎng)基中，細(xì)胞會逐漸貼壁生長，并開始分化。在分化初期，細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸伸展，形成梭形或多邊形，類似于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。從分子水平來看，VEGF與EPCs表面的VEGFR-2結(jié)合，激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。同時，轉(zhuǎn)錄因子如ETS家族成員（如Ets-1、Ets-2）、FoxO1等也參與調(diào)控EPCs的分化過程。Ets-1能夠結(jié)合到vWF、CD31等內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)，從而推動EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化；FoxO1則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響EPCs的增殖和分化。在血管新生過程中，EPCs發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)組織處于缺血缺氧狀態(tài)時，會釋放一系列促血管生成因子，如VEGF、SDF-1等，這些因子能夠吸引外周血中的EPCs遷移至缺血部位。到達(dá)缺血部位的EPCs，一方面可以直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管的構(gòu)建；另一方面，EPCs還可以通過旁分泌作用，分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如VEGF、肝細(xì)胞生長因子（HepatocyteGrowthFactor,HGF）、一氧化氮（NitricOxide,NO）等，促進(jìn)周圍成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠后肢缺血模型中，移植EPCs能夠顯著促進(jìn)缺血肢體的血管新生，改善肢體的血液灌注。在組織修復(fù)方面，EPCs同樣具有重要作用。例如，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中，EPCs可以遷移至創(chuàng)傷部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，形成新的血管，為創(chuàng)傷修復(fù)提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。同時，EPCs分泌的細(xì)胞因子還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，加速傷口愈合。由于EPCs具有促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)的能力，使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在缺血性疾病治療方面，如心肌梗死、腦梗死、下肢缺血性疾病等，通過移植EPCs有望促進(jìn)缺血組織的血管新生，改善組織的血液供應(yīng)，從而緩解病情，提高患者的生活質(zhì)量。在心血管疾病治療中，EPCs可以用于修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。在組織工程領(lǐng)域，EPCs可作為種子細(xì)胞，用于構(gòu)建組織工程血管、心臟瓣膜等，為器官移植提供新的選擇。然而，EPCs的臨床應(yīng)用也面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，EPCs的來源有限，目前主要從骨髓、外周血和臍帶血中獲取，但這些來源的EPCs數(shù)量和質(zhì)量存在差異，且獲取過程可能對供體造成一定的損傷。其次，EPCs的體外擴(kuò)增和定向分化技術(shù)尚不完善，如何在體外高效擴(kuò)增EPCs并保持其生物學(xué)特性，以及如何精確調(diào)控EPCs的分化方向，仍是亟待解決的問題。此外，EPCs移植后的安全性和有效性也需要進(jìn)一步研究，包括細(xì)胞的存活、遷移、整合以及是否會引發(fā)免疫反應(yīng)、腫瘤形成等問題。2.21-磷酸鞘氨醇概述1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-Phosphate,S1P）是一種在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物活性脂質(zhì)分子，屬于鞘脂類代謝產(chǎn)物。其分子結(jié)構(gòu)獨特，由一個磷酸基團(tuán)與鞘氨醇的1位碳原子相連，這種結(jié)構(gòu)賦予了S1P親水性和疏水性的雙重性質(zhì)，使其能夠在細(xì)胞膜內(nèi)外環(huán)境中穿梭，發(fā)揮信號傳遞作用。S1P廣泛分布于血漿、淋巴液和組織液中，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)過程中扮演著重要角色。S1P的合成代謝途徑較為復(fù)雜，涉及多種酶的參與。在細(xì)胞內(nèi)，鞘磷脂首先在神經(jīng)磷脂酶的作用下生成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺進(jìn)一步在神經(jīng)酰胺酶的催化下轉(zhuǎn)化為鞘氨醇。鞘氨醇是S1P合成的直接前體，它在鞘氨醇激酶（SphingosineKinase,SPHK）的催化下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，最終生成S1P。哺乳動物體內(nèi)存在兩種鞘氨醇激酶同工酶，即SPHK1和SPHK2，它們在氨基酸序列上高度相似，但在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能存在一定差異。SPHK1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，在受到生長因子、細(xì)胞因子等刺激時，可被磷酸化激活并轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上，催化鞘氨醇磷酸化生成S1P，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。而SPHK2主要表達(dá)在某些組織的細(xì)胞核和線粒體內(nèi)膜，參與凋亡的誘導(dǎo)和細(xì)胞周期阻滯。合成后的S1P可以通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族及Spns2等轉(zhuǎn)運體釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮其細(xì)胞外信號分子的作用。在細(xì)胞外，S1P可以與多種細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體（S1PReceptors,S1PRs）結(jié)合，激活下游的多條信號通路。S1PRs屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族，目前已發(fā)現(xiàn)5種不同的亞型，即S1PR1-S1PR5，它們在不同組織中呈現(xiàn)出高度的組織選擇性分布。S1PR1、S1PR2和S1PR3在腦、肺、肝、心、脾、胸腺、腎、骨骼肌等多種組織中廣泛表達(dá)；S1PR4主要表達(dá)于淋巴和造血組織；S1PR5則主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。當(dāng)S1P與相應(yīng)的受體結(jié)合后，會觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活。例如，S1P與S1PR1結(jié)合后，可通過Gi蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，同時激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖；S1P與S1PR2結(jié)合，能夠激活PLC/PKC信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，影響細(xì)胞的遷移和形態(tài)變化；S1P與S1PR3結(jié)合，可激活MAPK信號通路，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。S1P在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的生理功能。在免疫調(diào)節(jié)方面，S1P對淋巴細(xì)胞的遷移和歸巢起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，淋巴組織中的S1P濃度較低，而血液和組織間隙中的S1P濃度相對較高。