核酸的分離純化及鑒定技術(shù)生化分析描述提取核酸的目的:1.實(shí)驗(yàn)研究2.用于研制核酸類藥物及保健品?核酸分離與純化的設(shè)計(jì)與原則2020/12/132主要核酸類藥物及用途

名稱治療范圍核糖核酸（RNA）口服用于精神遲緩、記憶衰退、動(dòng)脈硬化性癡呆治療；靜脈注射用于刺激造血和促進(jìn)白細(xì)胞生成，治療慢性肝炎、肝硬化初期癌癥脫氧核糖核酸（DNA）有抗放射作用，能改善機(jī)體虛弱疲勞；與細(xì)胞毒藥物合用，能提高細(xì)胞毒藥物對(duì)癌細(xì)胞的選擇性作用；與紅霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌療效免疫核糖核酸（iRNA）推動(dòng)正常RNA分子在基因水平上通過對(duì)癌細(xì)胞DNA分子進(jìn)行誘導(dǎo)，或通過反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)促使癌細(xì)胞發(fā)生逆分化，如：可用于肝炎治療的抗乙肝iRNA，治療肺癌的抗肺癌iRNA轉(zhuǎn)移因子（TF）相對(duì)分子質(zhì)量較小，含有多核苷酸、多肽化合物，Mr<10000；它只傳遞細(xì)胞免疫信息，無體液免疫作用，不致促進(jìn)腫瘤生長，治療惡性腫瘤比較安全；亦可用于治療肝炎等2020/12/133主要核酸類藥物及用途名稱治療范圍聚肌胞苷酸（聚肌胞）干擾素誘導(dǎo)物，具有廣普抗病毒作用；用化學(xué)合成、酶促合成方法生產(chǎn)腺苷三磷酸（ATP）用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、腦動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈硬化、急性脊髓灰質(zhì)炎、肌肉萎縮、慢性肝炎等核酸-氨基酸混合物用于氣管炎、神經(jīng)衰弱等輔酶A（CoA）用于動(dòng)脈硬化，白細(xì)胞、血小板減少，肝、腎病脫氧核苷酸鈉用于放療、化療引起的急性白細(xì)胞減少癥腺苷一磷酸（AMP）有周圍血管擴(kuò)張作用、減壓作用；用于靜脈曲張性潰瘍等鳥苷三磷酸（GTP）用于慢性肝炎、進(jìn)行性肌肉萎縮等癥輔酶Ⅰ（NDA）用于白細(xì)胞減少及冠狀動(dòng)脈硬化輔酶Ⅱ（NADP）促進(jìn)體內(nèi)物質(zhì)的生物氧化2020/12/134

DNA：主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。

RNA：主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。

細(xì)胞內(nèi)的核酸具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，均與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。

分子的總長度在不同生物間差異很大，一般隨生物的進(jìn)化程度而增長。

DNA與RNA性質(zhì)上的差異決定了兩者的最適分離與純化的條件是不同的。2020/12/135一、材料與方法的選擇

核酸存在于各種生物中。臨床常見的樣品有血液、尿液、唾液、頭發(fā)、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等。核酸分離與純化的方法非常多。如何選擇合適的分離與純化方法是一個(gè)首要的問題。因?yàn)椴煌难芯磕康膶?duì)核酸的完整性、產(chǎn)量、純度和濃度有不同的要求。近年來，試劑盒(Kit)的開發(fā)與自動(dòng)化儀器的使用大大提高了分離與純化的效率。2020/12/136根據(jù)具體生物材料的性質(zhì)與起始量、待分離核酸的性質(zhì)與用途而采取不同的方案。無論采取何種方法，都應(yīng)遵循總的原則：

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，

盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度。

選擇原則

2020/12/137核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解(pH4-10)

③減少物理因素對(duì)核酸的降解,如機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。2020/12/138核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化二技術(shù)路線的設(shè)計(jì)

2020/12/139破碎細(xì)胞微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。細(xì)胞器DNA，首先純化細(xì)胞器。以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑(一)核酸的釋放

正常情況下，無論是DNA還是RNA均位于細(xì)胞內(nèi)，因此核酸分離與純化的第一步就是破碎細(xì)胞、釋放核酸。2020/12/1310DNA酶抑制劑：金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如：EDTA陰離子表面活性劑：如SDS。該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。RNA酶抑制劑：皂土：帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC(焦碳酸二乙酯)：通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2020/12/1311(二)核酸的分離與純化

利用核酸與其它物質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)上的差異設(shè)計(jì)有效方案，才能使核酸得以分離。核酸與其它物質(zhì)的差異包括細(xì)胞定位與組織分布上的差異、物理化學(xué)性質(zhì)上的不同以及各自獨(dú)特的生物學(xué)特性。2020/12/13121.

