靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在鬼傘中的表達(dá)劉志明李昭萍馮燕芬摘要：從現(xiàn)有載體CA_ACB_GFP出發(fā)，構(gòu)建出LZ－8灰蓋鬼傘表達(dá)載體，并利用PEG法將目的基因轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘受體細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。最后提取轉(zhuǎn)化子的基因組，進行PCR初步鑒定，得到若干個可能含有目的基因的灰蓋鬼傘轉(zhuǎn)化子。關(guān)鍵詞：灰蓋鬼傘靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白真核表達(dá)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白是靈芝來源的一類具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白的統(tǒng)稱。1989年日本學(xué)者Kino等人從赤芝（Ganodermalucidum）菌絲體中分離到一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，命名為LZ8蛋白。Kino等人的研究還指出，該蛋白在體外具有凝集活性和促有絲分裂原活性，但并非植物凝集素；在體內(nèi)主要表現(xiàn)為免疫抑制作用，能抑制系統(tǒng)性過敏反應(yīng)和Arthus反應(yīng)，以及能阻止糖尿病小鼠（NOD小鼠）胰腺炎的發(fā)生。MiyasakaN等人的研究發(fā)現(xiàn)，LZ8能通過調(diào)節(jié)粘附分子而促進細(xì)胞間相互作用。TanakaS等人的研究表明：LZ8的氨基酸序列及預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)均與免疫球蛋白分子重鏈的可變區(qū)有很多相似性而表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用，具有潛在的臨床價值。本研究的目的是構(gòu)建出LZ－8灰蓋鬼傘表達(dá)載體，以獲得高效表達(dá)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的真核工程菌株。為以后該蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用打下基礎(chǔ)。1實驗材料與儀器1.1材料載體CA_ACB_GFP、TEasyLZ8、灰蓋鬼傘菌種均由實驗室提供1.2主要試劑Taq酶、dNTP，購自上海申能博彩生物科技；SalⅠ、NcoⅠ，均購自北京賽百盛基因技術(shù)；BsrGⅠ,購自紐英倫生物技術(shù)T4DNA連接酶購自Promega公司；DNAmarkerⅢ，購自北京天為時代科技；3SSpinAgaroseGelDNAPurificationKit購自申能博彩生物科技；1.3儀器設(shè)備恒溫金屬浴CHB100，杭州博日科技；微量離心機，Eppendorf5417C；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；基因擴增儀，ThermoElectronCorporation；低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；FM70制冰機，上海格蘭特公司。2方法2.1構(gòu)建LZ－8灰蓋鬼傘表達(dá)載體2.1.1具體方法1.用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BsrGⅠ對載體CA_ACB_GFP進行雙酶切，去除GFP（綠色熒光蛋白）基因片斷，回收大片鍛。酶解反應(yīng)體系如下：10×reactionbufferB5.0μLBsrGⅠ（10u/μL）2.2μLNcoⅠ（10u/μL）1.8μLddH2O31.0μLplasmid10.0μLtotalvolume50.0μL各試劑混勻后，置于37℃水浴中，酶解11hr，以1％凝膠電泳分離酶解產(chǎn)物，采用3SSpinAgaroseGelDNAPurificationKit回收從瓊脂糖凝膠中割取目的大片段，操作步驟按說明書進行。2.以質(zhì)粒TEasyLZ8為模板，利用上下游引物P1：GAAGCTTATGTCCGACACTGCCTTG，P2：GCTGCAGGCAGATAGAACAAG，擴增LZ－8基因片斷。PCR反應(yīng)體系：10Buffer50μL25mMMgCl23.2μLddH2O28.4μLdNTP1.0μLP14.0μLP24.0μLTemplate4.0μLTaqE0.4μLtotalvolume50μLPCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸1min，34個循環(huán)周期；最后3.將上步得到的PCR產(chǎn)物與TEasy載體進行連接。獲得質(zhì)粒TEasy－LZ－8－PCR。反應(yīng)體系如下：10×ligationbuffer1.0μLTEasy載體1.5μLPCR產(chǎn)物5.7μLATP1.5μLT4DNALigase0.3μLtotalvolume10.0μL3min采用變溫連接，連接反應(yīng)參數(shù)：3min10℃3min16℃5min18℃2min，20個循環(huán)周期；最后654.用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NcoⅠ對上步的質(zhì)粒TEasy－LZ－8－PCR進行酶切，回收LZ8小片段。反應(yīng)體系：10×reactionbufferB2.5μLSalⅠ（10u/μL）1.0μLNcoⅠ（10u/μL）1.0μLddH2O15.5μLplasmid5.0μLtotalvolume25.0μL酶切反應(yīng)體系的各試劑混勻后，置于37℃水浴中，酶解8hr，以1％凝膠電泳分離酶解產(chǎn)物，采用3SSpinAgaroseGelDNAPurificationKit回收從瓊脂糖凝膠中割取目的小片段，操作步驟按說明書進行。