淋巴細(xì)胞表面表達(dá)S1PR1，當(dāng)淋巴細(xì)胞受到趨化因子等刺激時，其表面的S1PR1被激活，促使淋巴細(xì)胞從淋巴組織遷出，進(jìn)入血液循環(huán)，從而參與全身免疫反應(yīng)。在炎癥部位，S1P水平升高，可吸引淋巴細(xì)胞遷移至炎癥部位，參與局部免疫反應(yīng)，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)S1P信號異常時，可能導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生，如多發(fā)性硬化癥（MS）等，在這些疾病中，S1P受體的功能發(fā)生改變，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞遷移異常，引發(fā)自身免疫攻擊。在血管生成方面，S1P對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成具有顯著的促進(jìn)作用。在胚胎發(fā)育階段，S1P參與了血管的形成過程，它能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新血管的生成，為胚胎的正常發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在成年個體中，當(dāng)組織受到損傷或處于缺血缺氧狀態(tài)時，S1P可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞和成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管新生，參與受損血管的修復(fù)和組織的再生。例如，在小鼠后肢缺血模型中，給予外源性S1P可以顯著促進(jìn)缺血肢體的血管新生，改善肢體的血液灌注。此外，S1P還能增強內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，維持血管內(nèi)皮屏障的完整性，防止血液成分的滲漏，這對于維持血管的正常功能和防止水腫等病理過程具有重要意義。在細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控方面，S1P也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常情況下，S1P通過激活PI3K/Akt等抗凋亡信號通路，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bax的表達(dá)，同時促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的誘導(dǎo)，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。然而，在某些特定條件下，如細(xì)胞受到過度的應(yīng)激刺激或S1P信號通路異常時，S1P也可通過激活凋亡相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。2.3無血清培養(yǎng)技術(shù)無血清培養(yǎng)是指使用不含動物血清的培養(yǎng)基來培養(yǎng)動物細(xì)胞的技術(shù)，這種培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充因子組成。無血清培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)研究領(lǐng)域的一個重要里程碑，它的出現(xiàn)極大地推動了細(xì)胞生物學(xué)、生物制藥等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。在細(xì)胞培養(yǎng)中，無血清培養(yǎng)技術(shù)具有諸多顯著優(yōu)勢。從實驗研究角度來看，無血清培養(yǎng)基的成分明確，這使得培養(yǎng)條件能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和精細(xì)化控制，從而顯著提高了實驗結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。在研究細(xì)胞對特定生長因子的反應(yīng)時，無血清培養(yǎng)基可以精確添加已知濃度的生長因子，避免了血清中未知成分的干擾，使研究人員能夠更準(zhǔn)確地觀察和分析細(xì)胞的生物學(xué)行為。在生物制藥領(lǐng)域，無血清培養(yǎng)技術(shù)有利于目的蛋白的表達(dá)和分離純化。血清中含有大量的蛋白質(zhì)和其他生物分子，這些成分在蛋白純化過程中會增加分離的難度和成本，而無血清培養(yǎng)基可以減少這些雜質(zhì)的干擾，提高產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。無血清培養(yǎng)還能避免血清批次間的質(zhì)量變動，降低了因血清質(zhì)量不穩(wěn)定導(dǎo)致的實驗失敗和生產(chǎn)波動的風(fēng)險。同時，它可以避免血清對細(xì)胞的毒性作用以及血清源性污染，為細(xì)胞提供一個更安全、穩(wěn)定的生長環(huán)境。然而，無血清培養(yǎng)技術(shù)在實際應(yīng)用中也面臨著一些問題和挑戰(zhàn)。其中最突出的問題之一是細(xì)胞凋亡的增加。血清中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、激素和黏附因子等，這些成分對于維持細(xì)胞的正常代謝、增殖和存活至關(guān)重要。在無血清狀態(tài)下，細(xì)胞缺乏這些關(guān)鍵的營養(yǎng)和調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的代謝失衡，能量供應(yīng)不足，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡信號通路。缺乏胰島素會影響細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂；缺少轉(zhuǎn)鐵蛋白會使細(xì)胞無法有效攝取鐵離子，影響細(xì)胞內(nèi)許多含鐵酶的活性，從而干擾細(xì)胞的正常生理功能。這些因素綜合作用，使細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，這不僅影響了細(xì)胞的數(shù)量和活性，也限制了無血清培養(yǎng)技術(shù)在某些領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展。此外，無血清培養(yǎng)基的成本相對較高，其配方的優(yōu)化需要大量的實驗和研究，以滿足不同細(xì)胞類型的特殊需求，這也在一定程度上阻礙了無血清培養(yǎng)技術(shù)的廣泛推廣。常見的無血清培養(yǎng)基通常包含多種成分，以模擬血清對細(xì)胞生長的支持作用。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基的核心組成部分，它提供了細(xì)胞生長所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、葡萄糖、維生素、無機(jī)鹽等。這些成分是細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝、合成蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的基礎(chǔ)原料。DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）、RPMI1640（RoswellParkMemorialInstitute1640medium）等是常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們經(jīng)過優(yōu)化和改良，能夠滿足不同類型細(xì)胞的基本營養(yǎng)需求。除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還需要添加多種補充因子來替代血清的功能。促生長因子及激素是重要的補充成分，不同的細(xì)胞類型對生長因子和激素的需求各異。表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等生長因子能夠刺激細(xì)胞的增殖和分化；胰島素對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝和促進(jìn)細(xì)胞生長具有重要作用；甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素等激素也參與細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)過程。促貼壁物質(zhì)對于貼壁依賴性細(xì)胞的生長至關(guān)重要，許多細(xì)胞需要貼附在固體表面才能正常生長和增殖。