DNA分離純化過程

破碎細(xì)胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、蛋白酶K)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細(xì)胞碎片上清液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥2020/12/1313EDTA：破壞細(xì)胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活；SDS：可破壞細(xì)胞膜、抑制核酸酶，還可使核酸從蛋白質(zhì)上游離下來；蛋白酶K：非特異性蛋白酶，可將蛋白質(zhì)消化成氨基酸；65℃：高溫下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；冰?。航档蜏囟仁沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀；2020/12/1314水飽和苯酚：由于蛋白與DNA連結(jié)鍵已斷裂，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白質(zhì)變性，并抑制了DNase的降解作用。氯仿：氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，還能去除植物色素和蔗糖。異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相、下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。無水乙醇沉淀DNA：與核酸不發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)；對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易揮發(fā)除去。2020/12/13152.

RNA分離純化----Trizol一步法TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。注意：Trizol是強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，小心存放于4℃2020/12/1316

所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。

DEPC：焦碳酸二乙酯，是一種強(qiáng)烈但并不徹底的RNA酶抑制劑，通過和RNA酶中His結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶活性。2020/12/1317利用乙醇的易揮發(fā)性洗掉異丙醇,氯仿；溶解一些沉淀中可能的有機(jī)物雜質(zhì)會(huì)極大降低RNA的可溶性

2020/12/1318

(三)核酸的濃縮隨著核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會(huì)遂漸下降，當(dāng)不能滿足后繼研究與應(yīng)用的需要時(shí)，應(yīng)對(duì)核酸進(jìn)行濃縮。沉淀是核酸濃縮最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：核酸沉淀后,可以很容易地改變?nèi)芙饩彌_液和調(diào)整核酸溶液至所需濃度；另外，核酸沉淀還能去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子，有一定的純化作用。

2020/12/1319三鑒定與保存

(一)核酸的鑒定分離純化后的核酸質(zhì)量如何，是否達(dá)到后繼實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用的要求，可以通過相關(guān)的方法來鑒定其濃度、純度及完整性。2020/12/13201．濃度鑒定(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的堿基均具有一定的紫外線吸收特性，其最大吸收波長在250~270nm之間。在波長260nm紫外光下，1OD值得吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA和RNA為40μg/ml；寡核苷酸為35μg/ml。OD值范圍應(yīng)該在0.1~0.99之間，否則不符合上述線性關(guān)系。2020/12/1321

(2)熒光光度法核酸的熒光染料溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)嵌入堿基平面后，使本身無熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出橙紅色的熒光，且熒光強(qiáng)度積分與核酸含量呈正比。該法靈敏度可達(dá)1-5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBRGold作為一種新的超靈敏熒光染料，可以從瓊脂糖凝膠中檢出低于20pg的雙鏈DNA。2020/12/1322(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260／A280比值為1.8，純RNA的A260／A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。2．純度鑒定2020/12/1323(2)熒光光度法：用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子比RNA大許多，電泳遷移率低。通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果，可以鑒定DNA制品中有無RNA的干擾，亦可鑒定在RNA制品中有無DNA的污染。2020/12/1324凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果可用于判定核酸的完整性?；蚪MDNA的分子量很大，在電場中泳動(dòng)很慢，如果有降解的小分子DNA片段，電泳圖呈拖尾狀。完整總RNA除特征性的三條帶外，一般28sRNA的熒光強(qiáng)度約為18sRNA的2倍，否則提示有RNA降解。若在加樣槽附近有條帶，說明有DNA污染。

3．完整性鑒定2020/12/1325(二)核酸的保存DNA溶于TE緩沖液中在-70oC可以儲(chǔ)存數(shù)年。當(dāng)TE的pH值