5.合成接頭。因為上步的LZ8小片段沒有BsrGⅠ的酶切粘性末端，所以無法與第一步得到的大片鍛進行環(huán)化連接。因此要合成包含BsrGⅠ酶切位點的接頭，與小片段連接，使LZ8小片段帶有BsrGⅠ酶切位點的粘性末端。接頭序列如下：Adaptor(1)5’GCATCGACCTGCAGACTAGT-3’Adaptor(2)3’GGACGTCTGATCACATGGAT兩條Oligo核苷酸退火后就成為接頭，接頭還含有SalⅠ，PstⅠ，SpeⅠ的酶切位點。6.LZ8小片段與接頭連接。反應(yīng)體系：10×ligationbuffer1.0μLLZ8小片段7.0μL接頭（1.32μg/μL）0.5μLATP1.0μLT4DNALigase0.5μLtotalvolume10.0μL3min采用變溫連接，連接反應(yīng)參數(shù)：3min10℃3min16℃5min18℃2min，20個循環(huán)周期；最后657.將步驟一回收得到的大片段與步驟六的連接物環(huán)化連接。得到含有LZ8基因的重組質(zhì)粒CA_ACB_LZ8。反應(yīng)體系：10×ligationbuffer1.0μL大片段1.2μL連接物6.5μLATP1.0μLT4DNALigase0.3μLtotalvolume10.0μL3min采用變溫連接，連接反應(yīng)參數(shù)：3min10℃3min16℃5min18℃2min，20個循環(huán)周期；最后658.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，進行鑒定。2.1.2LZ－8灰蓋鬼傘表達(dá)載體構(gòu)建流程灰蓋鬼傘表達(dá)載體構(gòu)建流程如圖1。2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法用PEG轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒Plcc和LZ8轉(zhuǎn)入灰蓋鬼傘的原生質(zhì)體中。1.加入50μL灰蓋鬼傘原生質(zhì)體（已制備），1.0μLpLcc，1.0μL質(zhì)粒CA_ACB_LZ8和12.5μLPEGbuffer。輕輕混勻。2.將上述混合物冰浴20min。3.加入0.5mLPEGbuffer，室溫，放置5min。4.加入1.0mLSTCbuffer，輕輕混勻。5.將該混合物涂布于再生培養(yǎng)基上，376.5天后將在再生培養(yǎng)基上長出的單菌落接種到min培養(yǎng)基上。2.3轉(zhuǎn)化子鑒定方法2.3.1灰蓋鬼傘基因組DNA的提取1.在培養(yǎng)皿中加入約5mL蒸餾水，收集min培養(yǎng)基的菌絲，12000rpm離心，5min。2.去掉上清液，向菌體加入300μLFDEB，振蕩混勻。3.4.12000rpm離心，5min，收集上清液。5.向上清液加入等體積酚氯仿（酚氯仿體積比1：1）溫和混勻，4℃，6.向上清液加入等體積異丙醇溫和混勻，4℃，7.冰浴30min，12000rpm離心，5min，得到少量白色沉淀，棄去上清液。8.用70％乙醇洗沉淀2次，吹干。9.加入30μLddH2O，0℃Adaptor(1)5’GCATCGACCTGCAGACTAGT-3’Adaptor(Adaptor(1)5’GCATCGACCTGCAGACTAGT-3Adaptor(2)3’GGACGTCTGATCACATGGATNcoI+BsrGIPCRCZ_ACB_GFP4040bpNcoI+SalICZ_ACB_GFP4040bpNcoI+SalI加接頭 加接頭 圖1灰蓋鬼傘表達(dá)載體構(gòu)建流程10.灰蓋鬼傘基因組DNA提取完畢后，進行瓊脂糖（1.0％）凝膠電泳，觀測DNA提取效果。2.3.2對轉(zhuǎn)化子提取的基因組DNA進行PCR擴增，鑒定LZ8基因的轉(zhuǎn)化結(jié)果。反應(yīng)體系：10×ReactionBuffer5.0μLMgCl2(25mM)3.2μLSterileddH2O27.4μLdNTPs(10mM)1.0μPrimer1(PMLZ-8F1,2.5M)4.0μLPrimer2(PMLZ8R1,2.5M)4.0μLTaqDNApolymerase(5U/μL)0.4μLTemplate5.0μLtotalvolume50.0μLPCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸1min，35個循環(huán)周期；最后PCR完畢，進行瓊脂糖（1.0％）凝膠電泳。3結(jié)果與分析LZ8基因的片斷大小為336bp，從圖2中可看到有16個樣品能跑出這個大小的帶，它們是：6、10、11、12、13、14、15、19、22、23、24、25、28、29、32。因此通過載體構(gòu)建和PEG轉(zhuǎn)化法，用PCR初步鑒定出16個轉(zhuǎn)化子。400bp400bp400bp400bpCK：空白對照圖2灰蓋鬼傘基因組PCR產(chǎn)物4討論到目前為止，只能得到若干個可能的轉(zhuǎn)化子，要進一步判斷轉(zhuǎn)化子里面是否真的含有目的基因，還要進行Southern雜交進行鑒定。鑒定后的轉(zhuǎn)化子還要進行以下工作：1.靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的分離純化。通過離子交換層析，葡聚糖凝膠層析等方法獲得高純度酵母菌表達(dá)的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白。2.靈芝免疫調(diào)節(jié)活力檢測。參照Kino等的方法進行蛋白免疫調(diào)節(jié)活性分析。3.篩選高產(chǎn)菌株。挑選不同轉(zhuǎn)化子，進行發(fā)酵培養(yǎng)和目的蛋白的分離，通過比較獲得靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白高產(chǎn)菌株。Kino