無血清培養(yǎng)基中常添加纖連蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分作為促貼壁物質(zhì)，它們不僅能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，還能影響細(xì)胞的形態(tài)、遷移和分化等生物學(xué)行為。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白也是無血清培養(yǎng)基的重要組成部分，轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠結(jié)合和轉(zhuǎn)運鐵離子，為細(xì)胞提供必要的微量元素；牛血清白蛋白（BSA）可以增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，同時還能結(jié)合和運輸一些脂溶性物質(zhì)和生長因子。在進(jìn)行無血清培養(yǎng)時，需要掌握一些關(guān)鍵的操作要點和注意事項。細(xì)胞的適應(yīng)過程是無血清培養(yǎng)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。細(xì)胞從含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基需要一個逐步適應(yīng)的過程，一般采用逐步降低血清濃度的方法，從10%減少到5%，3%，1%，直至完全無血清培養(yǎng)。在這個過程中，要密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和功能變化，如細(xì)胞是否出現(xiàn)皺縮、死亡，細(xì)胞的增殖速率是否受到影響，細(xì)胞的特異性功能是否保持穩(wěn)定等。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常，應(yīng)及時調(diào)整適應(yīng)方案，例如適當(dāng)延長某個血清濃度階段的培養(yǎng)時間，或者添加一些輔助因子來幫助細(xì)胞適應(yīng)無血清環(huán)境。配制無血清培養(yǎng)基時，對水的質(zhì)量要求極高。必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。這是因為無血清培養(yǎng)基缺乏血清中天然存在的能夠中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子物質(zhì)，即使水中的有毒物質(zhì)含量極低，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。在無血清培養(yǎng)過程中，要嚴(yán)格控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度、氣體成分等條件。溫度的波動可能影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性和代謝速率；濕度不足會導(dǎo)致培養(yǎng)基蒸發(fā)過快，改變培養(yǎng)基的成分濃度；氣體成分（如氧氣、二氧化碳）的失衡會影響細(xì)胞的呼吸和酸堿平衡。因此，需要使用高精度的培養(yǎng)設(shè)備，并定期對設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，以確保培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。還要加強對細(xì)胞培養(yǎng)過程的監(jiān)測和質(zhì)量控制，定期檢測細(xì)胞的生長狀態(tài)、活力、純度等指標(biāo)，及時發(fā)現(xiàn)和解決可能出現(xiàn)的問題。三、無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的特性及凋亡情況3.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定本研究選取4周齡的SD大鼠作為實驗對象，通過頸椎脫臼法將其處死，隨后迅速將大鼠置于75%乙醇中浸泡消毒5-8min，以確保實驗環(huán)境的無菌性。在超凈工作臺中，將大鼠固定于無菌解剖臺上，小心取下完整的股骨和肱骨，并浸泡在含有PBS的培養(yǎng)皿中。使用眼科剪剪開兩端骨骺皮質(zhì)層，充分顯露骨髓腔，用1mL注射器吸取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)變?yōu)榘咨砻鞴撬枰驯怀浞譀_洗出來。將沖洗得到的骨髓細(xì)胞懸液進(jìn)行吹打，使其均勻分散，然后用吸管吸取，沿試管壁緩慢滴加于含等比例的淋巴細(xì)胞分離液液面上。將試管放入離心機(jī)中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，此時可觀察到試管中溶液分為明顯的幾層，單核細(xì)胞層位于上、中層界面處，呈現(xiàn)出云霧狀。用吸管小心吸出該單核細(xì)胞層，置于另一個50mL離心管中，加入5倍體積的PBS，輕輕混勻后，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。重復(fù)洗滌2次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液及其他雜質(zhì)，最后棄去上清液，加入EGM-2-MV培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。使用細(xì)胞計數(shù)板對重懸后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后以1×10?/mL的密度將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入5%CO?、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行密切觀察。首次接種后24h內(nèi)，單核細(xì)胞呈小圓形，懸浮在培養(yǎng)液中。48h內(nèi)，部分細(xì)胞開始貼壁，貼壁細(xì)胞胞質(zhì)少，呈長梭形，細(xì)胞胞體較大，部分胞體融合，其中含有大量成纖維樣細(xì)胞，呈漩渦樣排列。此時，將上清液中未貼壁細(xì)胞移入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對48h內(nèi)和48h后貼壁細(xì)胞分別進(jìn)行觀察，48h后貼壁細(xì)胞以短梭形為主，也有三角形、多角形及紡錘形，培養(yǎng)7d后，有明顯干細(xì)胞集落出現(xiàn)，細(xì)胞胞質(zhì)多，胞核小，集落中間的細(xì)胞為圓形，周邊為梭形，呈出芽生長，這種結(jié)構(gòu)類似于血島，呈放射狀排列。當(dāng)細(xì)胞融合度約達(dá)到80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS沖洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰酶-0.01%EDTA消化液，在37℃孵育1-2min，待細(xì)胞變圓且開始脫落時，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平均每代細(xì)胞的生長周期為3-5d，細(xì)胞可增殖至第6代，且在第6代之前未見明顯衰老。第6代以后，細(xì)胞逐漸接近于內(nèi)皮細(xì)胞，呈現(xiàn)出典型的鋪路卵石樣外觀，并開始出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。為了準(zhǔn)確鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為內(nèi)皮祖細(xì)胞，采用了多種鑒定方法。進(jìn)行Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結(jié)合實驗。取第2代細(xì)胞，用胰酶消化后收集，調(diào)整單細(xì)胞懸液密度為10?-10?/mL，接種于孔底部放有蓋玻片的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)3d。棄去上清液，用PBS洗滌3次，每孔加入1mL培養(yǎng)基和2.5μLDil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL），置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h。之后，用2%低聚甲醛固定細(xì)胞20min，每孔再加入1mL培養(yǎng)基和10μLFITC-UEA-1（FITC標(biāo)記的凝集素-1），繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h。取出細(xì)胞爬片，用防淬滅劑中性樹脂封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，攝取了Dil-ac-LDL的細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色熒光，結(jié)合了FITC-UEA-1的細(xì)胞胞膜呈綠色熒光，雙染陽性的細(xì)胞呈現(xiàn)出橙黃色熒光，這些橙黃色熒光的細(xì)胞即為正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。取第2代細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為10?-10?/mL，分裝成3個EP管。在第1管中加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10μLFITC-小鼠抗CD133單克隆抗體；第2管中加入10μLPE-小鼠抗CD34單克隆抗體和10μLFITC-小鼠抗VEGFR-2單克隆抗體；第3管加入PE-小鼠IgG二抗作為同型對照。將3管同時置于4℃避光孵育60min，之后用PBS清洗2次，各管分別加入2%低聚甲醛500μL，固定45min，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。以488nm氫離子綠光為激發(fā)波長檢測PE-CD34，以633nm氫離子紅光為激發(fā)波長檢測FITC-VEGFR2及FITC-CD133，每次計數(shù)5000個細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀分析熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞中CD34、CD133、VEGFR-2陽性細(xì)胞比例較高，進(jìn)一步證實了所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。3.2無血清狀態(tài)對內(nèi)皮祖細(xì)胞特性的影響為了深入探究無血清狀態(tài)對內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）特性的影響，本研究進(jìn)行了一系列實驗。將分離培養(yǎng)得到的EPCs分為兩組，一組使用含有10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（對照組），另一組使用無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（無血清組）。在細(xì)胞形態(tài)方面，通過倒置顯微鏡對兩組細(xì)胞進(jìn)行觀察。在培養(yǎng)初期，兩組細(xì)胞形態(tài)差異不明顯，均呈梭形或多邊形，具有典型的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征。隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞伸展充分，相互之間連接緊密，呈現(xiàn)出典型的“鋪路石”樣排列。而無血清組細(xì)胞在培養(yǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞之間的連接變得松散；培養(yǎng)48h后，變圓的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞皺縮，貼壁能力下降，部分細(xì)胞開始脫落，呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)特征。這表明無血清狀態(tài)對EPCs的形態(tài)維持產(chǎn)生了不利影響，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸失去正常的生長形態(tài)。在細(xì)胞增殖能力方面，采用MTT法進(jìn)行檢測。具體操作如下：將兩組細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的OD值隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，表明細(xì)胞增殖活躍。在培養(yǎng)72h時，對照組細(xì)胞的OD值顯著高于0h時的OD值（P<0.01）。而無血清組細(xì)胞的OD值在培養(yǎng)初期略有升高，但在培養(yǎng)48h后，OD值不再明顯增加，甚至在72h時出現(xiàn)下降趨勢。與對照組相比，無血清組細(xì)胞在培養(yǎng)48h和72h時的OD值均顯著降低（P<0.01）。這說明無血清狀態(tài)下EPCs的增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增長緩慢甚至減少。在細(xì)胞遷移能力方面，運用Transwell實驗進(jìn)行檢測。實驗前，將Transwell小室（孔徑8μm）放入24孔板中，在下室加入600μL含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基作為趨化因子。將兩組細(xì)胞用胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。在上室加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15min。用PBS沖洗3次后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量較多，平均每個視野的細(xì)胞數(shù)為（125.6±10.2）個。而無血清組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯減少，平均每個視野的細(xì)胞數(shù)僅為（45.3±6.5）個。與對照組相比，無血清組細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著降低（P<0.01）。這表明無血清狀態(tài)嚴(yán)重削弱了EPCs的遷移能力，使細(xì)胞難以遷移到損傷部位，從而影響其在血管修復(fù)和再生中的作用。3.3無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡檢測與分析為了準(zhǔn)確檢測無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的凋亡情況，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在正常細(xì)胞中，PS主要位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，而在早期凋亡細(xì)胞中，PS會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，此時AnnexinV可以與PS特異性結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞中，細(xì)胞膜受損，PI能夠透過細(xì)胞膜與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，從而使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光。通過AnnexinV-FITC（異硫氰酸熒光素標(biāo)記的AnnexinV，發(fā)綠色熒光）與PI雙染，可以將正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。具體實驗操作如下：將培養(yǎng)的EPCs分為對照組（含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）和無血清組（無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）。在培養(yǎng)24h后，收集兩組細(xì)胞，用PBS清洗2次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，將細(xì)胞重懸于100μL的BindingBuffer中，加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，再加入400μL的BindingBuffer，充分混勻后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀檢測時，以FITC為橫坐標(biāo)（檢測AnnexinV-FITC的熒光強度），以PI為縱坐標(biāo)（檢測PI的熒光強度），通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的分布情況來確定細(xì)胞凋亡率。其中，AnnexinV-FITC陰性/PI陰性的細(xì)胞為正?；罴?xì)胞；AnnexinV-FITC陽性/PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；AnnexinV-FITC陽性/PI陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；AnnexinV-FITC陰性/PI陽性的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞數(shù)為早期凋亡細(xì)胞數(shù)與晚期凋亡細(xì)胞數(shù)之和，凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。實驗結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的凋亡率較低，僅為（5.6±1.2）%，其中早期凋亡細(xì)胞占（3.2±0.8）%，晚期凋亡細(xì)胞占（2.4±0.6）%。而無血清組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，達(dá)到（35.8±4.5）%，早期凋亡細(xì)胞占（18.6±3.2）%，晚期凋亡細(xì)胞占（17.2±2.8）%。與對照組相比，無血清組細(xì)胞的凋亡率明顯增加（P<0.01），表明無血清狀態(tài)能夠顯著誘導(dǎo)EPCs發(fā)生凋亡。為了進(jìn)一步驗證無血清狀態(tài)下EPCs凋亡增加的結(jié)果，本研究還采用了TUNEL法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）進(jìn)行檢測。TUNEL法的原理是利用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-OH末端，然后通過與標(biāo)記物特異性結(jié)合的熒光素或酶等顯色系統(tǒng)，在顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)出特異性的熒光或顏色變化，從而對凋亡細(xì)胞進(jìn)行定性和定量分析。具體操作步驟為：將培養(yǎng)24h后的兩組細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15min，然后用PBS沖洗3次。接著，加入0.1%TritonX-100通透液處理5min，以增加細(xì)胞膜的通透性，使TdT酶能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與斷裂的DNA結(jié)合。再次用PBS沖洗3次后，加入TUNEL反應(yīng)混合液（包含TdT酶和標(biāo)記的dUTP），37℃避光孵育60min。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，然后加入DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液，室溫避光孵育10min，以標(biāo)記細(xì)胞核。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于TdT酶將標(biāo)記的dUTP連接到斷裂DNA的3'-OH末端，會呈現(xiàn)出綠色熒光（若使用的是熒光素標(biāo)記的dUTP）。隨機(jī)選取10個視野，計數(shù)每個視野中的總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計算凋亡率。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的凋亡率為（6.8±1.5）%，無血清組細(xì)胞的凋亡率為（38.5±5.2）%，無血清組細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組（P<0.01），這與AnnexinV-FITC/PI雙染法的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了無血清狀態(tài)下EPCs凋亡明顯增加。為了深入探究無血清狀態(tài)下EPCs凋亡增加的分子機(jī)制，本研究對凋亡相關(guān)蛋白如Bax、Bcl-2的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。Bax（Bcl-2-associatedXprotein）是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等凋亡因子釋放，從而激活下游的凋亡信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2（B-celllymphoma-2）是一種抗凋亡蛋白，它可以與Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡活性，維持細(xì)胞的存活。通過Westernblot實驗檢測兩組細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。具體操作如下：收集培養(yǎng)24h后的對照組和無血清組細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA（BicinchoninicAcid）法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（PolyvinylideneFluoride）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。然后，分別加入兔抗鼠Bax多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST（Tris-BufferedSalinewithTween-20）洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP（HorseradishPeroxidase）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，加入ECL（EnhancedChemiluminescence）發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算Bax和Bcl-2蛋白相對于β-actin的表達(dá)量。結(jié)果顯示，無血清組細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.01），而Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著低于對照組（P<0.01）。Bax/Bcl-2的比值在無血清組中明顯升高，表明無血清狀態(tài)下EPCs的凋亡增加可能與Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值失衡有關(guān)。線粒體膜電位的改變在細(xì)胞凋亡過程中也起著關(guān)鍵作用。正常情況下，線粒體膜電位（ΔΨm）處于較高水平，維持著線粒體的正常功能。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C等凋亡因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究采用JC-1（5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide，5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物）染色法檢測無血清狀態(tài)下EPCs線粒體膜電位的變化。JC-1是一種陽離子熒光染料，在正常細(xì)胞中，由于線粒體膜電位較高，JC-1可以聚集在線粒體內(nèi)，形成J-聚集體，發(fā)出紅色熒光。而在凋亡細(xì)胞中，線粒體膜電位下降，JC-1不能聚集在線粒體內(nèi)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過檢測紅色熒光與綠色熒光的比值，可以反映線粒體膜電位的變化。具體實驗步驟為：將培養(yǎng)24h后的對照組和無血清組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×10?個/mL。然后，向每孔中加入10μL的JC-1工作液（用培養(yǎng)基稀釋至1mg/mL），37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的JC-1染料。最后，在熒光酶標(biāo)儀上分別檢測488nm激發(fā)波長下的綠色熒光強度（F525）和530nm激發(fā)波長下的紅色熒光強度（F590），計算紅色熒光與綠色熒光的比值（F590/F525）。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的F590/F525比值較高，為（2.56±0.32），表明線粒體膜電位處于較高水平。而無血清組細(xì)胞的F590/F525比值顯著降低，僅為（0.85±0.15），與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明無血清狀態(tài)下EPCs的線粒體膜電位明顯下降，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加的重要原因之一。四、1-磷酸鞘氨醇對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用4.1實驗設(shè)計與分組本實驗旨在研究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的保護(hù)作用，共設(shè)置了以下三組：正常對照組、無血清對照組、1-磷酸鞘氨醇不同濃度處理組。正常對照組：將培養(yǎng)的EPCs接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10?個，加入含有10%胎牛血清的EGM-2-MV完全培養(yǎng)基2mL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔24h更換一次培養(yǎng)基，以確保細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定和營養(yǎng)物質(zhì)的充足供應(yīng)。正常對照組作為實驗的參照標(biāo)準(zhǔn)，用于對比其他組細(xì)胞在無血清及S1P處理條件下的生長、凋亡等特性變化。無血清對照組：同樣將EPCs以5×10?個/孔的密度接種于6孔板，加入無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基2mL。無血清培養(yǎng)基在使用前需進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，確保其成分的準(zhǔn)確性和無菌性。該組細(xì)胞在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中不更換培養(yǎng)基，以模擬無血清的惡劣環(huán)境對EPCs的影響。通過與正常對照組對比，觀察無血清狀態(tài)下EPCs的生長、凋亡等生物學(xué)特性的改變。1-磷酸鞘氨醇不同濃度處理組：將EPCs接種于6孔板，密度為5×10?個/孔，分別加入含不同濃度S1P的無血清EGM-2-MV培養(yǎng)基2mL。S1P的濃度設(shè)置為0.1μM、1μM、10μM和20μM四個梯度，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。S1P溶液在使用前需用無菌PBS進(jìn)行稀釋，配制成所需濃度。處理組細(xì)胞同樣在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中不更換培養(yǎng)基。該組用于研究不同濃度S1P對無血清狀態(tài)下EPCs的保護(hù)作用，通過比較不同濃度處理組與無血清對照組的實驗結(jié)果，確定S1P發(fā)揮保護(hù)作用的最佳濃度。4.21-磷酸鞘氨醇對內(nèi)皮祖細(xì)胞存活與增殖的影響為了探究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）存活與增殖的影響，本研究采用了MTT法和CCK-8法進(jìn)行檢測。MTT法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀在特定波長下測定其吸光度，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，從而反映細(xì)胞的存活與增殖情況。CCK-8法（CellCountingKit-8）則是利用WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，同樣通過酶標(biāo)儀檢測吸光度來評估細(xì)胞的活性。將處于對數(shù)生長期的EPCs以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。實驗分為正常對照組（含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基）、無血清對照組（無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基）以及不同濃度S1P處理組（在無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基中分別加入0.1μM、1μM、10μM、20μM的S1P）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時進(jìn)行檢測。對于MTT法，在相應(yīng)時間點向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。然后使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。CCK-8法的操作則是在各時間點向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h（根據(jù)細(xì)胞生長情況確定具體孵育時間，一般在2h左右效果較好）。孵育完成后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度。通過MTT法檢測得到的結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞的OD值隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。在培養(yǎng)24h時，OD值較0h時有所增加；培養(yǎng)48h時，OD值進(jìn)一步升高，且與24h時相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)72h時，OD值繼續(xù)顯著上升，與48h時相比，P<0.01。這表明在正常含血清培養(yǎng)條件下，EPCs能夠正常增殖，細(xì)胞數(shù)量不斷增加。無血清對照組細(xì)胞的OD值在培養(yǎng)初期（0-24h）略有上升，但增長幅度明顯小于正常對照組。在培養(yǎng)48h后，OD值基本不再增加，甚至在72h時出現(xiàn)輕微下降趨勢。與正常對照組相比，無血清對照組在培養(yǎng)24h、48h、72h時的OD值均顯著降低（P<0.01），這說明無血清狀態(tài)嚴(yán)重抑制了EPCs的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞存活數(shù)量減少。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的增加，細(xì)胞的OD值呈現(xiàn)出不同程度的上升。0.1μMS1P處理組在培養(yǎng)24h時，OD值較無血清對照組略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；培養(yǎng)48h和72h時，OD值顯著高于無血清對照組（P<0.05）。1μMS1P處理組在培養(yǎng)24h時，OD值明顯高于無血清對照組（P<0.05）；培養(yǎng)48h和72h時，OD值與無血清對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。10μM和20μMS1P處理組在各個時間點的OD值均顯著高于無血清對照組（P<0.01），且20μMS1P處理組在培養(yǎng)72h時的OD值與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1P能夠有效促進(jìn)無血清狀態(tài)下EPCs的存活與增殖，且在一定范圍內(nèi)，隨著S1P濃度的增加，其促進(jìn)作用增強。CCK-8法檢測結(jié)果與MTT法基本一致。正常對照組細(xì)胞的吸光度值隨培養(yǎng)時間持續(xù)上升，反映出細(xì)胞增殖活躍。無血清對照組吸光度值增長緩慢，后期甚至出現(xiàn)停滯，表明細(xì)胞增殖受到抑制。不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度升高，吸光度值逐漸增大，說明S1P能夠改善無血清狀態(tài)下EPCs的增殖情況。為了更直觀地展示細(xì)胞的增殖情況，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。從生長曲線可以清晰地看出，正常對照組細(xì)胞的生長曲線呈穩(wěn)步上升趨勢，表明細(xì)胞在含血清培養(yǎng)條件下能夠持續(xù)、穩(wěn)定地增殖。無血清對照組細(xì)胞的生長曲線在初期上升緩慢，隨后趨于平緩，甚至略有下降，體現(xiàn)了無血清環(huán)境對細(xì)胞增殖的抑制作用。不同濃度S1P處理組的生長曲線則介于正常對照組和無血清對照組之間，且隨著S1P濃度的增加，生長曲線逐漸向正常對照組靠近。其中，20μMS1P處理組的生長曲線在后期與正常對照組基本重合，進(jìn)一步證明了高濃度S1P對無血清狀態(tài)下EPCs存活與增殖的顯著促進(jìn)作用。4.31-磷酸鞘氨醇對內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移與黏附能力的影響為了探究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）遷移與黏附能力的影響，本研究分別采用Transwell小室實驗和細(xì)胞黏附實驗進(jìn)行檢測。在Transwell小室實驗中，選用孔徑為8μm的Transwell小室，將其置于24孔板中。實驗前，先對Transwell小室進(jìn)行預(yù)處理，以提高細(xì)胞的貼壁和遷移效果。下室加入600μL含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基作為趨化因子，以模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的化學(xué)梯度環(huán)境。將處于對數(shù)生長期的EPCs分為正常對照組（含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）、無血清對照組（無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）以及不同濃度S1P處理組（在無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基中分別加入0.1μM、1μM、10μM、20μM的S1P）。用胰酶消化各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。在上室加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15min，以固定遷移到下室的細(xì)胞。然后用0.1%結(jié)晶紫染色15min，使細(xì)胞染色，便于在顯微鏡下觀察。用PBS沖洗3次后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量較多，平均每個視野的細(xì)胞數(shù)為（135.2±12.5）個。無血清對照組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯減少，平均每個視野的細(xì)胞數(shù)僅為（35.6±5.8）個，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明無血清狀態(tài)顯著抑制了EPCs的遷移能力。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的增加，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。0.1μMS1P處理組細(xì)胞遷移到下室的平均數(shù)量為（56.3±8.2）個，與無血清對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1μMS1P處理組細(xì)胞遷移到下室的平均數(shù)量為（85.4±10.3）個，與無血清對照組相比，差異高度顯著（P<0.01）。10μMS1P處理組細(xì)胞遷移到下室的平均數(shù)量為（110.5±11.6）個，20μMS1P處理組細(xì)胞遷移到下室的平均數(shù)量為（128.3±13.4）個，這兩組與無血清對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且20μMS1P處理組細(xì)胞遷移數(shù)量與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1P能夠顯著促進(jìn)無血清狀態(tài)下EPCs的遷移能力，且在一定范圍內(nèi)，隨著S1P濃度的增加，其促進(jìn)作用增強。在細(xì)胞黏附實驗中，將96孔板用纖連蛋白包被，每孔加入50μL纖連蛋白溶液（10μg/mL），4℃過夜孵育，使纖連蛋白牢固地結(jié)合在孔板表面，為細(xì)胞黏附提供基質(zhì)。次日，用PBS沖洗3次，以去除未結(jié)合的纖連蛋白。將各組EPCs用胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/mL。每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h，使細(xì)胞充分黏附在孔板上。孵育結(jié)束后，用PBS輕輕沖洗3次，去除未黏附的細(xì)胞。然后向每孔加入100μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育完成后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），吸光度值與黏附的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。實驗結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞的OD值較高，為（0.85±0.08）。無血清對照組細(xì)胞的OD值明顯降低，為（0.32±0.05），與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明無血清狀態(tài)下EPCs的黏附能力顯著下降。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的升高，細(xì)胞的OD值逐漸增大。0.1μMS1P處理組細(xì)胞的OD值為（0.45±0.06），與無血清對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1μMS1P處理組細(xì)胞的OD值為（0.58±0.07），與無血清對照組相比，差異高度顯著（P<0.01）。10μMS1P處理組細(xì)胞的OD值為（0.72±0.09），20μMS1P處理組細(xì)胞的OD值為（0.80±0.10），這兩組與無血清對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且20μMS1P處理組細(xì)胞的OD值與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1P能夠有效增強無血清狀態(tài)下EPCs的黏附能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著S1P濃度的增加，其增強作用更加明顯。4.41-磷酸鞘氨醇對內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的抑制作用為了深入探究1-磷酸鞘氨醇（S1P）對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）凋亡的抑制作用，本研究采用了多種實驗方法進(jìn)行檢測與分析。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。將培養(yǎng)的EPCs分為正常對照組（含10%胎牛血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）、無血清對照組（無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)）以及不同濃度S1P處理組（在無血清的EGM-2-MV培養(yǎng)基中分別加入0.1μM、1μM、10μM、20μM的S1P）。在培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，用PBS清洗2次，去除殘留的培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于100μL的BindingBuffer中，加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，再加入400μL的BindingBuffer，充分混勻后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞的凋亡率較低，為（5.2±1.0）%。無血清對照組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，達(dá)到（38.5±4.2）%，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸降低。0.1μMS1P處理組細(xì)胞的凋亡率為（30.2±3.5）%，與無血清對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1μMS1P處理組細(xì)胞的凋亡率為（22.5±2.8）%，與無血清對照組相比，差異高度顯著（P<0.01）。10μMS1P處理組細(xì)胞的凋亡率為（15.6±2.0）%，20μMS1P處理組細(xì)胞的凋亡率為（8.5±1.5）%，這兩組與無血清對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且20μMS1P處理組細(xì)胞的凋亡率與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1P能夠顯著抑制無血清狀態(tài)下EPCs的凋亡，且在一定范圍內(nèi)，隨著S1P濃度的增加，其抑制作用增強。通過檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)caspase-3活性和PARP裂解情況，進(jìn)一步分析S1P對無血清誘導(dǎo)EPCs凋亡的抑制效果。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，在凋亡信號的激活下，無活性的caspase-3前體被切割激活，形成具有活性的caspase-3，進(jìn)而切割一系列細(xì)胞內(nèi)的底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）是caspase-3的重要底物之一，在細(xì)胞凋亡時，PARP會被caspase-3特異性切割，產(chǎn)生89kD的裂解片段，這一過程是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志之一。采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞中caspase-3的活性。將培養(yǎng)24h后的各組細(xì)胞收集，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清液，得到細(xì)胞裂解物。然后，將細(xì)胞裂解物與caspase-3底物Ac-DEVD-pNA混合，在37℃孵育1-2h。caspase-3會特異性地切割底物Ac-DEVD-pNA，釋放出對硝基苯胺（pNA），pNA在405nm波長處有最大吸收峰。通過酶標(biāo)儀檢測405nm波長處的吸光度，吸光度值與caspase-3活性呈正相關(guān)。實驗結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞中caspase-3活性較低，吸光度值為（0.25±0.05）。無血清對照組細(xì)胞中caspase-3活性顯著升高，吸光度值為（0.85±0.10），與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的增加，caspase-3活性逐漸降低。0.1μMS1P處理組細(xì)胞中caspase-3活性的吸光度值為（0.65±0.08），與無血清對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1μMS1P處理組細(xì)胞中caspase-3活性的吸光度值為（0.45±0.06），與無血清對照組相比，差異高度顯著（P<0.01）。10μMS1P處理組細(xì)胞中caspase-3活性的吸光度值為（0.30±0.04），20μMS1P處理組細(xì)胞中caspase-3活性的吸光度值為（0.28±0.03），這兩組與無血清對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且20μMS1P處理組細(xì)胞中caspase-3活性與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1P能夠有效抑制無血清狀態(tài)下EPCs中caspase-3的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。采用Westernblot方法檢測PARP的裂解情況。收集培養(yǎng)24h后的各組細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。然后，加入兔抗鼠PARP多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，分析蛋白條帶的灰度值。結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞中幾乎檢測不到PARP的裂解片段，而無血清對照組細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的89kDPARP裂解片段，表明PARP被大量切割。在不同濃度S1P處理組中，隨著S1P濃度的增加，PARP的裂解片段逐漸減少。20μMS1P處理組細(xì)胞中PARP的裂解程度明顯低于無血清對照組，與正常對照組相近。這進(jìn)一步證實了S1P能夠抑制無血清狀態(tài)下EPCs中PARP的裂解，從而抑制細(xì)胞凋亡。五、1-磷酸鞘氨醇保護(hù)無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制探討5.1基于信號通路的機(jī)制研究5.1.11-磷酸鞘氨醇與相關(guān)受體的結(jié)合1-磷酸鞘氨醇（S1P）作為一種重要的生物活性脂質(zhì)分子，其生物學(xué)功能的發(fā)揮主要依賴于與細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體（S1PReceptors,S1PRs）結(jié)合。目前已知S1PRs有五種亞型，分別為S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5，它們均屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族。這些受體在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)具有高度的組織選擇性，這決定了S1P在不同細(xì)胞類型中發(fā)揮的生物學(xué)功能存在差異。在心血管系統(tǒng)中，S1PR1、S1PR2和S1PR3廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞等，參與調(diào)節(jié)血管生成、血管舒張、心肌收縮等生理過程。S1PR1在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其激活可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，有利于血管新生；S1PR2則主要參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的收縮和舒張功能，影響血管的張力；S1PR3在心肌細(xì)胞中表達(dá)，與心肌的收縮和舒張功能密切相關(guān)。S1PR4主要表達(dá)于淋巴和造血組織，在淋巴細(xì)胞的歸巢和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。S1PR5主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、遷移和功能調(diào)節(jié)有關(guān)。為了探究S1P對無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的保護(hù)作用是否通過與特定受體結(jié)合介導(dǎo)，本研究首先采用RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和Westernblot技術(shù)檢測EPCs中S1PRs各亞型的表達(dá)水平。RT-PCR是一種將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，通過設(shè)計針對不同S1PRs亞型的特異性引物，可擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段，從而檢測其mRNA表達(dá)水平。Westernblot則是通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至固相載體（如PVDF膜）上，用特異性抗體檢測目的蛋白的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，EPCs中S1PR1、S1PR2和S1PR3呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，而S1PR4和S1PR5的表達(dá)水平較低，幾乎檢測不到。這表明在EPCs中，S1PR1、S1PR2和S1PR3可能是S1P發(fā)揮作用的主要受體亞型。為了進(jìn)一步驗證這一推測，本研究利用特異性的S1PRs受體拮抗劑進(jìn)行實驗。分別選取針對S1PR1的拮抗劑W146、針對S1PR2的拮抗劑JTE-013和針對S1PR3的拮抗劑CAY10444。將培養(yǎng)的EPCs分為對照組、S1P處理組以及S1P與不同受體拮抗劑聯(lián)合處理組。在聯(lián)合處理組中，先將EPCs與相應(yīng)的受體拮抗劑孵育30min，使其與受體充分結(jié)合，阻斷受體的活性，然后再加入S1P進(jìn)行處理。通過檢測細(xì)胞的凋亡率、增殖活性和遷移能力等指標(biāo)，觀察受體拮抗劑對S1P保護(hù)作用的影響。實驗結(jié)果表明，當(dāng)加入S1PR1拮抗劑W146后，S1P對EPCs凋亡的抑制作用、增殖的促進(jìn)作用以及遷移的增強作用均受到顯著抑制。與單獨S1P處理組相比，聯(lián)合處理組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，增殖活性和遷移能力顯著降低（P<0.05）。這說明S1PR1在S1P保護(hù)無血清狀態(tài)下EPCs的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)加入S1PR2拮抗劑JTE-013時，S1P對EPCs的保護(hù)作用也受到一定程度的影響，但影響程度相對較小。聯(lián)合處理組細(xì)胞的凋亡率有所升高，增殖活性和遷移能力有所下降，但與單獨S1P處理組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明S1PR2在S1P保護(hù)EPCs的作用中可能起到輔助作用。而加入S1PR3拮抗劑CAY10444后，S1